基于31P-NMR的延邊州東部兩市蘋果梨園土壤磷化合物變化

秦 博， 黃金風(fēng)， 徐同良， 謝修鴻， 梁運江

(1. 延邊大學(xué) 農(nóng)學(xué)院， 吉林 延吉 133002； 2. 長春大學(xué) 園林學(xué)院， 長春 130022)

基于31P-NMR的延邊州東部兩市蘋果梨園土壤磷化合物變化

秦 博1， 黃金風(fēng)1， 徐同良1， 謝修鴻2， 梁運江1

(1. 延邊大學(xué) 農(nóng)學(xué)院， 吉林 延吉 133002； 2. 長春大學(xué) 園林學(xué)院， 長春 130022)

針對延邊州東部和龍市和琿春市蘋果梨園土壤，分別選取剖面點并進(jìn)行挖掘，根據(jù)土壤物理狀態(tài)劃分土壤自然發(fā)生層，分層采集土壤樣品，采用31P-NMR核磁共振波譜法對果園不同土層土壤磷化合物變化趨勢進(jìn)行研究。結(jié)果顯示：和龍、琿春兩市蘋果梨園土壤磷化合物組成均含有正磷酸鹽、正酸磷單酯和焦磷酸鹽，且正磷酸鹽>正酸磷單酯>焦磷酸鹽；與琿春蘋果梨園相比，和龍?zhí)O果梨園的A層和AB層土壤含有磷酸二酯。隨著土層深度增加，正磷酸鹽所占磷化和物的比例總體呈升高趨勢，兩地最深層土壤的正磷酸鹽比例均高達(dá)80%以上； 與正磷酸鹽相反，隨著土層深度增加磷酸單酯所占磷化合物的比例呈減小的趨勢。兩地蘋果梨園土壤磷化合物中，焦磷酸鹽所占比例最大的土層均為AB層。磷酸單酯在和龍?zhí)O果梨園土壤中的豐富度明顯高于琿春蘋果梨園土壤。

蘋果梨園； 磷化合物；31P核磁共振(31P-NMR)波譜法

0 引 言

延邊州地處北緯41°59′～44°30′的東北亞金三角地帶，不僅有東北地區(qū)冷涼的天氣特征，又因臨近日本海而具有海洋性濕潤氣候的特點，形成了當(dāng)?shù)鬲毺氐牡蜏厍医坪Ｑ笮缘拇箨懠撅L(fēng)氣候，主要表現(xiàn)為季風(fēng)明顯，春季干燥多風(fēng)，夏季溫?zé)岫嘤?，秋季涼爽少雨，冬季寒冷期長。由于獨特的氣候條件，形成了典型暗棕壤。全州星羅棋布大量蘋果梨園，是亞洲最大的蘋果梨生產(chǎn)基地。

磷是植果樹生長發(fā)育必須的大量元素，不僅影響果樹的產(chǎn)量也直接影響著果實的品質(zhì)，對果樹來說具有不可替代的作用。對于果樹而言，在其進(jìn)行機(jī)體重要生理過程光合作用的碳同化與光和磷酸化過程中，均有磷元素的直接參與，所以缺少磷元素勢必會導(dǎo)致果樹的光合作用不能進(jìn)行[1]。土壤磷素缺乏會導(dǎo)致作物減產(chǎn)，而過量的累積又會增加土壤磷素流失的風(fēng)險[2-3]。磷在土壤中的存在形態(tài)和化學(xué)行為會直接影響其對果樹的有效性而一直受到人們的廣泛關(guān)注[4-6]。在自然界中磷的形態(tài)多種多樣，按照其成鍵類型可分為正磷酸鹽、磷酸單酯、磷酸二酯、焦磷酸鹽、膦酸鹽、多聚磷酸等磷化合物。20世紀(jì)80年代，Newman等[7]首次利用31P-NMR技術(shù)分析了土壤提取物中不同形態(tài)磷化合物的分布情況，自此31P-NMR技術(shù)被廣泛研究和利用。作為自然界中唯一豐度為100%的磷同位素,31P是一種可用核磁共振技術(shù)分析含磷化合物結(jié)構(gòu)的理想原子核。在實際的研究中,由于存在于不同官能團(tuán)的原子核會因屏蔽效應(yīng)不同而出現(xiàn)不同的化學(xué)位移值,因此通過分析31P-NMR波譜圖上的化學(xué)位移值可以鑒別具有不同空間結(jié)構(gòu)的有機(jī)或無機(jī)磷化合物[8]。相比其他方法而言，31P-NMR檢測法具有高速、準(zhǔn)確、分辨率高、無干擾等優(yōu)勢[9]，其在磷化合物鑒定方面的優(yōu)勢傳統(tǒng)化學(xué)方法不可比擬，它能從復(fù)雜的土壤提取液中清楚地鑒定出不同形態(tài)的磷[10]。我國對土壤磷化合物的研究不多，對果園土壤磷化合物的分析研究更是沒有涉及，因此，本文以延邊州兩市蘋果梨園土壤為試材，采用核磁共技術(shù)鑒定磷化合物，研究果園磷化合物的變化趨勢有助于彌補我國果園磷化合物研究的不足，為我國果園尤其是我國北方果園磷循環(huán)研究提供理論支持。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

供試土壤取自吉林省延邊州東部和龍市及琿春市蘋果梨園內(nèi)，土壤類型為暗棕壤。隨機(jī)選取蘋果梨園中長勢良好且健康的蘋果梨樹，避開果園施肥帶，在距離樹干1 m處設(shè)置剖面點，同時在蘋果梨園區(qū)未種植蘋果梨樹的荒地或者農(nóng)田設(shè)置為對照剖面點。深挖1 m，根據(jù)土壤的顏色、質(zhì)地、結(jié)構(gòu)、松緊度、干濕度、根系分布等特征，分出土壤的發(fā)生層次，依次為A層、AB層、B層、BC層。

1.2 測定方法

土壤樣品預(yù)處理方法為:稱取4 g土樣，加入40 mL 0.25 mol/L NaOH和0.05 mol/L Na2EDTA混合液[11]，在20 ℃條件下振蕩16 h(振蕩頻率200 r/min)，在10 000 r/min冷凍離心機(jī)下離心30 min(4 ℃)。上清液按20∶1加入0.11 mol/L NaHCO3+ 0.11 mol/L Na2S2O4液(BD溶液)水平振蕩10min后冷凍干燥至粉末狀，冷藏待用。

上機(jī)前稱取土壤浸提液凍干樣品300 mg，加入1.5 mL 0.25 mol/L NaOH重新溶解，在冷凍離心機(jī)上離心，條件設(shè)定為4 ℃, 8 000 g, 5 min，取0.6 mL的上清液轉(zhuǎn)移到5 mm的NMR管中,然后向NMR管中加入0.05 mL D2O，搖勻待測。采用31P-NMR核磁共振波譜法，利用儀器BRUKER AVANCE III HD進(jìn)行測定。采用 BRUKER 標(biāo)準(zhǔn)腔5 mm 的 BBO 探頭，31P譜的脈沖P1=13.90 μs，脈沖功率PL1=40 W，31P的共振頻率為202.47 Hz，循環(huán)延遲dl=2 s，掃描 20 000次左右，測定溫度為 296.2 K 。所有31P化學(xué)位移均參照85%的正磷酸。

1.3 數(shù)據(jù)分析

根據(jù)各類磷化合物在31P核磁共振圖譜上的位移顯示：正磷酸鹽化學(xué)位移在(6～8)×10-6；磷酸單酯化學(xué)位移在(3～6)×10-6；磷酸二酯化學(xué)位移(-1～2.5))×10-6；焦磷酸鹽化學(xué)位移在(-5～-2.5)×10-6[7、12-13]；單核苷酸化學(xué)位移在(4.78-4.32)×10-6；磷酸膽堿化學(xué)位移4.05×10-6；鯊肌醇六磷酸化學(xué)位移在4.14×10-6；肌醇六磷酸脂化學(xué)位移在(5.85～4.92)×10-6和(4.55～4.43)×10-6[14-16]等。使用MestReNova軟件進(jìn)行分析處理，確定磷化合物。

數(shù)據(jù)采用SPSS軟件和Excel軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 延邊琿春蘋果梨園磷化物分析

由圖1可見，琿春果園磷化合物由正磷酸鹽、酸磷單酯和焦磷酸鹽組成。由圖2可見，琿春果園土壤中磷化合物比例為正磷酸鹽>酸磷單酯>焦磷酸鹽。正磷酸鹽和磷酸單酯作為磷化合物的主要組成因素，兩者之和超過了磷化合物總量的85%。

圖2顯示，正磷酸鹽的相對百分含量隨著土壤層次的加深而增加，試驗材料中最深層的琿春果園B層土壤，正磷酸鹽所占磷化合物比例達(dá)到了近90%；與正磷酸鹽相反，磷酸單酯所占比重的趨勢卻是隨著土壤層次的加深而減少。核磁圖譜中同一類磷化合物的峰的個數(shù)與該化合物的豐富度呈正相關(guān)。圖1中果園31P核磁共振圖譜顯示，琿春果園A層土壤磷酸單酯類化合物出峰個數(shù)為8個，而AB層和B層分別為5個和4個，隨著土層加深，磷酸單酯不僅所占百分比降低，其豐富度也下降。對比圖1中果園附近的荒地土壤，挖掘與果園土壤同樣深度僅出現(xiàn)到AB層。磷酸二酯在果園土壤中未測出，但在琿春荒地土壤的A層土壤中被檢測到，占磷化合物總量的2.12%?，q春蘋果梨園內(nèi)，A層土壤中主要磷化合物為有機(jī)磷酸單酯，而其他層次則以正磷酸鹽為主(見圖2)。

2.2 延邊和龍?zhí)O果梨園磷化物分析

從圖3可看出，和龍土壤檢測出正磷酸鹽、酸磷單酯、正磷酸二酯和焦磷酸鹽4種磷化合物，且這四類磷化合物在土壤中含量如圖4所示，為：正磷酸鹽>酸磷單酯>焦磷酸鹽>正磷酸二酯(見圖4)。

結(jié)合圖4中的和龍果園和荒地土壤可以看出：果園A至B層土壤正磷酸鹽所占比例明顯高于荒地相同土層土壤。和龍農(nóng)田BC層土壤的正磷酸鹽所占比例極高，達(dá)到97.82%。無論是果園土壤或是農(nóng)田土壤，磷酸單酯所占磷化合物的比例的總體趨勢都是隨著土壤層次的加深而減小。果園A至B層磷酸單酯所占比例高于農(nóng)田的A至B層。圖3中果園31P核磁共振圖譜顯示，和龍果園A層土壤磷酸單酯類化合物出峰個數(shù)為14個，AB層為11個，B層和BC層土壤均為7個。可見磷酸單酯的豐富度隨著土壤層次的加深而呈現(xiàn)降低趨勢。磷酸二酯是這四類磷化合物中唯一沒有分布在所有層次中的磷化合物，從圖4中看出，磷酸二酯只分布于果園AB及以上土層和農(nóng)田B層及以上土層中，隨著土壤深度增加而減少。作為和龍果園四類磷化合物中含量最少的化合物，即使在所占比例最大的農(nóng)田土A層也只有3.2%。焦磷酸鹽雖然在磷化合物中所占比例相對較少，但是無論果園土壤還是農(nóng)田土，每個層次均有焦磷酸鹽存在。焦磷酸鹽所占磷化合物的比例的總體趨勢是隨著土壤層次的加深先增加后減少。

圖3 和龍果園與荒地31P核磁共振圖譜

2.3 琿春蘋果梨園與和龍?zhí)O果梨園磷化合物比例異同點分析

和龍?zhí)O果梨園與琿春蘋果梨園的土壤中，均含有正磷酸鹽、酸磷單酯和焦磷酸鹽3種磷化合物，且3種磷化合物所占比例均為正磷酸鹽>酸磷單酯>焦磷酸鹽；兩地土壤中磷酸單酯的比例都是隨著土壤層次的加深而減少，且磷酸單酯的豐富度也在隨著土層的加深而降低；兩地土壤中焦磷酸鹽所占比重最大的層次都是AB層土壤。

和龍?zhí)O果梨園土壤中磷化合物的豐富度高于琿春蘋果梨園土壤，與琿春蘋果梨園土壤相比，和龍?zhí)O果梨園土壤含有磷酸二酯，且存在于A和AB兩個層次內(nèi)。磷酸單酯是兩地蘋果梨園土壤中出峰較多的化合物，但是和龍果園土壤的磷酸單酯出峰個數(shù)明顯高于琿春蘋果梨園土壤，在AB層甚至高出2倍以上。

3 結(jié) 語

延邊州東部兩市和龍市和琿春市的蘋果梨園土壤中均含有正磷酸鹽、酸磷單酯和焦磷酸鹽3種磷化合物，且3種磷化合物所占比例均為正磷酸鹽>酸磷單酯>焦磷酸鹽；不同的是地處北部的琿春市蘋果梨園中未含有磷酸二酯，而南部的和龍市蘋果梨園土壤的A層和AB層均含有磷酸二酯。磷酸單酯在和龍?zhí)O果梨園土壤中的豐富度明顯高于琿春蘋果梨園土壤，其中AB層更是高出2倍以上。

總體趨勢來看，兩地正磷酸鹽的比例都是隨著土壤層次的加深而升高，但是磷酸單酯的比例及其豐富度卻隨著土壤層次的加深呈現(xiàn)降低的趨勢；兩地土壤中焦磷酸鹽所占比重最大的層次都是AB層土壤。

果樹對磷肥的吸收主要是無極正磷酸鹽類，對于琿春果園表層土無機(jī)正磷酸鹽比例偏低的情況來看，建議其適當(dāng)追加無機(jī)磷肥，或者調(diào)整施肥比例。

[1] 霍啟光.動物磷營養(yǎng)與磷源[M].北京:中國農(nóng)業(yè)科學(xué)技術(shù)出版社,2002.

[2] Dougherty W, Fleming N K, Cox J W,etal. Phosphorus transfer in surface runoff from intensive pasture systems at various scales: a review[J].Journal of Environmental Quality,2004,33:1973-1988.

[3] Xavier F A S, Oliveira T S, Andrade F V,etal. Phosphorus fractionation in a sandy soil under organic agriculture in Northeastern Brazil[J]. Geoderma,2009,151(3):417-423.

[4] 孫桂芳,金繼運,石元亮.土壤磷素形態(tài)及其生物有效性研究進(jìn)展[J].中國土壤與肥料, 2011(2):1-9.

[5] Liang Yunjiang, Fu Minjie, Liu Huan,etal. Effects of freezing and thawing on soil phosphorus of protective farmland[J]. ICEEP, 2013(4):19-21.

[6] 王非非，梁運江，謝修鴻，等.琿春蘋果梨園不同土壤剖面有機(jī)磷分布特征[J].北方園藝，2016(6)：156-159.

[7] Newman R H, Tate K R. Soil phosphorus characterization by31P nuclear magnetic resonance[J]. Communications in Soil Science and Plant Analysis,1980(11)：835-842.

[8] Cade-Menum B J. Characterizing phosphorus in environmental and agricultural samples by31P nuclear magnetic resonance spectroscopy[J]. Talanta， 2005,66(2):359-371.

[9] Turnrr B L. Optimizing phosphorus characterization in animal manures by solution phosphorus-31 nuclear magnetic resonance spectroscopy[J]. Journal of Environmental Quality, 2004,33(2):757-766.

[10] Tumer B L. Haygarth P M. Phosphatase activity in temperate pasture soils: Potential regulation of labile organic phosphorus turnover by phosphodiesterase activity[J]. Science of the Total Environment, 2005, 344(1-3):27-36.

[11] Cademenun B, Liu C W. Solution phosphorus-31 nuclear magnetic resonance spectroscopy of soils from 2005 to 2013: A review of sample preparation and experimental parameters[J]. Soil Science Society of America Journal,2013,78:19-37.

[12] Hawkes G E, Powlson D S，Randall E W，etal. A31P nuclear magnetic resonance study of the phosphorus species in alkali extracts of soils from long-term field experiments[J]. European Journal of Soil Science, 1984,35(1):35-45.

[13] Cademenun B，Preston C M. A comparison of soil extraction procedures for 31P NMR spectroscopy[J]. Soil Science, 1996,161(11):770-785.

[14] Turner B L，Mahieu N，Condron L M．Phosphorus-31 nuclear magnetic resonance spectral assignments of phosphorus compounds in soil NaOH-EDTA extracts[J]．Soil Science Society of America Journal， 2003，67(2): 497-510.

[15] Lookman R，Grobet P，Merckx R，etal. Application of31P and27Al MAS NMR for phosphate speciation studies in soil and aluminium hydroxides: Promises and constraints[J]. Geoderma, 1997，80(3-4):369-388.

[16] Turner B L，Richardson A E. Identification of scyllo-inositol phosphates in soil by solution phosphorus-31 nuclear magnetic resonance spectroscopy[J]. Soil Science Society of America Journal，2004， 68(3): 802-808.

·名人名言·

科技是國家強盛之基，創(chuàng)新是民族進(jìn)步之魂。自古以來，科學(xué)技術(shù)就以一種不可逆轉(zhuǎn)、不可抗拒的力量推動著人類社會向前發(fā)展。十六世紀(jì)以來，世界發(fā)生了多次科技革命，每一次都深刻影響了世界力量格局。從某種意義上說，科技實力決定著世界政治經(jīng)濟(jì)力量對比的變化，也決定著各國各民族的前途命運。

——摘自習(xí)近平《在中國科學(xué)院第十七次院士大會、中國工程院第十二次院士大會上的講話》(2014)

Change of Soil Phosphorus Compound of Apple-pear Orchards in the East of Two Cities in Korean Autonomous Prefecture of Yanbian

QINBo1,HUANGJinfeng1,XUTongliang1,XIEXiuhong2,LIANGYunjiang1

(1. College of Agriculture, Yanbian University, Yanji 133002, Jiling, China； 2. College of Landscape Architecture，Changchun University， Changchun 130022, China)

Aiming at soil in apple-pear orchard of Hunchun city and Helong city in the east of Korean Autonomous Prefecture of Yanbian of Jilin Province, the authors mined soil profile in apple-pear orchard, collected soil samples from different soil genetic horizon according to soil properties. We studied the change trend of phosphorus compound in different horizons of orchard soil by31P nuclear magnetic resonance spectroscopy (NMR). The results indicated that phosphorus compounds of orchard soil of Hunchun and Helong were composed of orthophosphate, orthophosphate monoester and pyrophosphate (orthophosphate>orthophosphate monoester >pyrophosphate). Compared with apple-pear orchard of Hunchun, the horizons of A and AB contained orthophosphate diester. With increasing of depth of soil horizon, the percentage of orthophosphate of phosphorus compound was increased as well. The percentage of orthophosphate was more than 80% in the deepest soil of the two orchards. In contrast with orthophosphate，by the increase on depth of soil horizon, the percentage of orthophosphate monoester to phosphorus compound reduced. The soil horizon with the most percentage of pyrophosphate was AB horizon in soil of the two apple-pear orchards in Hunchun and Helong. The abundance of orthophosphate monoester in soil of apple-pear orchard of Helong was significantly higher than that in Hunchun.

apple-pear orchard； phosphorus compounds；31P nuclear magnetic resonance(31P-NMR); spectroscopy

2016-09-19

國家自然科學(xué)基金項目(31460117)；延邊大學(xué)2016年創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓(xùn)練計劃項目(ydbksky2016114)

秦 博(1992-)，男，吉林白山人，碩士生，主要研究方向為土壤與植物營養(yǎng)研究。

Tel.:18243085665；E-mail:675914667@qq.com

梁運江(1972-)，男，吉林前郭人，博士，副教授，碩士生導(dǎo)師，主要研究方向為土壤與植物營養(yǎng)研究。

Tel.:13944709192；E-mail:lyjluo@ybu.edu.cn

S 153.6

A

1006-7167(2017)05-0017-04