防治紫花苜蓿真菌病害的生防菌篩選

胡進(jìn)玲，汪治剛，徐娜，黨淑鐘，李彥忠

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防治紫花苜蓿真菌病害的生防菌篩選

胡進(jìn)玲，汪治剛，徐娜，黨淑鐘，李彥忠*

(草地農(nóng)業(yè)生態(tài)系統(tǒng)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，蘭州大學(xué)草地農(nóng)業(yè)科技學(xué)院，甘肅 蘭州 730020)

本研究采用革蘭氏染色、顯微觀察和分子生物學(xué)方法鑒定了2種具有拮抗?jié)摿Φ奈⑸锏姆诸?lèi)地位，采用PDA培養(yǎng)基平板對(duì)峙法測(cè)定了其對(duì)苜蓿莖點(diǎn)霉(Phomamedicaginis)等9種常見(jiàn)的紫花苜蓿主要病原真菌的拮抗效果。研究結(jié)果表明這2種菌分別為解淀粉芽孢桿菌(Bacillusamyloliquefaciens)和卡那霉素鏈霉菌(Streptomyceskanamyceticus)。前者對(duì)供試病原菌的抑菌率為24.02%～71.11%，其中對(duì)苜蓿尾孢菌(71.11%)、苜蓿匍柄霉(64.76%)和粉紅鐮孢(60.55%)抑菌效果最強(qiáng)；后者對(duì)供試病原菌抑菌率為49.95%～76.90%，其中對(duì)三葉草刺盤(pán)孢(76.90%)、苜蓿莖點(diǎn)霉(70.94%)、苜蓿匍柄霉(68.01%)和苜蓿小光殼(60.99%)抑制效果較強(qiáng)。兩株菌對(duì)供試苜蓿9種病原真菌均表現(xiàn)出不同程度的拮抗作用，該研究結(jié)果為解淀粉芽孢桿菌和卡那霉素鏈霉菌作為紫花苜蓿多種病害的生物防治資源以及進(jìn)一步開(kāi)發(fā)利用提供了理論依據(jù)。

紫花苜蓿；病原真菌；拮抗；鑒定；解淀粉芽孢桿菌；卡那霉素鏈霉菌

苜蓿(Medicagosativa)是全世界最重要的多年生豆科牧草，無(wú)論其產(chǎn)量還是營(yíng)養(yǎng)價(jià)值均居牧草之首，被譽(yù)為“牧草之王”[1]。近幾年來(lái)，隨著我國(guó)草地畜牧業(yè)的發(fā)展和農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)結(jié)構(gòu)調(diào)整，苜蓿的種植面積進(jìn)一步擴(kuò)大，而病害問(wèn)題日益引起生產(chǎn)者的重視。據(jù)統(tǒng)計(jì)，每年全世界由于病害而造成的苜蓿減產(chǎn)達(dá)20%以上[2]，苜蓿病害可使牧草產(chǎn)量大幅度減少，牧草的營(yíng)養(yǎng)成分降低，適口性下降，嚴(yán)重影響苜蓿的產(chǎn)量和飼用價(jià)值。

苜蓿為多年生豆科植物，在大田中一次種植可多年利用[3]，因此根腐病成為危害苜蓿最嚴(yán)重的病害之一[4]。苜蓿根腐病可造成苜蓿產(chǎn)量下降和植株衰敗[5]，嚴(yán)重時(shí)死亡率可達(dá)60.08%～73.45%，是限制苜蓿生產(chǎn)的主要因素[6]。苜蓿根腐病是一種典型的土傳病害，病原種類(lèi)較多，其中來(lái)自種子、土壤和病殘?bào)w的鐮刀菌是重要的土傳病原真菌，其可在苗期從根部侵入，也可在成株期從根部或直接從傷口侵入，引起苜蓿根莖腐爛[7]。苜蓿病害是由病原真菌、細(xì)菌、病毒等多種病原物所引起的，受害最大的部位除了根部還有葉部，通常稱(chēng)為葉部病害[3]。其中，葉斑病是引起苜蓿產(chǎn)量下降，品質(zhì)變劣的重要限制因素[8]。常見(jiàn)的苜蓿葉斑病害有莖點(diǎn)霉葉斑病(Phomamedicaginis)，匍柄霉葉斑病(Stemphyliumbotryosum)、小光殼葉斑病(Leptosphaerulinabriosiana)等，其中，莖點(diǎn)霉葉斑病又稱(chēng)苜蓿春季黑莖病或輪紋病，是一種世界性毀滅性病害，2013年5月到9月對(duì)東北地區(qū)苜蓿種植區(qū)病害調(diào)查中發(fā)現(xiàn)此病的發(fā)病率可達(dá)40%以上，嚴(yán)重發(fā)生時(shí)，葉片提早脫落，產(chǎn)量下降，已成為苜蓿生產(chǎn)亟待解決的問(wèn)題[2]。據(jù)調(diào)查，苜蓿葉斑病病菌都可在苜蓿的根莖內(nèi)或是病原殘?bào)w上越冬，是主要的初侵染源，在田間主要靠氣流、風(fēng)和雨水傳播病害，可反復(fù)多次侵染，是造成病害大流行的主要原因[4]。綜上可知，苜蓿的根部和葉部病害僅靠單一的化學(xué)防治或栽培措施，難以達(dá)到期待的防治效果。

生物防治與化學(xué)防治相比具有不易使病原菌產(chǎn)生耐藥性、對(duì)人畜安全無(wú)毒、不污染環(huán)境、無(wú)殘留和具有對(duì)作物的促生作用等優(yōu)點(diǎn),越來(lái)越受到人們的重視[9]。生防菌劑在一些作物上也已得到了廣泛應(yīng)用，據(jù)報(bào)道哈茨木霉(Trichodermaharzianum)、綠色木霉(Trichodermaviride)分別對(duì)橡膠炭疽病菌(Colletotrichummusae)、西瓜枯萎病菌(Fusariumoxysporumf．sp．niveum)、水稻紋枯病菌(Rhizoctoniasolani)、紅麻灰霉病菌(Botrytiscinerea)具有較好的抑制效果[10]。惡臭假單胞桿菌(Pseudomonasputida)被用作防治棉花枯萎病(Fusariumoxysporumf.sp.vasinfectum)[11]，微生物拮抗劑被用來(lái)防治水果和蔬菜采摘后的病害[12]。采用生物防治控制牧草病害，雖然距商業(yè)化還有一定距離[13-14]，但也取得了一些進(jìn)展[15-16]。然而生防在苜蓿方面的研究、應(yīng)用甚少。因此，本試驗(yàn)使用從紫花苜蓿根組織中分離的2種微生物，以引起苜蓿根腐病、葉斑病、炭疽病等幾種主要病原菌為供試菌，篩選具有廣譜抑菌活性的拮抗菌株，通過(guò)形態(tài)學(xué)和16s rDNA基因序列分析等手段對(duì)菌株進(jìn)行分類(lèi)鑒定，以期為苜蓿生防菌資源的深入研究和開(kāi)發(fā)提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 培養(yǎng)基

營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基(NA)、馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基(PDA)[17]。試驗(yàn)時(shí)間：2016年1月9日至1月20日。

1.2 供試菌株

1.2.1 拮抗菌株及來(lái)源 待測(cè)拮抗菌為L(zhǎng)YZ0069和LYZ0133，分離自紫花苜蓿根部。

1.2.2 供試病原菌及來(lái)源 供試病原真菌為如下9種：苜蓿莖點(diǎn)霉、苜蓿小光殼、三葉草刺盤(pán)孢(Colletotrichumtrifolii)、苜蓿匍柄霉、苜蓿尾孢菌(Cercosporamedicaginis)、尖鐮孢(Fusariumoxysporium)、粉紅鐮孢(Fusariumroseum)、腐皮鐮刀菌(Fusariumsolani)和苜蓿殼針孢(Septoriamedicaginis)，均由本實(shí)驗(yàn)室從染病的紫花苜蓿植株上分離，經(jīng)形態(tài)學(xué)和分子生物學(xué)方法準(zhǔn)確鑒定到種，保存于本實(shí)驗(yàn)室。

1.3 拮抗菌的鑒定

1.3.1 培養(yǎng)特征鑒定 根據(jù)細(xì)菌形態(tài)特征鑒定方法對(duì)本研究的拮抗菌進(jìn)行鑒定[18]。仔細(xì)觀察生長(zhǎng)于牛肉膏蛋白胨平板上的細(xì)菌的菌落形態(tài)，劃單菌落鑒定其群體形態(tài)特征。

1.3.2 革蘭氏染色 將細(xì)菌在28 ℃下培養(yǎng)24～48 h之后進(jìn)行革蘭氏染色，挑取少量細(xì)菌于滴有蒸餾水的載玻片上混合，通過(guò)火焰3次固定。加上結(jié)晶紫后染色1 min，水洗；加上碘液后染色1 min，水洗。加上95%酒精，搖動(dòng)玻片，脫色20～60 s，水洗，吸取水分；加上蕃紅后，染色1 min，水洗。吸干或在空氣中晾干后，油鏡鏡檢。通過(guò)革蘭氏染色觀察其個(gè)體形態(tài)特征[17]。

1.3.3 芽孢染色 同樣，將細(xì)菌在28 ℃下培養(yǎng)24～48 h之后用于芽孢染色，首先固定細(xì)菌于載玻片上，加數(shù)滴5%孔雀綠染液于涂片上，在微火上加熱至燃料冒蒸汽并開(kāi)始計(jì)時(shí)，維持5 min，加熱過(guò)程中及時(shí)補(bǔ)充染液，切勿讓涂片干涸；待玻片冷卻后，用環(huán)流自來(lái)水沖洗載玻片，直至流出的水無(wú)色為止；用0.5%蕃紅染液復(fù)染1.5 min，用緩流水洗后干燥，油鏡鏡檢。通過(guò)芽孢染色觀察細(xì)菌產(chǎn)孢情況及芽孢形態(tài)特征[17]。

1.3.4 分子鑒定 細(xì)菌的全基因組使用OMEGA Bacterial DNA Kit試劑盒進(jìn)行提取。PCR擴(kuò)增采用細(xì)菌通物1429R:5′-GAGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′和27F:5′-CTACGGCTACCTTGTTACGA-3′，由上海生工生物公司合成。PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系為20 μL：基因組DNA 0.5 μL、ddH2O 8.5 μL、mix 10 μL、引物1429R 0.5 μL和27F 0.5 μL。PCR擴(kuò)增條件：95 ℃預(yù)變性3 min；95 ℃變性30 s，50 ℃退火30 s，72 ℃延伸60 s，循環(huán)30次；72 ℃再延伸10 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)后送上海生工生物公司測(cè)序。用NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中的BLAST軟件將測(cè)序得到的序列和GenBank中的核酸序列進(jìn)行比對(duì)分析，尋找與目的序列同源性高且通過(guò)正式發(fā)表的菌株用于系統(tǒng)發(fā)育分析，再用ClustaL X對(duì)其進(jìn)行多重比對(duì)，之后采用MEGA6軟件以鄰接法(neighbor-joining,NJ)構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)。設(shè)置1000次隨機(jī)抽樣，計(jì)算自引導(dǎo)值(bootstrap)，以評(píng)估系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)的置信度[19]。

1.4 拮抗效果測(cè)定

圖1 拮抗菌LYZ0069和LYZ0133形態(tài)特征Fig.1 Morphological characteristics of antagonistic microorganisms LYZ0069 and LYZ0133A：LYZ0069菌落形態(tài);B:LYZ0133菌落形態(tài)；C：LYZ0069革蘭氏染色；D：LYZ0069芽孢染色；E：LYZ0133革蘭氏染色。A：The colony morphologies of strain LYZ0069；B:The colony morphologies of LYZ0133;C:Strain LYZ0069 gram;D:Strain LYZ0069 spore staining;E:Strain LYZ0133 gram.

采用PDA平板對(duì)峙法測(cè)定細(xì)菌的抑菌作用[20]。在平板(90 mm)中央分別點(diǎn)病原真菌(直徑=5 mm)為指示菌，將待測(cè)拮抗菌株呈“+”字涂點(diǎn)于菌餅周?chē)?點(diǎn)，各點(diǎn)距離指示菌2 cm,以只接種病原菌的平板為對(duì)照，待對(duì)照菌落長(zhǎng)滿(mǎn)平板時(shí)，利用游標(biāo)卡尺測(cè)量抑菌圈和菌落的生長(zhǎng)直徑。按下式計(jì)算菌落的生長(zhǎng)抑制率：

2 結(jié)果與分析

2.1 形態(tài)學(xué)特征

形態(tài)學(xué)觀察結(jié)果顯示，菌株LYZ0069于28 ℃培養(yǎng)24 h，菌落在牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基上呈乳白色，中心隆起，邊緣整齊，菌落圓形或橢圓，濕潤(rùn)、半透明，培養(yǎng)72 h后菌落表面變得干燥，起皺，革蘭氏染色G+鏡檢呈桿狀，約1.95 μm，芽孢染色顯示產(chǎn)芽孢且芽孢呈橢圓到柱狀，位于菌體中央或稍偏。鑒定結(jié)果表示，菌株LYZ0069具有典型的芽孢桿菌的特征。菌株LYZ0133菌落小而致密、干而不透明，24 h時(shí)表面光滑、邊緣整齊、顏色單調(diào)、不易挑起，繼而發(fā)展成褶皺狀。菌落生長(zhǎng)緩慢，革蘭氏染色G+(圖1)。

2.2 分子生物學(xué)特征

經(jīng)測(cè)序，菌株LYZ0069和LYZ0133的16S rDNA序列長(zhǎng)度為1445和1420 bp，提交GenBank進(jìn)行比對(duì)，結(jié)果與LYZ0069同源性最高的為解淀粉芽孢桿菌(Bacillusamyloliquefaciens,登錄號(hào)為：JN700127.1和JN700124.1)，其同源性為100%；與LYZ0133同源性最高的為卡那霉素鏈霉菌(Streptomyceskanamyceticus,登錄號(hào)：NR_112397.1)。

根據(jù)構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)，我們發(fā)現(xiàn)拮抗菌LYZ0069與解淀粉芽孢桿菌(Bacillusamyloliquefaciens,登錄號(hào)為：JN700127.1、JN700124.1)聚為一簇；LYZ0133與卡那霉素鏈霉菌(Streptomyceskanamyceticus,登錄號(hào)：NR_112397.1)聚為一支，而且支持率都在99%以上。通過(guò)對(duì)拮抗菌LYZ0069和LYZ0133的16 srDNA基因全序列分析，與GenBank中收錄的細(xì)菌基因序列比對(duì)，結(jié)合形態(tài)學(xué)鑒定得到LYZ0069為解淀粉芽孢桿菌，LYZ0133為卡那霉素鏈霉菌(圖2)。

圖2 拮抗菌和相關(guān)菌株的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)Fig.2 Phylogenetic tree of antagonistic strains and its relatives

2.3 抑菌效果測(cè)定

抑菌試驗(yàn)結(jié)果表明，解淀粉芽孢桿菌對(duì)供試9種苜蓿病原真菌中的8種病原菌有拮抗作用，且對(duì)其中7種病原菌抑菌率顯著(>50%)，按其抑菌率由大到小排序?yàn)椋很俎Ｐ」鈿?(71.11%)>苜蓿匍柄霉(64.76%)>三葉草刺盤(pán)孢 (60.55%)>粉紅鐮孢 (58.90%)>腐皮鐮刀菌(57.71%)>尖鐮孢 (54.23%)>苜蓿莖點(diǎn)霉 (53.15%)>苜蓿尾孢菌 (24.02%)；卡那霉素鏈霉菌對(duì)其中7種病原真菌有拮抗作用，抑菌效果顯著的有6種，按其抑菌率由大到小順序?yàn)椋?三葉草刺盤(pán)孢 (76.90%)>苜蓿莖點(diǎn)霉(70.94%)>苜蓿匍柄霉(68.01%)>苜蓿小光殼(60.99%)>腐皮鐮刀菌(56.20%)>尖鐮孢 (56.11%)>粉紅鐮孢(49.95%)。另外，通過(guò)對(duì)兩種拮抗菌的拮抗作用比較，我們發(fā)現(xiàn)兩種拮抗菌對(duì)其中7種病原真菌同時(shí)表現(xiàn)出拮抗作用，但解淀粉芽孢桿菌對(duì)苜蓿小光殼、腐皮鐮刀菌和粉紅鐮孢的抑菌效果均強(qiáng)于卡那霉素鏈霉菌；卡那霉素鏈霉菌對(duì)苜蓿莖點(diǎn)霉、三葉草刺盤(pán)孢、苜蓿匍柄霉和尖鐮孢的抑制作用強(qiáng)于解淀粉芽孢桿菌(表1)。從其拮抗效果上可以看出兩種拮抗菌與病原真菌均未發(fā)生物理接觸而起作用，且解淀粉芽孢桿菌主要抑制其周?chē)募?xì)菌生長(zhǎng)，而卡那霉素鏈霉菌可以顯著抑制整個(gè)病原真菌的生長(zhǎng)繁殖(圖3)。

表1 解淀粉芽孢桿菌和卡那鏈霉菌對(duì)紫花苜蓿病原菌的抑菌率Table 1 The antagonistic inhibitory rate of Bacillus amyloliquefaciens and Streptomyces kanamyceticus against Medicago sativa fungal pathogens

“-” 表示無(wú)抑菌效果。表中數(shù)值為均值±標(biāo)準(zhǔn)誤。不同小寫(xiě)字母表示經(jīng)Duncan新復(fù)極差法檢驗(yàn)差異顯著(P<0.05)。
“-” Indicates no inhibitory effect.Data in the Table are mean±SD.Different letters indicate significant difference atP<0.05 level by Duncan’s new multiple range test.

圖3 菌株LYZ0069和LYZ0133對(duì)紫花苜蓿病原真菌的拮抗效果(PDA培養(yǎng)基，25 ℃)Fig.3 Antagonistic effect of strains LYZ0069 and LYZ0133 confront pathogenic fungi of alfalfa (PDA medium,25 ℃)A～D：只接病原真菌的對(duì)照；E～H：接入LYZ0069；I～L：接入 LYZ0133；A、E和I中病原菌為尖鐮孢；B、F、J中病原菌為粉紅鐮孢；C、G和K中病原菌為腐皮鐮刀菌；D、H和L中病原菌為苜蓿莖點(diǎn)霉。 A-D:Only take control of pathogenic fungi;E-H:Access strain LYZ0069;I-L:Access strain LYZ0133;The pathogen in A,E and I is F.oxysporium;The pathogen in B,F and J is F.roseum;The pathogen in C,G and K is F.solani;The pathogen in D,H and L is P.medicaginis.

3 討論

近年來(lái)，隨著我國(guó)草地畜牧業(yè)的發(fā)展和農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)結(jié)構(gòu)調(diào)整，紫花苜蓿種植面積持續(xù)增加，病害問(wèn)題也日趨嚴(yán)重，但是由于草地本身的特點(diǎn)及經(jīng)濟(jì)、環(huán)境和食品安全等因素，化學(xué)農(nóng)藥的應(yīng)用受到嚴(yán)重制約[10]。因此尋找經(jīng)濟(jì)、環(huán)境友好型的生物防治資源迫在眉睫[14]。在紫花苜蓿病害病原真菌的分離培養(yǎng)過(guò)程中，我們發(fā)現(xiàn)有2種微生物表現(xiàn)出明顯的抑菌效果，經(jīng)形態(tài)學(xué)和16s rDNA等技術(shù)手段的綜合鑒定，確定兩株拮抗菌分別為解淀粉芽孢桿菌和卡那霉素鏈霉菌。為確定該兩種具有生防潛力的菌株對(duì)紫花苜蓿病害主要病原真菌的拮抗作用，本研究用這兩種菌通過(guò)平板對(duì)峙法對(duì)導(dǎo)致苜蓿根腐病等根部病害及葉斑病、炭疽病等葉部莖部病害的9種主要的病原真菌進(jìn)行室內(nèi)拮抗試驗(yàn)，兩種拮抗菌均表現(xiàn)出較強(qiáng)的拮抗效果和廣譜抑菌性。目前國(guó)內(nèi)外應(yīng)用芽孢桿菌防治植物病害非常廣泛，并已開(kāi)發(fā)成多種生物菌劑而廣泛應(yīng)用[21-23]，解淀粉芽孢桿菌作為芽孢桿菌屬較常見(jiàn)的一類(lèi)，用以防治多種作物病害的生防菌源，已被開(kāi)發(fā)成多種生物菌劑而廣泛應(yīng)用。據(jù)報(bào)道，解淀粉芽孢桿菌對(duì)山茶灰斑病菌(Pestalotiopsisguepini)、菜心炭疽病菌(Colletotrichumhigginsianum)及引起大花惠蘭根腐病的尖孢鐮刀菌(Fusariumoxysporium)均具有較好的拮抗作用[24-26]，而本研究中，解淀粉芽孢桿菌對(duì)引起苜蓿葉斑病、根腐病及苜蓿炭疽病的多種病原菌均表現(xiàn)出良好拮抗作用，進(jìn)一步證明了解淀粉芽孢桿菌是一種具有廣譜抑菌活性的細(xì)菌[27]。關(guān)于鏈霉菌用于生防的報(bào)道也較多，如Shimizu等[28]發(fā)現(xiàn)鏈霉菌MBCu-56對(duì)黃瓜(Cucumissativus)幼葉預(yù)處理濃度為109CFU/mL時(shí)，對(duì)黃瓜炭疽病(Colletotrichumorbiculare)表現(xiàn)出93%的抑制性；Yuan等[29]研究證明迪利鏈霉菌(Streptomyceslydicus) 對(duì)立枯絲核菌(Rhizoctoniasolani)和終極腐霉(Pythiumultimum)等根部病原真菌表現(xiàn)出明顯的抑制作用，用其做種子包衣可減少60%的病原侵染，在本研究中首次發(fā)現(xiàn)了卡那霉素鏈霉菌對(duì)苜蓿炭疽病菌(70.94%)及粉紅鐮孢(76.90%)、尖鐮孢(49.95%)等苜蓿根腐病菌均表現(xiàn)出良好拮抗效果，表明鏈霉菌具有控制炭疽病及根部病害等多種病害的巨大潛力。理想的生防菌不僅要求拮抗能力強(qiáng)，而且要求生存能力強(qiáng)[4]，芽孢桿菌通常可忍受各種不良的環(huán)境，能在熱、紫外線、電離輻射和一些化學(xué)藥品等逆境脅迫下產(chǎn)生具有很強(qiáng)抗性的芽孢，以便于在不利環(huán)境中存活、定殖與繁殖[30-33]，且具有較強(qiáng)的次生代謝產(chǎn)物和抑菌物質(zhì)的產(chǎn)生能力[27]；而鏈霉菌是高等放線菌，可產(chǎn)生多種抗生素、植物激素等活性物質(zhì)，對(duì)提高植物的抗病、抗逆性能具有重要的作用，該兩種菌均具有開(kāi)發(fā)成生防制劑的巨大潛力[34-35]。在本研究中我們觀察到，兩種拮抗菌與病原真菌都未發(fā)生物理接觸而起作用，結(jié)合以上討論和有關(guān)報(bào)道[36-37]我們推測(cè)，主要原因是兩種拮抗菌均是通過(guò)產(chǎn)生某種抗生素或次生代謝產(chǎn)物來(lái)起作用。生物防治在牧草病害上也取得了一些進(jìn)展，如蠟狀芽孢桿菌(Bacilluscereus)可用于苜蓿幼苗立枯病(Rhinzoctonialeguminicola)的生物防治[15],鏈霉菌可用于防治真菌造成的紫花苜蓿幼苗猝倒[16]。關(guān)于解淀粉芽孢桿菌與鏈霉菌在生防方面的報(bào)道多數(shù)只針對(duì)單一病害，本研究通過(guò)對(duì)峙試驗(yàn)證明解淀粉芽孢桿菌和卡那霉素鏈霉菌對(duì)紫花苜蓿葉斑病、根腐病和炭疽病的主要病原菌均表現(xiàn)良好的拮抗效果，說(shuō)明其在牧草病害上有很大的生防應(yīng)用潛能，關(guān)于這兩種拮抗菌的拮抗機(jī)理、室內(nèi)及其大田仿效等問(wèn)題還有待于進(jìn)一步研究。

References：

[1] Geng H Z,Wu Y F,Cao Z Z.Chinese Alfalfa[M].Beijing:China Agriculture Press,1995.耿華珠,吳永敷,曹致中.中國(guó)苜蓿[M].北京:中國(guó)農(nóng)業(yè)出版社,1995.

[2] Zhang L,Pan L Q,Wang S R,etal.Study on the biological characteristic of the alfalfa phoma leaf spot pathogen.Journal of China Agricultural University,2015,20(4):158-166.張麗,潘龍其,王生榮,等.苜蓿莖點(diǎn)霉葉斑病病原鑒定及生物學(xué)特性研究.中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào),2015,20(4):158-166.

[3] Chen Y J,Liu X M,Cui G W,etal.Research progress of alfalfa root rot.Chinese Grass,2000,(1):51-56.陳雅君,劉學(xué)敏,崔國(guó)文,等.紫花苜蓿根腐病的研究進(jìn)展.中國(guó)草地,2000,(1):51-56.

[4] Yuan Q H.Alfalfa disease research progress in China.Plant Protection,2007,33(1):6-10.袁慶華.我國(guó)苜蓿病害研究進(jìn)展.植物保護(hù),2007,33(1):6-10.

[5] Nan Z B.Root rot of leguminous forage.Foreign Animal Husbandry Grassland and Pasture,1991,(2):5-11.南志標(biāo).豆科牧草根腐病.國(guó)外畜牧學(xué)-草原與牧草,1991,(2):5-11.

[6] Chen Y,Min J C,Xiao F,etal.Alfalfa root rot preliminary report of XinJiang.Chinese Grass,1989,(2):71-73.陳耀,閔繼淳,肖鳳,等.新疆苜蓿根腐病研究初報(bào).中國(guó)草地學(xué)報(bào),1989,(2):71-73.

[7] Wang X W,Yu N L,Ma D C,etal.Preliminary research of disease kinds and distribution of Xinjiang alfalfa.Acta Prataculturae Sinica,1998,(2):49-53.王雪薇,喻寧莉,馬德成,等.新疆苜蓿病害種類(lèi)和分布的初步研究.草業(yè)學(xué)報(bào),1998,(2):49-53.

[8] Bickoff E,Loper G,Hanson C,etal.Effect of common leafspot on coumestans and flavones in alfalfa.Crop Science,1967,7(3):259-261.

[9] Liang J G,Zhang B X,Shi Y F,etal.Study on isolation and screening of plant-growth promoting rhizobacteria and its biocontrol acion to soil-borne diseases of cucumber.Chinese Agricultural Science Bulletin,2007,23(12):341-346.梁建根,張炳欣,施躍峰,等.植物根圍促生細(xì)菌 (PGPR) 的分離篩選及對(duì)黃瓜土傳病害的防治[D].中國(guó)農(nóng)學(xué)通報(bào),2007,23(12):341-346.

[10] Cheng L Y.Identification and Screening of Biocontrol Strain ofTrichodermaspp[D].Fuzhou:Fujian Agriculture and Forestry University,2007.程麗云.木霉菌(Trichodermaspp.)的種類(lèi)鑒定及生防菌株的篩選[D].福州:福建農(nóng)林大學(xué)，2007.

[11] Chen C,Bauske E,Musson G,etal.Biological control ofFusariumwilton cotton by use of endophytic bacteria.Biological Control,1995,5(1):83-91.

[12] Sharma R,Singh D,Singh R.Biological control of postharvest diseases of fruits and vegetables by microbial antagonists:a review.Biological Control,2009,50(3):205-221.

[13] Nan Z B.The establishment of China’s sustainable management system of pasture disease.Acta Prataculturae Sinica,2000,9(2):1-9.南志標(biāo).建立中國(guó)的牧草病害可持續(xù)管理體系.草業(yè)學(xué)報(bào),2000,9(2):1-9.

[14] Nan Z B.Alfalfa diseases and integrated control system of China.Animal Science and Veterinary Medicine,2001,18(4):1-4.南志標(biāo).我國(guó)的苜蓿病害及其綜合防治體系.動(dòng)物科學(xué)與動(dòng)物醫(yī)學(xué),2001,18(4):1-4.

[15] Handelsman J,Raffel S,Mester E H,etal.Biological control of damping-off of alfalfa seedlings withBacilluscereusUW85.Applied and Environmental Microbiology,1990,56(3):713-718.

[16] Jones C R,Samac D A.Biological control of fungi causing alfalfa seedling damping-off with a disease-suppressive strain ofStreptomyces.Biological Control,1996,7(2):196-204.

[17] Fang Z D.Reached Methods of Plant Pathology[M].Third edition.Beijing:China Agriculture Press,1998.方中達(dá)．植病研究方法[M].第三版.北京:中國(guó)農(nóng)業(yè)出版社,1998.

[18] Dong X Z,Hong J H.Diversity of prokaryotic microorganisms.Biodiversity Science,2001,9(1):18-24.東秀珠,洪俊華.原核微生物的多樣性.生物多樣性,2001,9(1):18-24.

[19] Sun Z,Yang L M.Screening and identification of antagonistic bacteria against panax ginseng pathogeny fungus.Journal of Plant Protection,2015,(1):79-86.孫卓,楊利民.人參病原菌拮抗細(xì)菌的分離篩選與鑒定.植物保護(hù)學(xué)報(bào),2015,(1):79-86.

[20] Wang Q,Hu C J,Huang S L,etal.Screening of antagonistic bacteria against fungal diseases and determination of their antagonistic activity to various plantpathogenic fungi.Guangxi Agricultural Sciences,2010,41(7):675-678.汪茜,胡春錦,黃思良,等.真菌病害拮抗菌的篩選及其對(duì)多種植物病原真菌的拮抗活性測(cè)定.廣西農(nóng)業(yè)科學(xué),2010,41(7):675-678.

[21] Cui L,Sun F Z,Sun F Z,etal.Isolation of endophytic bacteria from potato and selection of antagonistic bacteria to potato ring rotdisease.Acta Phytopathologica Sinica,2003,33(4):353-358.崔林,孫振,孫福在,等.馬鈴薯內(nèi)生細(xì)菌的分離及環(huán)腐病拮抗菌的篩選鑒定.植物病理學(xué)報(bào),2003,33(4):353-358.

[22] Marten P,Smalla K,Berg G.Genotypic and phenotypic differentiation of an antifungal biocontrol strain belonging toBacillussubtilis.Journal of Applied Microbiology,2000,89(3):463-471.

[23] Walker R,Powell A,Seddon B.Bacillus isolates from the spermosphere of peas and dwarf French beans with antifungal activity againstBotrytiscinereaandPythiumspecies.Journal of Applied Microbiology,1998,84(5):791-801.

[24] Zhang J,Ran X X,Zhu T H,etal.Bacillusamyloliquefaciensantimicrobial effect onPestalotiopsisguepini(Desm.) Stey.Journal of Northeast Forestry University,2014,42(7):122-125.張靜,冉曉瀟,朱天輝,等.解淀粉芽孢桿菌對(duì)山茶灰斑病菌的抑制作用.東北林業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào),2014,42(7):122-125.

[25] Zhu F Y,Wu X L,Lv F Q,etal.Screening and identification of antagonisticBacillusspp.againstColletotrichumhigginsianum.Microbiology,2009,36(9):1350-1355.況福元,吳小麗,呂風(fēng)青,等.菜心炭疽病菌拮抗細(xì)菌的篩選及鑒定.微生物學(xué)通報(bào),2009,36(9):1350-1355.

[26] Li L B,Li S N,Li J,etal.Isolation and identification of the antagonistic bacterial strain ZL7-5 against root rot disease ofCymbidiumhybridium.Acta Horticulturae Sinica,2008,35(11):1647-1652.李潞濱,李術(shù)娜,李佳,等.大花惠蘭根腐病拮抗細(xì)菌ZL725菌株的篩選與鑒定.園藝學(xué)報(bào),2008,35(11):1647-1652.

[27] Wu Y J,Ling Y F,Ling H T,etal.Advance in the rescarches of biocontrolBacillusamyloliquefaciens.Packaging and Food Machinery,2013,30(6):49-52.吳一晶,林藝芬,林河通,等.生防菌解淀粉芽孢桿菌研究進(jìn)展.包裝與食品機(jī)械,2013,30(6):49-52.

[28] Shimizu M,Yazawa S U,shijima Y.A promising strain of endophyticStreptomycessp.for biological control of cucumber anthracnose.Journal of General Plant Pathology,2009,75(1):27-36.

[29] Yuan W M,Crawford D L.Characterization ofStreptomyceslydicusWYEC108 as a potential biocontrol agent against fungal root and seed rots.Applied and Environmental Microbiology,1995,61(8):3119-3128.

[30] Ahimou F,Jacques P,Deleu M.Surfactin and iturin effects onBacillussubtilissurface hydrophobicity.Enzyme and Microbial Technology,2000,27(10):749-754.

[31] Elliott M L,Jardin E A,Batson W E,etal.Viability and stability of biological control agents on cotton and snap bean seeds.Pest Management Science,2001,57(8):695-706.

[32] Ford W.Studies on aerobic spore-bearing non-pathogenic bacteria:part I.Introduction.Journal of Bacteriology,1916,1(3):273-276.

[33] Mew T.Current status and future prospects of research on bacterial blight of rice.Annual Review of Phytopathology,1987,25(1):359-382.

[34] Pawl B,Chian K,Paul S L.Not a peripheral issue:secretion inplant-microbe interactions.Current Opinion in Plant Biology,2010,13:378-387.

[35] Kim Y C,Leveau J,Gardener B B,etal.The multifactorial basis for plant health promotion by plant-associated bacteria.Applied and Environmental Microbiology,2011,77(5):1548-1555.

[36] Yi L,Zhang Y,Liao X L,etal.Advances ofStreptomyceson biocontrol plant diseases.Agricultural Sciences of Jiangsu,2014,42(3):91-95.易龍,張亞,廖曉蘭,等.鏈霉菌防治植物病害的研究進(jìn)展.江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué),2014,42(3):91-95.

[37] Tang H,Zhang L P.Site-directed mutagenesis ofStreptomycesavermitilisaveD gene.Agricultural Science and Technology,2011,12(10):1424-1426.湯暉,張利平.阿維鏈霉菌aveD基因的定點(diǎn)突變.農(nóng)業(yè)科學(xué)與技術(shù)(英文版),2011,12(10):1424-1426.

Screening of inhibitory bacteria for prevention and treatment of fungal diseases ofMedicagosativa

HU Jin-Ling,WANG Zhi-Gang,XU Na,DANG Shu-Zhong,LI Yan-Zhong*

StateKeyLaboratoryofGrasslandAgro-ecosystems,CollegeofPastoralAgricultureScienceandTechnology,LanzhouUniversity,Lanzhou730020,China

The inhibitory effect of two bacteria on 9 alfalfa pathogens were tested on PDA medium using the confrontation method;the taxonomic status of each pathogen species were determined using morphological and molecular criteria.The bacteria identified wereBacillusamyloliquefaciensandStreptomyceskanamycin.The inhibitory effect ofBacillusamyloliquefaciensranged from 24.02%-71.11%,with the greatest effect shown againstCercosporamedicaginis(71.11%),Stemphyliumbotryosum(64.76%) andFusariumroseum(60.55%).The inhibitory range ofStreptomyceskanamycinwas similar (49.95%-76.90%) with greatest effect againstColletotrichumtrifolii(76.90%),Phomamedicaginis(70.94%),Stemphyliumbotryosum(68.01%) andLeptosphaerulinabriosiana(60.99%).BacillusamyloliquefaciensandStreptomyceskanamycinshowed varying degrees of antagonism to different alfalfa pathogenic fungi indicate that they have promise as biological control agents for a variety ofMedicagosativafoliar diseases,suggesting further development should be undertaken.

Medicagosativa;pathogenic fungi;antagonistic;identification;Bacillusamyloliquefaciens;Streptomyceskanamycin

10.11686/cyxb2016293 http://cyxb.lzu.edu.cn

胡進(jìn)玲,汪治剛,徐娜,黨淑鐘,李彥忠.防治紫花苜蓿真菌病害的生防菌篩選.草業(yè)學(xué)報(bào),2017,26(6):145-152.

HU Jin-Ling,WANG Zhi-Gang,XU Na,DANG Shu-Zhong,LI Yan-Zhong.Screening of inhibitory bacteria for prevention and treatment of fungal diseases ofMedicagosativa.Acta Prataculturae Sinica,2017,26(6):145-152.

2016-07-19；改回日期：2016-10-09

國(guó)家自然科學(xué)基金(No.31272496)，公益性行業(yè)(農(nóng)業(yè))科研專(zhuān)項(xiàng)經(jīng)費(fèi)項(xiàng)目(No.201303057),國(guó)家牧草產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系(CARS-35)和云南省高端科技人才引進(jìn)項(xiàng)目(2012HA012)資助。

胡進(jìn)玲(1991-)，女，甘肅白銀人，在讀碩士。E-mail:hujl15@lzu.edu.cn

*通信作者Corresponding author.E-mail:liyzh@lzu.edu.cn