氟苯尼考對三疣梭子蟹不同組織中ABC轉運蛋白基因(ABCG)表達量的影響

氟苯尼考對三疣梭子蟹不同組織中ABC轉運蛋白基因(ABCG)表達量的影響

于旋1、2,任憲云2,李健2,劉萍2,高保全2,劉九美1、2,竇全偉1、2

(1.大連海洋大學水產與生命學院,遼寧大連116023;2.中國水產科學研究院黃海水產研究所,山東青島266071)

為研究氟苯尼考(FLR)對三疣梭子蟹Portunus trituberculatus不同組織中ABC轉運蛋白基因(AB-CG)表達量的影響,采用RACE法進行了三疣梭子蟹ABCG基因克隆并對其生物學進行了分析,采用熒光定量PCR法進行了不同濃度(20、40、80 mg/kg)氟苯尼考對三疣梭子蟹肝胰腺、鰓和肌肉中ABCG相對表達量的影響研究。結果表明:三疣梭子蟹ABCG基因全長cDNA序列為2473 bp,共編碼578個氨基酸;三疣梭子蟹ABCG不含信號肽,具ABC轉運家族蛋白的典型結構域,包括1個高度保守的核苷酸結構域(NBD)和1個疏水性跨膜區(qū)(TMD),為半轉運子;同源性及系統(tǒng)進化分析表明,三疣梭子蟹ABCG與中國對蝦、凡納濱對蝦的ABCG聚為一支,具有較高的親緣關系;不同濃度的氟苯尼考對三疣梭子蟹肝胰腺、鰓、肌肉中ABCG表達均具有誘導作用,且呈時間劑量效應,由此推測,三疣梭子蟹ABCG蛋白參與氟苯尼考的代謝轉運過程。本研究結果可為揭示甲殼動物ABCG轉運蛋白對抗生素的轉運機制提供參考依據(jù)。

三疣梭子蟹;ABC轉運蛋白;基因克隆;氟苯尼考;熒光定量PCR

腺苷三磷酸結合盒轉運蛋白(ATP-binding cassette transporter,ABC轉運蛋白)是一類重要的跨膜蛋白體系,廣泛存在于真核和原核生物中,可通過水解ATP的能量對胞質中的外源化合物、代謝產物、離子、糖、氨基酸、脂類和固醇等物質進行跨膜轉運[1-2]。目前,根據(jù)保守序列的同源性,將已知的ABC轉運蛋白分為8個亞型(ABCA~ ABCH),其中ABCB、ABCC和ABCG與外源化學物質的代謝有關[3]。已有研究表明,ABCG轉運蛋白通過減少體內毒素的累積成為抵抗外源物質的重要防線[4-5]。近年來,ABCG轉運蛋白在水生動物中被發(fā)現(xiàn)和克隆,驗證了ABCG作為外源物質轉運體,將體內的有害物質及時轉運出體外,證明ABCG具有減少機體損傷的功能[6-8]。

三疣梭子蟹Portunus trituberculatus生長迅速、養(yǎng)殖利潤豐厚,已成為中國沿海地區(qū)重要的養(yǎng)殖品種之一。氟苯尼考(Florfenicol,FLR)是一種人工合成的新型抗菌藥(氯霉素替代品),既能保持氯霉素抗菌活性又能減少氯霉素造成人類再生障礙性貧血的不良副作用,是世界水產養(yǎng)殖中最常用的抗菌藥物。趙青松等[9]研究表明,氟苯尼考能有效預防和治療三疣梭子蟹因弧菌引起的感染。氟苯尼考在病害防治方面起到積極作用的同時,也存在著潛在的危害,藥物殘留及細菌耐藥性在施藥過程中會不斷產生,因此,對此藥需要合理使用,以保障養(yǎng)殖水產品的質量安全。為探討三疣梭子蟹ABCG對氟苯尼考的轉運代謝作用,本研究中采用RACE技術首次成功獲得了ABCG基因全長cDNA序列,對其生物學進行了分析,并采用實時熒光定量PCR法研究了氟苯尼考對ABCG基因在不同組織中表達量的影響,旨在為深入研究ABCG的結構、功能奠定基礎,為揭示甲殼動物ABCG轉運蛋白對抗生素的轉運機制提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

試驗用三疣梭子蟹體質量為(30依5)g,選擇健康個體,暫養(yǎng)于黃海水產研究所實驗基地濰坊昌邑海豐水產養(yǎng)殖有限公司,養(yǎng)殖水泥池面積為30 m3(4.0 m伊5.0 m伊1.5 m),養(yǎng)殖密度為30只/池,水深為(30~35)cm,水溫為(25.0依0.5)益,溶解氧為5.5 mg/L,鹽度為31,pH為8.2,暫養(yǎng)1周。每天定時換水,換水量為總池水的1/3,定時投喂新鮮藍蛤,投喂量為蟹體質量的1/10。

1.2 方法

1.2.1 總RNA的提取及cDNA第一鏈的合成采用Trizol試劑法提取三疣梭子蟹各組織的總RNA,用核酸定量儀(Thermo,NANO DROP-2000)測定純度,用10 g/L瓊脂糖凝膠電泳檢測濃度及完整性。以肝胰腺中提取的總RNA為模板,按照SM-ARTTMRACE Amplification Kit(Clontech)說明書進行3憶和5憶RACE的cDNA第一鏈的合成。

1.2.2 三疣梭子蟹ABCG基因全長cDNA的克隆從實驗室獲得三疣梭子蟹cDNA文庫中ABCG基因的EST序列,經NCBI比對,此序列片段與其他物種的ABCG同源性較高,確定為三疣梭子蟹AB-CG基因序列片段。利用Primer Premier 5.0軟件設計3憶和5憶末端特異性引物。試驗中所用引物由北京睿博興科生物技術有限公司合成(表1)。

表1 試驗中所用引物序列Tab.1Sequence of primers used in this study

利用Advantage 2 PCR Kit(TaKaRa)進行末端擴增,5憶RACE用通用引物UPM和NUP分別與相應的特異性引物ABCG-R1和ABCG-R2進行巢式PCR擴增,3憶RACE用UPM和NUP與相應的特異性引物ABCG-F1和ABCG-F2進行巢式PCR擴增。擴增反應條件為:94益下預變性3min;94益下變性30 s,68益下退火30 s,72益下延伸3 min,共進行25個循環(huán);最后在72益下延伸10 min。將獲得的3憶和5憶RACE擴增產物經瓊脂糖凝膠電泳檢測后,使用NucleoSpin Gel and PCR Clean-Up Kit (TaKaRa)回收純化并連接到PMD18-T載體中,重組質粒轉化到大腸桿菌DH5琢感受態(tài)細胞中,在含AMP和IPTG、X-gal的LB固體培養(yǎng)基中于37益下培養(yǎng)過夜,挑取單一白斑菌落繼續(xù)培養(yǎng)6 h,菌落經PCR鑒定后,將含有目的條帶的菌液送北京睿博興科生物技術有限公司進行測序。最后,在該基因的兩端設計正反向引物yABCG-F和yABCGR,并對全長cDNA進行驗證。

1.2.3 三疣梭子蟹ABCG基因的生物學分析使用DNAStar軟件中的SeqMan程序對測序所得的ABCG cDNA中間片段和3憶、5憶末端序列進行拼接和載體序列去除,得到三疣梭子蟹ptABCG cDNA全序列。利用ExPASy(http://www.expasy.ch/ tools/)和Gene Tool軟件預測開放閱讀框(ORF)和翻譯氨基酸。使用PredictProtein和SMART服務器進行蛋白質理化性質預測、蛋白質功能結構域分析。使用SignalP 4.0在線程序(http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP)進行蛋白信號肽預測。使用Clustal X和DNAMAN軟件對三疣梭子蟹和其他物種的ABCG編碼的氨基酸序列進行比對分析,并用MEGA 6.0軟件以鄰接法(Neighhour-Joining, NJ)構建系統(tǒng)進化樹,1000次Bootstrap重復檢驗進化樹的置信度。

1.2.4 三疣梭子蟹ABCG基因的本體表達及其在氟苯尼考代謝過程中的功能研究選取80日齡三疣梭子蟹從室外養(yǎng)殖池轉移到室內水泥池暫養(yǎng)1周。氟苯尼考的注射劑量依據(jù)《新編漁藥手冊》[10]的推薦劑量和預試驗結果決定。將暫養(yǎng)1周后的三疣梭子蟹隨機分成4組,依次為對照組(生理鹽水[11])、氟苯尼考低劑量組(20 mg/kg)、氟苯尼考中劑量組(40 mg/kg)和氟苯尼考高劑量組(80 mg/kg),每組70只個體。給藥部位為三疣梭子蟹第四步足與體壁關節(jié)膜處的肌肉[12]。在注射氟苯尼考后的1、3、6、12、24、48、72 h,取肝胰腺、肌肉、鰓組織樣品,每一時間點取9只蟹,每3只蟹的組織放入一個凍存管。重取3只不經處理的健康三疣梭子蟹的肝胰腺、鰓、胃、肌肉、腸、心臟、血細胞組織,用于檢測三疣梭子蟹AB-CG基因的本體表達。

按照Trizol法提取三疣梭子蟹各個組織及氟苯尼考脅迫后不同時間點的肝胰腺、鰓、肌肉組織的總RNA,經質量檢測后使用PrimeScriptTMRT rea-gent Kit反轉錄合成cDNA。以DEPC水稀釋3倍作為模板,進行ABCG基因表達量檢測。熒光定量PCR體系(共10滋L)為:cDNA模板1滋L,濃度為10 pmol/滋L的正反向引物q ABCG-F和q ABCGR各0.4滋L(表1),SYBR Premix Ex Taq域5滋L, ROX Reference dye域0.2滋L,DEPC水3滋L。反應程序為:95益下預變性35 s;95益下變性5 s,60益下退火34 s,70益下延伸30 s,共進行40個循環(huán);最后在70益下再延伸5 min。本試驗使用Ap-plied Biosystems 7500 Real-Time PCR儀,以三疣梭子蟹茁-actin基因作為內參(表1),樣本和內參均設3個重復。采用2-吟吟Ct方法[12]計算各組織樣品的ABCG相對表達量。

1.3 數(shù)據(jù)處理

試驗數(shù)據(jù)采用平均值依標準差(mean依S.D.)表示,使用SPSS 19.0軟件進行單因素方差分析,用Duncan蒺s法進行多重比較,顯著性水平設為0.05。

2 結果與分析

2.1 三疣梭子蟹ABCG基因的全長cDNA序列

本試驗中采用RACE技術首次成功獲得三疣梭子蟹ABCG基因全長cDNA序列,命名為ptABCG (GenBank登錄號:KY242401)。該基因全長為2473 bp,包括1747 bp的開放閱讀框(ORF),25 bp的5憶非編碼區(qū)(5憶UTR)和701 bp的3憶非編碼區(qū)(3憶UTR)。3憶端存在多聚腺甘酸的加尾信號(AATAA)和Poly(A)尾。用Blast比對顯示, ptABCG核苷酸序列與凡納濱對蝦ABCG一致性高達72.94%,說明該序列為三疣梭子蟹ABCG基因。

2.2ptABCG蛋白的生物信息學分析

采用PredictProtein軟件預測,三疣梭子蟹AB-CG基因編碼一個由578個氨基酸組成的多肽,相對分子質量為65 720,理論等電點為8.13。該蛋白包括53個酸性氨基酸(DE),56個堿性氨基酸(RK),217個疏水性氨基酸(AILFWV),157個極性氨基酸(NCQSTY),脂溶系數(shù)為94.57,親水指數(shù)(GRAVY)為0.081。使用SignalP 4.0程序進行信號肽預測分析,結果顯示,該蛋白序列不含有信號肽。用SMART在線軟件對結構功能域分析,結果顯示,該蛋白具有ABCG轉運蛋白的基本結構特征,具有1個疏水性跨膜區(qū)(TMD)和1個核苷酸結合區(qū)(NBD)。使用TMpred工具對TMD進行跨膜性質預測,結果顯示,存在由內向外和由外向內的兩種跨膜螺旋,僅采用分值大于500的可信度高的跨膜模型有13個(表2),表明ptABCG基因是典型的跨膜結構。如圖1所示, NBD包含了ABCG亞家族的保守序列:ATP結合位點、ABC轉運體家族標記序列(ABC transporters family signature)、Walker A(P環(huán))、Walker B、D環(huán)、H環(huán)和Q環(huán)等。

表2 三疣梭子蟹ABCG預測跨膜區(qū)位置Tab.2Sites of transmembrane domain in sw imm ing crab Portunus trituberculatus

2.3 ptABCG基因序列同源性及系統(tǒng)進化分析

使用Clustal X和DNAMAN軟件分析ptABCG編碼的氨基酸序列的同源性,發(fā)現(xiàn)其與凡納濱對蝦Litopenaeus vannamei、中國對蝦Fenneropenaeus chinensis、家蠶Bombyx mori、切葉蟻Acromyrmex echinatior、果蠅Drosophila elegans的一致性分別為72.94%、66.54%、43.33%、39.31%、24.01% (圖2)。使用MEGA 6.06軟件進行系統(tǒng)進化分析,結果表明,三疣梭子蟹與凡納濱對蝦、中國對蝦緊密聚為一支,親緣關系較近,與節(jié)肢動物的昆蟲綱聚為一大支,與斑馬魚Danio rerio和人Homo sapi-ens關系較遠(圖3)。

2.4 ptABCG基因的本體表達

根據(jù)獲得的ptABCG基因全長cDNA序列設計熒光定量特異引物q ABCG-F和q ABCG-R(表1),并采用RT-PCR方法檢測三疣梭子蟹7種組織中ABCG基因的本體表達情況。結果顯示:ptABCG在7種組織中均有表達,表達量最高的是肝胰腺,其次是腸和心臟,血細胞中的表達量最低(圖4)。

圖1 三疣梭子蟹ABCG蛋白結構域分析圖Fig.1SMART diagram of ABCG am ino acid sequences in sw imm ing crab Portunus trituberculatus

圖2 三疣梭子蟹ABCG編碼的氨基酸序列與其他物種氨基酸序列的比對Fig.2Comparison of am ino acid sequences coded by ABCG in sw imm ing crab Portunus trituberculatus w ith other animals

2.5 氟苯尼考對ptABCG基因組織表達量的影響

從圖5可見,氟苯尼考對三疣梭子蟹3種組織ABCG的表達均具有誘導作用,呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢,且呈一定的劑量效應關系。在肝胰腺中,中、高劑量組ABCG表達量均被顯著誘導(P< 0.05),高劑量組表達量于6 h時達最高值,隨著時間的延長,中、高劑量組表達量在整個試驗過程中均高于對照組,低劑量組則與對照組無顯著性差異(P>0.05)。鰓中,ABCG在低、中、高劑量組的表達量,分別于給藥后的6、6、12 h時達峰值。肌肉中,給藥6 h內與對照組相比,低、中、高劑量組的氟苯尼考對ABCG在的表達呈顯著的誘導作用(P<0.05),隨后誘導作用逐漸降低。

圖3 采用鄰接法構建的三疣梭子蟹與其他物種的AB-CG氨基酸序列的系統(tǒng)進化樹Fig.3NJ phylogenetic tree of am ino acid sequences of ABCG in sw imm ing crab Portunus tritubercula-tus and other species

圖4ABCG基因在三疣梭子蟹不同組織中的本體表達Fig.4Relative expression of ABCG in different tissues of sw imm ing crab Portunus trituberculatus

圖5 氟苯尼考對三疣梭子蟹肝胰腺、鰓和肌肉組織中ABCG基因表達的影響Fig.5Effect of florfenicol on ABCG relative expression in the hepatopancreas,gill and muscle of sw im-m ing crab Portunus tritubercu latus

3 討論

3.1 ABCG轉運蛋白的結構與功能

ABC轉運蛋白是膜整合蛋白,它利用水解ATP的能量對胞質中各種生物分子進行跨膜轉運,并依據(jù)結構不同分為全轉運子和半轉運子[13],全轉運子含2個TMD和2個NBD,而半轉運子只含1個TMD和1個NBD[3]。已知的ABCG亞家族包括5個半轉運子,其中ABCG2基因是一種多藥耐藥基因,而ABCG1、ABCG4、ABCG5和ABCG8與激素和膽固醇的轉運相關[14-15]。生物學分析表明,三疣梭子蟹ABCG編碼的蛋白質具有ABCG轉運蛋白的基本結構特征:1個跨膜結構域,位于C端; 1個NBD(Walker A、Walker B、Q環(huán)、H環(huán)等),位于N端。跨膜結構域是藥物轉運的通道,核苷酸結合區(qū)是ATP的結合位點[16]。ptABCG具有由內向外和由外向內兩種跨膜螺旋,是典型的跨膜轉運特征,依賴水解ATP獲得的能量進行物質運輸、離子轉運[17-19]。該基因編碼的蛋白質氨基酸與甲殼動物中的中國對蝦和凡納濱對蝦同源性最高,在系統(tǒng)進化樹中也與對蝦科聚為一支,親緣關系最近。由此表明,本研究中克隆得到的ABCG基因屬于三疣梭子蟹ABCG基因。

3.2 ABCG基因的表達情況及其在抗生素代謝轉運方面的作用

對ABCG基因在不同物種各組織中表達情況的研究表明,ABCG表達不僅存在顯著的種屬差異性,還表現(xiàn)出組織器官差異性。在人和小鼠等哺乳動物中,ABCG基因在腦和眼睛中的分布相對比較集中[20-21];在昆蟲中,中腸、脂肪體和表皮的AB-CG基因含量比較豐富[22-23];在魚類中,肝和腦組織中表現(xiàn)出較高的轉錄水平[6,24]。本試驗結果顯示,三疣梭子蟹ABCG基因在各組織中表達量最高的是肝胰腺,依次為腸、心臟、鰓、胃、肌肉和血細胞。這與Zhou等[8]對凡納濱對蝦ABCG表達水平的研究結果相似,即表達量最高的為肝胰腺,其次為腸。三疣梭子蟹肝胰腺中含有藥物解毒代謝的重要酶類,如氨基比林-N-脫甲基酶(APND)、谷胱甘肽S-轉移酶(GST)等[25],ptABCG在肝胰腺中的高表達,也進一步證實了肝胰腺是三疣梭子蟹最主要的解毒代謝器官。

關于外源物質在生物體內代謝過程的研究表明,外源物質進入生物體后先經玉相代謝作用轉化為玉相中間產物,在域相代謝酶(GST)作用下與內源物質分子谷胱甘肽(GSH)結合將其排出體外[26]。ABC轉運蛋白在外源化合物代謝中具有非常重要的作用,但是關于ABC轉運蛋白對漁用抗生素轉運代謝方面的研究非常有限。胡鯤等[27]報道了尼羅羅非魚Oreochomis niloticus Linn肝、腎組織中P-糖蛋白(P-gp)參與恩諾沙星的藥物代謝過程。Chang等[7]研究表明,中國對蝦ABCG蛋白對諾氟沙星具有轉運代謝的功能。本研究中探討了三疣梭子蟹ABCG轉運蛋白在氟苯尼考的轉運代謝過程中的作用,結果顯示,不同濃度(20、40、80 mg/kg)氟苯尼考對三疣梭子蟹肝胰腺、鰓、肌肉中ABCG的表達均具有誘導作用,呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢,并有一定的時間劑量效應。其中,肝是主要的解毒場所,對藥物具有生物轉化功能, ABCG活性一直處于較高的表達狀態(tài)。劉勝男[28]對氨氮脅迫下三疣梭子蟹解毒代謝機制的研究表明,鰓中相關解毒代謝酶和基因在脅迫下誘導表達。本試驗中,三疣梭子蟹鰓中ABCG表達量在注射氟苯尼考后12 h不斷提高,表明鰓在藥物代謝過程中也發(fā)揮一定作用,但其表達量較肝胰腺低。氟苯尼考對肌肉ABCG活性的誘導作用在注射后立刻出現(xiàn),可能與肌肉給藥方式有關。本試驗結果與陳玲珍等[29]對不同劑量氟苯尼考在中華絨螯蟹體內的藥物代謝動力學研究結果相吻合。由此可以推斷,三疣梭子蟹ABCG轉運蛋白能及時將體內殘留的氟苯尼考及代謝產物轉運出體外,防止藥物在體內不斷累積造成損傷。

近年來,雖然對水生生物ABC轉運蛋白的相關研究較多,但關于ABC轉運蛋白的跨膜方式、ATP水解機制、TMD與NBD間的信號傳遞路徑及轉運機制等關鍵問題仍需深入研究[3]。對ABC蛋白的藥物轉運機制進行深入探討,揭示藥物作用和代謝機制,可提高藥物療效,對健康養(yǎng)殖及水產食品安全均具有重要的意義。

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Effects of florfenicol on relative expression of ATP-binding cassette transporter gene(ABCG)in different tissues of sw imm ing crab Portunus trituberculatus

YU Xuan1,2,REN Xian-yun2,LIJian2,LIU Ping2,GAO Bao-quan2,LIU Jiu-mei1,2,DOU Quan-wei1,2
(1.College of Fisheries and Life Science,Dalian Ocean University,Dalian 116023,China;2.Yellow Sea Fisheries Research Institute,Chinese Acad-emy of Fishery Sciences,Qingdao 266071,China)

ATP-binding cassette transporter genewas cloned in swimming crab Portunus trituberculatus by a RACE method and the gene expression of ABCG was in hepatopancreas,gill and muscle of swimming crab with intramus-cular injection of flofenicol ata dose of20,40 and 80mg/kg to evaluate effects of florfenicol on the gene expression of ABCG in different tissues of swimming crab by fluorescent quantitative PCR.Results showed the full-length of ABCG cDNA of swimming crab(ptABCG)was shown to be 2473 bp encoding a polypeptide of 578 amino acids. Bioinformatics analysis indicated that ptABCG,without signal peptide,sharedmany similaritieswith the ABC trans-membrane transporter,including two conserved regions:a highly conserved nucleotide binding domains(NDB) and a transmembrane domain(TMD).Homology and phylogenetic analysis revealed that the amino acid sequence of ptABCG shared a high similarity with Chinese shrimp Fenneropenaeus chinensis and Pacific white leg shrimp Litopenaeus vannamei.The gene expression of ptABCG was up-regulated in hepatopancreas,gill and muscle after intramuscular injection of different doses of florfenicol,showing time-dose effect.It is speculated that the ptABCG protein may involve in themetabolism of florfenicol in swimming crab.

Portunus trituberculatus;ATP-binding cassette transporter;gene cloning;florfenicol;fluorescent quantitative Real-time PCR

S968.25

A

10.16535/j.cnki.dlhyxb.2017.03.001

2095-1388(2017)03-0255-07

2016-12-08

國家自然科學基金青年基金資助項目(41506166);泰山領軍人才工程高效生態(tài)農業(yè)創(chuàng)新類計劃項目(LJNY2015002)

于旋(1991—),女,碩士研究生。E-mail:yuxuan114220@163.com

李健(1961—),男,研究員。E-mail:lijian@ysfri.ac.cn