高溫、低鹽對菲律賓蛤仔免疫能力的影響

楊東敏,張艷麗,丁鑒鋒,楊鳳,霍忠明,聶鴻濤,閆喜武(大連海洋大學(xué)水產(chǎn)與生命學(xué)院,遼寧省貝類良種繁育工程技術(shù)研究中心,遼寧大連116023)

高溫、低鹽對菲律賓蛤仔免疫能力的影響

楊東敏,張艷麗,丁鑒鋒,楊鳳,霍忠明,聶鴻濤,閆喜武
(大連海洋大學(xué)水產(chǎn)與生命學(xué)院,遼寧省貝類良種繁育工程技術(shù)研究中心,遼寧大連116023)

為查明溫度(21、30益)和鹽度(7、15、32)互作對菲律賓蛤仔Ruditapes philippinarum免疫能力的影響,對不同溫度和鹽度條件下試驗(yàn)0、3、6、12、24、48、72 h時(shí),體質(zhì)量為(14.8依0.731)g蛤仔的血細(xì)胞數(shù)、血淋巴吞噬能力和滲透壓,以及血清中溶菌酶(LZM)、堿性磷酸酶(AKP)活性的變化進(jìn)行了研究。結(jié)果表明:以各指標(biāo)0 h水平為對照,常溫常鹽組(21益,32)蛤仔各指標(biāo)在0~72 h內(nèi)雖有波動,但變化并不顯著(P>0.05);各試驗(yàn)組蛤仔血細(xì)胞數(shù)有不同的變化趨勢,72 h時(shí),常溫低鹽組(21益,7)蛤仔恢復(fù)初始水平,而常溫中鹽組(21益,15)、高溫中鹽組(30益,15)和高溫常鹽組(30益,32)蛤仔血細(xì)胞數(shù)最終仍未恢復(fù),高溫低鹽組(30益,7)蛤仔雖在24 h時(shí)恢復(fù)初始水平,但在48 h時(shí)全部死亡;高溫常鹽組蛤仔吞噬能力先升高后降低在72 h時(shí)仍低于初始水平(P<0.05),2個(gè)中鹽組和常溫低鹽組蛤仔吞噬活性最終恢復(fù),而高溫低鹽組蛤仔吞噬活性在24 h時(shí)仍處于較高水平(P<0.05);各試驗(yàn)組蛤仔LZM活性在72 h時(shí)均顯著高于初始水平(P<0.05);常溫中鹽組蛤仔AKP活性在3 h出現(xiàn)最大值,最終所有試驗(yàn)組AKP在72 h時(shí)恢復(fù)初始水平;2個(gè)中鹽組和2個(gè)低鹽組蛤仔滲透壓均逐漸降低,而高溫常鹽組蛤仔滲透壓逐漸升高,在72 h時(shí)均未恢復(fù)初始水平。研究表明,溫度升高的同時(shí)降低鹽度,將會對貝類免疫能力造成嚴(yán)重的影響,這可能是夏季灘涂貝類死亡率較高的一個(gè)重要原因。

菲律賓蛤仔;高溫;低鹽;免疫能力

菲律賓蛤仔Ruditapes philippinarum(以下簡稱蛤仔)隸屬于雙殼綱、簾蛤科、綴錦亞科、蛤仔屬,是一種廣溫、廣鹽性貝類[1],主要棲息于內(nèi)灣、河口和沿海灘涂等地[2],具有生長周期短和適應(yīng)性強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn),適合人工高密度養(yǎng)殖,是中國四大養(yǎng)殖貝類之一[3]。

貝類養(yǎng)殖場通常位于淺灘、海灣或河口處,養(yǎng)殖在近海的貝類,其生活環(huán)境易受陸源淡水、降雨等影響,鹽度急劇降低的現(xiàn)象時(shí)有發(fā)生。溫度和鹽度是影響水生生物生長的重要環(huán)境因子,許多研究表明,鹽度急劇降低能夠?qū)е码u簾蛤Chamelea gallina[4]和魁蚶稚貝Anadara broughtonii[5]血淋巴吞噬能力、溶菌酶活性和滲透壓下降,個(gè)體死亡率大大增加。Castagna等[6]也發(fā)現(xiàn),生活于鹽度過低的淺海區(qū)或近岸的雙殼貝類表現(xiàn)出極高的死亡率。夏季高溫也是導(dǎo)致養(yǎng)殖貝類死亡的一個(gè)重要誘因, Malham等[7]對長牡蠣Crassostrea gigas研究發(fā)現(xiàn),溫度升高導(dǎo)致牡蠣血細(xì)胞數(shù)減少,血淋巴細(xì)胞吞噬活性和免疫能力降低,是長牡蠣夏季死亡率高的主要原因之一。李文姬等[8]研究發(fā)現(xiàn),夏季高溫期水環(huán)境會急劇惡化,蝦夷扇貝Patinopecten yessoen-sis因代謝強(qiáng)度增加而消耗大量能量,導(dǎo)致其死亡率極高。上述研究表明,溫度和鹽度的急劇變化均能影響貝類的免疫防御機(jī)能,使貝類免疫機(jī)能受到抑制,從而導(dǎo)致疾病的發(fā)生[8-10]。夏季是貝類死亡的高發(fā)季節(jié),高溫和暴雨導(dǎo)致的鹽度降低是否會產(chǎn)生協(xié)同脅迫效果尚不清楚。目前,國內(nèi)關(guān)于溫度與鹽度共同作用對蛤仔免疫機(jī)制影響的相關(guān)研究較少,為此,本研究中探究了高溫和低鹽交互脅迫條件下蛤仔免疫相關(guān)指標(biāo)的變化以及對蛤仔免疫調(diào)節(jié)的影響機(jī)制,旨在為蛤仔健康養(yǎng)殖提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

試驗(yàn)用蛤仔購自大連市水產(chǎn)品市場,選用體質(zhì)量為(14.8依0.73)g,殼長為(4.5依0.35)cm,殼型完整且活力強(qiáng)的個(gè)體作為研究對象。將購買的蛤仔置于水槽中暫養(yǎng)7 d,暫養(yǎng)期間海水鹽度為32,溫度為(21依0.5)益,連續(xù)充氣,每天定時(shí)換水1次,并投喂螺旋藻粉2次。

1.2 方法

1.2.1 試驗(yàn)設(shè)計(jì)試驗(yàn)設(shè)置2個(gè)溫度水平,分別為30益和21益;每個(gè)溫度條件下設(shè)置3個(gè)鹽度水平,分別為7、15、32,共計(jì)6種組合,分別記為常溫常鹽組(21益,32)、常溫中鹽組(21益, 15)、常溫低鹽組(21益,7)、高溫常鹽組(30益,32)、高溫中鹽組(30益,15)和高溫低鹽組(30益,7),每組設(shè)置兩個(gè)平行,每個(gè)平行放30枚蛤仔。在試驗(yàn)的第0、3、6、12、24、48、72 h,從每組隨機(jī)選取4枚樣品進(jìn)行指標(biāo)的測定。

1.2.2 血淋巴細(xì)胞樣品的制備使用1 mL無菌注射器從蛤仔圍心腔抽取800滋L血淋巴。取200滋L分別用于血細(xì)胞計(jì)數(shù)、血細(xì)胞吞噬活性和滲透壓的檢測,其余血淋巴經(jīng)7000 r/min離心后取上清放入冰箱(-80益)中冷凍保存,用于溶菌酶(LZM)、堿性磷酸酶(AKP)活性的檢測。

1.2.3 血細(xì)胞總數(shù)的測定取30滋L血淋巴樣品加入到等量BFC固定液(NaCl 2%、乙酸鈣1%、甲醛4%)中,充分混勻后吸取8滋L加到血球計(jì)數(shù)板上,在100倍光鏡下觀察并計(jì)數(shù)。

1.2.4 血細(xì)胞吞噬活性的測定采用Hannam等[11]的方法,取血淋巴和滅菌海水,將1頤1的混合樣品50滋L加入到96孔酶標(biāo)板中,4益下孵育1 h;甩去混合樣品,再向每孔加入100滋L滅菌海水,甩干,重復(fù)此過程1次,洗去未黏附血細(xì)胞;向每孔加入50滋L中性紅染過的酵母懸浮液(50伊107cells/mL);20益下孵育30 min,加入100滋L BFC固定液終止反應(yīng);甩去混合液,向每孔加入滅菌海水100滋L,甩干,重復(fù)此過程1次,洗去多余酵母顆粒;再向每孔加入100滋L酸化酒精(醋酸1%、酒精20%)溶解血細(xì)胞吞噬的酵母細(xì)胞中中性紅,將酶標(biāo)板置于酶標(biāo)儀中,在550 nm處讀取吸光度值?；钚詥挝欢x:每毫克蛋白所吞噬的酵母顆粒數(shù),即駐OD550nm/mg蛋白質(zhì)。

取50滋L酵母顆粒[濃度分別為(6.25、12.50、25.00、50.00、100.00)伊107cells/mL],加入等量酸化酒精,在550 nm處讀取吸光度值,制作酵母濃度與吸光度值標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.2.5 血淋巴滲透壓的測定取血淋巴樣品50滋L,經(jīng)300目紗絹過濾后,使用OSMOMAT襆030滲透壓儀(德國)進(jìn)行檢測。

1.2.6LZM、AKP酶活力和血漿蛋白濃度的檢測按照相關(guān)試劑盒(購自南京建成生物有限公司)說明書進(jìn)行操作,酶活力單位均為每毫克血清蛋白所含的酶活性,采用考馬斯亮藍(lán)法測定蛋白濃度。

1.3 數(shù)據(jù)處理

試驗(yàn)結(jié)果用平均值依標(biāo)準(zhǔn)差(means依S.D.)表示,采用數(shù)據(jù)用SPSS 19.0軟件進(jìn)行雙因素方差分析(Two-way ANOVA),用Duncan法進(jìn)行多重比較,顯著性水平設(shè)為0.05。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同溫度和鹽度條件下蛤仔血細(xì)胞數(shù)的變化

從圖1可見:21益條件下,隨著試驗(yàn)時(shí)間的延長,32鹽度組蛤仔血細(xì)胞數(shù)無顯著性變化(P> 0.05);15鹽度組蛤仔整體呈降低趨勢,72 h時(shí)仍顯著低于初始(0 h)水平(P<0.05);7鹽度組蛤仔在經(jīng)過降低、升高的過程后,最終恢復(fù)至初始水平。30益條件下,3個(gè)試驗(yàn)組蛤仔血細(xì)胞數(shù)均經(jīng)歷3 h時(shí)升高、6 h時(shí)降低和24 h時(shí)恢復(fù)的過程,而7鹽度組蛤仔在24 h恢復(fù)初始水平之后,48 h時(shí)全部死亡,在72 h時(shí),除(21益,7)組外其他試驗(yàn)組均未恢復(fù)初始水平(P<0.05)。

同一時(shí)間下,以每個(gè)時(shí)間點(diǎn)的(21益,32)組為對照,3 h時(shí),(30益,32)和(30益,7)組血細(xì)胞數(shù)出現(xiàn)最高值;6 h時(shí),3個(gè)高溫組顯著低于對照組(P<0.05);12 h時(shí),2個(gè)低鹽組顯著升高(P<0.05);24 h時(shí),(21益,7)組血細(xì)胞數(shù)顯著升高(P<0.05);48、72 h時(shí),(30益,15)組蛤仔血細(xì)胞數(shù)顯著下降且出現(xiàn)最低值(P<0.05)。

2.2 不同溫度和鹽度條件下蛤仔血淋巴吞噬能力的變化

從圖2可見:21益條件下,隨著試驗(yàn)時(shí)間的延長,32鹽度組蛤仔血細(xì)胞吞噬能力無顯著性變化(P>0.05);15、7鹽度組血細(xì)胞吞噬能力經(jīng)歷了波動變化后在72 h時(shí)均恢復(fù)至初始水平。30益條件下,3個(gè)試驗(yàn)組蛤仔血細(xì)胞吞噬活性在12 h均顯著高于初始水平(P<0.05);7鹽度組在24 h時(shí)仍顯著高于初始水平(P<0.05),48 h時(shí)全部死亡;72 h時(shí),32鹽度組顯著低于初始水平(P< 0.05),15鹽度組已恢復(fù)初始水平。

同一時(shí)間下,以每個(gè)時(shí)間點(diǎn)的(21益,32)組為對照,3 h時(shí),高溫組顯著降低(P<0.05);12 h時(shí),(30益,15)組血細(xì)胞吞噬能力出現(xiàn)最高值;48 h時(shí),(21益,7)組出現(xiàn)最低值;72 h時(shí),除(30益,32)組顯著低于對照組(P<0.05)外,其他組均恢復(fù)至對照組水平。

2.3 不同溫度和鹽度條件下蛤仔血清LZM活性的變化

從圖3可見:隨著試驗(yàn)時(shí)間的延長,(21益, 32)組LZM酶活性無顯著性變化(P>0.05),其他試驗(yàn)組LZM酶活性經(jīng)歷一系列不同的波動變化后,在72 h時(shí)均顯著高于初始水平(P<0.05)。

同一時(shí)間下,以每個(gè)時(shí)間點(diǎn)的(21益,32)組為對照,3 h時(shí),(21益,7)組LZM活性出現(xiàn)最低值(P<0.05),在24~72 h時(shí)顯著高于對照組(P<0.05);各試驗(yàn)組在72 h時(shí)均顯著高于對照組(P<0.05)。

圖1 不同溫度和鹽度條件下蛤仔的血細(xì)胞總數(shù)Fig.1Total blood cell count of Manila clam Ruditapes philippinarum under different temperature and salinity conditions

圖2 不同溫度和鹽度條件下蛤仔血細(xì)胞的吞噬能力Fig.2Phagocytic capacity of M anila clam Ruditapes philippinarum under different tem perature and salinity conditions

2.4 不同溫度和鹽度條件下蛤仔血清AKP活性的變化

從圖4可見:21益條件下,隨著試驗(yàn)時(shí)間的延長,32鹽度組蛤仔AKP活性無顯著性變化(P> 0.05);15、7鹽度組AKP活性經(jīng)歷先升高后降低的變化后,在72 h時(shí)均恢復(fù)初始水平。30益條件下,3個(gè)試驗(yàn)組蛤仔AKP活性均出現(xiàn)升高、降低的不同波動過程,在72 h時(shí)32、15鹽度組均恢復(fù)至初始水平。

同一時(shí)間下,以每個(gè)時(shí)間點(diǎn)的(21益,32)組為對照,3 h時(shí),(21益,15)組蛤仔AKP活性出現(xiàn)最高值;6~24 h時(shí),高溫組呈降低趨勢;48 h時(shí),(30益,32)組顯著高于對照組(P<0.05); 72 h時(shí),各組均恢復(fù)至對照組水平。

2.5 不同溫度和鹽度下蛤仔血淋巴滲透壓的變化

從圖5可見:隨著試驗(yàn)時(shí)間的延長,(21益, 32)組蛤仔滲透壓無顯著性變化(P>0.05);(30益,32)組血淋巴滲透壓在3~72 h時(shí)始終顯著高于初始水平(P<0.05);2個(gè)中鹽組(鹽度15)和2個(gè)低鹽組(鹽度7)均表現(xiàn)出逐漸降低的趨勢,在24~72 h時(shí)顯著低于初始水平(P<0.05)。

圖3 不同溫度和鹽度條件下蛤仔的LZM活性Fig.3LZM activities of M anila clam Ruditapes philippinarum under different tem perature and salinity conditions

圖4 不同溫度和鹽度條件下蛤仔的AKP活性Fig.4AKP activities of M anila clam Ruditapes philippinarum under different tem perature and salinity conditions

同一時(shí)間下,以每個(gè)時(shí)間點(diǎn)的(21益,32)組為對照,3~72 h時(shí),(30益,32)組蛤仔滲透壓均顯著高于其他組(P<0.05);24~72 h時(shí),2個(gè)中鹽組和2個(gè)低鹽組蛤滲透壓均顯著低于對照組

(P<0.05)。

3 討論

3.1 溫度與鹽度互作對蛤仔血細(xì)胞數(shù)的影響

貝類的血細(xì)胞具有免疫應(yīng)答功能,可抵御外來病原微生物侵襲,起到炎癥消除、傷口修復(fù)、呼吸爆發(fā)、吞噬和包囊等作用,血細(xì)胞數(shù)是反映無脊椎動物細(xì)胞免疫能力變化的一個(gè)重要指標(biāo),溫度和鹽度等環(huán)境因子變化均會對血淋巴細(xì)胞產(chǎn)生重要影響[12-13]。研究發(fā)現(xiàn),溫度驟升和長時(shí)間的高溫脅迫均能導(dǎo)致包括雞簾蛤[8]、菲律賓蛤仔[12]、海灣扇貝Argopecten irradians、櫛孔扇貝Chlamys farre-ri[14]和牡蠣[15]在內(nèi)的貝類血細(xì)胞數(shù)增加。貝類血細(xì)胞數(shù)量的變化與其開放式循環(huán)系統(tǒng)有關(guān),血淋巴細(xì)胞分布在循環(huán)系統(tǒng)和組織中,當(dāng)組織中血細(xì)胞進(jìn)入循環(huán)系統(tǒng)可導(dǎo)致血淋巴中血細(xì)胞數(shù)量增加,而血細(xì)胞的凋亡或者進(jìn)入組織的數(shù)量增加則會導(dǎo)致血淋巴中血細(xì)胞數(shù)量減少[16]。本研究中,蛤仔血細(xì)胞數(shù)在高溫脅迫時(shí)都呈增加的趨勢,但(30益,15)和(30益,7)組在后期則呈減少的趨勢,這種變化可能與鹽度的變化有關(guān)。研究認(rèn)為,鹽度降低可導(dǎo)致蛤仔、九孔鮑Haliotis diversicolor supertexta、翡翠貽貝Perna viridis等血細(xì)胞總數(shù)減少[17-20],其原因可能是鹽度降低促使血細(xì)胞進(jìn)入組織中,導(dǎo)致血淋巴中血細(xì)胞數(shù)量減少[16,21];此外,鹽度降低引起的血細(xì)胞凋亡也是一個(gè)重要的原因[22]。本研究中,(30益,15)和(30益,7)組的血細(xì)胞數(shù)在6 h時(shí)顯著低于(21益,15)和(21益,7)組,此后又表現(xiàn)出了不同的波動變化,這種高溫和低鹽度條件下血細(xì)胞數(shù)量的變化,可能與溫度或鹽度值臨近機(jī)體極限值時(shí)所表現(xiàn)出的一種互作效應(yīng)[6,23-25]有關(guān),也可能是高溫導(dǎo)致貝類血細(xì)胞血氧含量降低[26],引起其對低鹽耐受能力下降所致。

3.2 溫度與鹽度互作對蛤仔吞噬能力的影響

吞噬作用是貝類一種重要的免疫防御機(jī)制,是衡量血細(xì)胞防御機(jī)能的一個(gè)重要指標(biāo),在貝類免疫防御系統(tǒng)中扮演著極其重要的角色[8,27-29]。研究發(fā)現(xiàn),吞噬能力受到溫度和鹽度等環(huán)境因子的影響較大[30-32]。溫度升高會導(dǎo)致貝類血細(xì)胞的吞噬活性降低[8,10,15,33]。本研究中,蛤仔血細(xì)胞的吞噬能力隨著溫度的升高均表現(xiàn)出升高的過程;在脅迫后期高溫組蛤仔又表現(xiàn)出降低或恢復(fù)的過程,這可能與蛤仔適宜生活的溫度環(huán)境有關(guān),在對九孔鮑、紫貽貝Mytilus galloprovincialis的研究中也發(fā)現(xiàn),溫度變化時(shí)其吞噬能力會發(fā)生變化,在最適溫度時(shí),其吞噬能力最高[29,32]。相關(guān)研究顯示,鹽度驟降和長時(shí)間低鹽脅迫時(shí),九孔鮑[19]、黑鮑Haliotis crach-erodii[34]等血細(xì)胞的吞噬活性隨鹽度降低而降低。這可能是由于雙殼類動物在應(yīng)激時(shí)會合成去甲腎上腺素,抑制了其吞噬活性[35-37]。本研究中,以常溫常鹽組為對照,常溫組蛤仔血細(xì)胞的吞噬能力整體上呈先下降后升高的狀態(tài),在脅迫72 h時(shí),蛤仔血細(xì)胞的吞噬活性幾乎恢復(fù)至對照組水平,表明在正常溫度條件下,隨著蛤仔對低鹽條件的適應(yīng),其血細(xì)胞的吞噬活性也能隨之恢復(fù)。在對黑鮑的低鹽脅迫研究中也得到了同樣的結(jié)果[34]。(30益, 15)和(30益,7)低鹽脅迫組蛤仔血細(xì)胞的吞噬能力均出現(xiàn)活性升高的趨勢,且在12 h時(shí),與常溫低鹽組相比出現(xiàn)了顯著升高的趨勢,這可能與高溫低鹽刺激導(dǎo)致機(jī)體代謝加快有關(guān);但持續(xù)的刺激造成機(jī)體耗氧量增大,甚至出現(xiàn)生理功能紊亂,代謝失衡,也可能是低鹽組(鹽度7)蛤仔后期死亡的主要原因[38]。

圖5 不同溫度和鹽度條件下蛤仔的血淋巴滲透壓Fig.5Osmotic pressure of M anila clam Ruditapes philippinarum under different temperature and salinity conditions

3.3 溫度與鹽度互作對蛤仔LZM活性的影響

LZM作為非特異性生物防御因子能對某些細(xì)菌發(fā)揮先天抵抗作用,并能誘導(dǎo)合成和分泌其他免疫因子[39]。LZM的活性和表達(dá)容易受溫度、鹽度、溶解氧和污染物等的影響[8]。在對河蜆Corbicula fluminea[40]、雞簾蛤[8]、大西洋鰈Hippoglossus hip-poglossus[41]、史氏鱘Acipenser schrencki[42]等的研究中發(fā)現(xiàn),當(dāng)溫度升高時(shí),LZM活性也會增加。本研究中發(fā)現(xiàn),隨著溫度升高蛤仔LZM活性呈上升趨勢。研究表明,LZM活性升高與對高溫的應(yīng)激反應(yīng)有關(guān),溫度升高使溶酶體崩潰導(dǎo)致LZM向血淋巴中釋放量增加[43]。鹽度變化也會引起LZM活性的改變,研究發(fā)現(xiàn),雞簾蛤[4]、蝦夷扇貝[44]、近江牡蠣Ostrea rivularis[45]等LZM活性會隨鹽度的降低而降低。本研究中,(21益,7)組蛤仔在短時(shí)間低鹽脅迫時(shí),LZM活性也呈降低的趨勢;但在脅迫后期,兩個(gè)低鹽組均表現(xiàn)出升高的趨勢。這可能與LZM從血細(xì)胞向血淋巴中分泌增多導(dǎo)致蛤仔LZM活性增加有關(guān)[4]。另外,本研究中,(30益,15)和(30益,7)組蛤仔LZM活性均呈升高趨勢。這可能與溫度升高促進(jìn)機(jī)體生理代謝加快有關(guān);鹽度降低導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)溶酶體酶和免疫相關(guān)的細(xì)胞器功能受損,LZM向血淋巴中釋放增加,當(dāng)兩者共同作用于蛤仔時(shí),使其LZM活性升高[38]。

3.4 溫度與鹽度互作對蛤仔AKP活性的影響

AKP是細(xì)胞內(nèi)一種重要的溶酶體酶類,在細(xì)胞的吞噬作用中,通過脫顆粒作用釋放到血清中,可以通過改變細(xì)菌表面的結(jié)構(gòu)來增強(qiáng)其異己性,從而增強(qiáng)吞噬細(xì)胞的吞噬作用[46]。研究發(fā)現(xiàn),海灣扇貝、櫛孔扇貝[14]、施氏獺蛤Lutraria sieboldii Reeve[38]在急性溫度脅迫下AKP活性升高,隨著脅迫時(shí)間的延長,AKP活性逐漸降低,這可能與溫度驟升抑制了免疫酶活性有關(guān)[47]。本研究中發(fā)現(xiàn),在高溫脅迫條件下AKP出現(xiàn)了降低的趨勢,但最終恢復(fù)至常溫常鹽組水平,產(chǎn)生不同結(jié)果的原因可能是不同物種對高溫耐受力不同所致。同樣,鹽度的變化通常也會影響到動物體內(nèi)AKP的活性,研究表明,低鹽脅迫條件下近江牡蠣[45]和中國血蛤Sanguinolaria[46]血淋巴內(nèi)AKP的活性表現(xiàn)出先升高后降低的趨勢。在本研究中,蛤仔AKP活性隨鹽度降低亦出現(xiàn)先升高后降低的趨勢,在脅迫后期,AKP恢復(fù)正常值。有研究表明,在低鹽脅迫時(shí),貝類體內(nèi)會產(chǎn)生大量氧離子自由基,可通過提高磷酸酶活力清除體內(nèi)過量的自由基,避免體內(nèi)細(xì)胞受到氧化損傷,但長時(shí)間低鹽脅迫導(dǎo)致機(jī)體能量消耗過度以及血細(xì)胞大量凋亡,最終導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)溶酶體中AKP活性降低[48];蛤仔AKP在脅迫后期表現(xiàn)出活性恢復(fù)過程,其原因可能是隨著蛤仔滲透壓逐漸與外界環(huán)境平衡,機(jī)體內(nèi)環(huán)境趨于穩(wěn)定,使其AKP活性亦逐漸恢復(fù)[49]。

3.5 溫度與鹽度互作對蛤仔滲透壓的影響

當(dāng)外界環(huán)境鹽度發(fā)生改變時(shí),貝類可以通過調(diào)節(jié)體內(nèi)Na+和Cl-的濃度,或者改變血淋巴中的蛋白質(zhì)和游離脂肪酸等來維持細(xì)胞內(nèi)外的滲透壓平衡[50]。有研究表明,溫度升高會導(dǎo)致貝類體內(nèi)血細(xì)胞數(shù)量增加,免疫酶活性升高[8,12,14-15,38,47]。本研究中也發(fā)現(xiàn),溫度升高會導(dǎo)致貝類血細(xì)胞數(shù)量增加,AKP活性增加;當(dāng)溫度持續(xù)升高時(shí)會造成生物體內(nèi)蛋白質(zhì)變性,發(fā)生氧化應(yīng)激并出現(xiàn)細(xì)胞損傷,使細(xì)胞凋亡數(shù)量增加[40,51],此時(shí)血細(xì)胞中的免疫因子釋放到血淋巴中,會導(dǎo)致蛤仔滲透壓隨溫度的升高而升高。通常情況下,鹽度降低時(shí)機(jī)體滲透壓也會降低,在對魁蚶稚貝[5]、紫貽貝[52]、九孔鮑[53]的研究中得到了類似的結(jié)論。本研究中也發(fā)現(xiàn),隨著鹽度的降低蛤仔滲透壓逐漸下降,但不同低鹽脅迫的蛤仔滲透壓降低的幅度不同。蔡星媛等[5]對魁蚶稚貝的研究發(fā)現(xiàn),其機(jī)體滲透壓隨鹽度的降低而降低,但鹽度為25時(shí)魁蚶稚貝的滲透壓低于鹽度為15時(shí),通過觀察發(fā)現(xiàn),魁蚶稚貝在鹽度15時(shí),閉殼時(shí)間最長且頻率最低,從而導(dǎo)致滲透壓降低的幅度低于鹽度25時(shí)。在本試驗(yàn)中,高溫中鹽、低鹽組與常溫中鹽、低鹽組相比,24 h后前者滲透壓降低的速度加快,原因可能是在短時(shí)間低鹽脅迫時(shí)貝類會通過關(guān)閉貝殼與外界環(huán)境隔離,而后逐漸通過改變體內(nèi)的滲透壓來適應(yīng)外界的環(huán)境[5];但是關(guān)閉貝殼必然會影響貝類與外界環(huán)境的氣體交換過程,同時(shí)高溫脅迫導(dǎo)致貝類體內(nèi)能量代謝增強(qiáng),氧氣消耗加快[38],因此,閉殼時(shí)間變短,導(dǎo)致體內(nèi)滲透壓變化速度快于正常溫度組。孟憲亮等[54]對刺參Apostichopus japonicu s研究時(shí)也發(fā)現(xiàn),溫度升高時(shí),鹽度變化更容易引起刺參體腔液滲透壓的改變。

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Synergistic effects of high tem perature and low salinity on immunity of M anila clam Ruditapes philippinarum

YANG Dong-min,ZHANG Yan-li,DING Jian-feng,YANG Feng, HUO Zhong-ming,NIE Hong-tao,YAN Xi-wu
(College of Fisheries and Life Science,Engineering Research Center of Shellfish Culture and Breeding in Liaoning Province,Dalian Ocean University, Dalian 116023,China)

The changes in blood cell count,phagocytosis ability,osmotic pressure,and activities of lysozyme (LZM),and alkaline phosphatase(AKP)in serum were monitored in Manila clam Ruditapes philippinarum with body weight of(14.8依0.73)g exposed to temperatures(21益,and 30益)and a salinity of7,15,and 32 for 0, 3,6,12,24,48,and 72 h in order to investigate the synergistic effects of temperatures and salinity on the immuni-ty of Manila clam.The results showed that therewere some fluctuations in blood parameters and activities of serum LZM and AKP in the experimental groups at water temperature of 21益and a salinity of 32,without significant differences(P>0.05)in 0-72 h compared with initial level in the control group.The blood cells countswere re-covered to the initial level in the clam in the 21益and low salinity of7 group in 72 h,while the blood cells counts were not returned to the initial level in the clam in the 30益,32益and salinity 32 groups in 72 h.The clam in high temperature 30益and low salinity 7 group died in 48 h,although they had recovery blood cell count in 24 h. The clam in high temperature 30益and low salinity 7 showed elevated phagocytosis firstand then decrease in hago-cytosisd,even lower than the initial level in 72 h(P<0.05),while the clam inmedium salinity 15 and 7 and 21益groups had recovery phagocytic activities,with higher phagocytosis in high temperature 30益and low salinity 7 groups in 24 h(P<0.05).There were significantly higher LZM activities than the initial level in the clam among experimental groups in 72 h(P<0.05),with themaximal AKP activity in 3 h and recovery initial levels in 72 h. The gradual decrease in osmotic pressure was observed in medium and low salinity groups,while the gradual in-crease in osmotic pressure in the high temperature 30益and salinity 32 group,without recovery initial level in 72 h.The findings indicate that the interaction of temperatures increase and salinity decrease will have amore serious effect on the immunity of shellfish,which may be involved in the high mortality ofmudflat shellfish in summer.

Ruditapes philippinarum;high-temperature;low salinity;immunity

S968.31

A

10.16535/j.cnki.dlhyxb.2017.03.008

2095-1388(2017)03-0302-08

2016-12-05

國家現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系建設(shè)項(xiàng)目(CARS-48);遼寧省教育廳科研項(xiàng)目(L2014276)

楊東敏(1990—),女,碩士研究生。E-mail:ydm9110@163.com

閆喜武(1962—),男,博士,教授。E-mail:yanxiwu@dlou.edu.cn