納米級液態(tài)氟碳靶向超聲造影劑的制備及體外尋靶的實驗研究

石 紅 楊彥輝 劉 健 李 楊 余進洪

納米級液態(tài)氟碳靶向超聲造影劑的制備及體外尋靶的實驗研究

石 紅 楊彥輝 劉 健 李 楊 余進洪

目的 制備一種新型的具備特異性肝細胞靶向性能的超聲造影劑，即攜半乳糖化多聚賴氨酸（Gal-PLL）的脂質(zhì)包裹的納米級液態(tài)氟碳微球超聲造影劑，并研究其在體外肝細胞的尋靶能力。方法應用還原胺化法優(yōu)化制備肝臟去唾液酸糖蛋白受體的配體Gal-PLL，將其磷脂膜洗脫下來并逐滴加入液態(tài)氟碳，通過超聲波細胞粉碎機進行振蕩獲得目標造影劑，并觀察其形態(tài)，檢測其粒徑和電位。將靶向造影劑和非靶向造影劑分別滴入貼壁生長的正常大鼠肝細胞及正常人肝細胞中，比較觀察兩組造影劑與肝細胞的靶向效果。結(jié)果成功制備Gal-PLL，并合成了靶向納米液態(tài)氟碳脂質(zhì)微球超聲造影劑，電鏡下其形態(tài)圓整、大小均一，性質(zhì)穩(wěn)定，平均粒徑200nm，平均電位35mV。制備的靶向納米液態(tài)氟碳脂質(zhì)微球超聲造影劑能靶向聚集于體外正常大鼠肝細胞和正常人肝細胞周圍。結(jié)論自制攜Gal-PLL的脂質(zhì)包裹的納米級液態(tài)氟碳微球超聲造影劑具有性質(zhì)穩(wěn)定、靶向性等優(yōu)點，為今后實時在體監(jiān)測并定量評估肝臟損傷程度的超聲顯影研究提供了前期基礎。

超聲檢查；造影劑；納米級；液態(tài)氟碳；靶向性；肝細胞；大鼠

近年來，超聲造影已逐漸向分子成像技術(shù)研究領域開拓［1］，靶向超聲造影劑及其靶向顯影技術(shù)已成為分子影像學的重要研究內(nèi)容［2］，隨著生物納米技術(shù)的迅猛發(fā)展，新型納米級造影劑也為分子影像學的發(fā)展提供了無限前景［3］。去唾液酸糖蛋白受體（asialoglycoprotein receptor，ASGPR）也稱半乳糖受體，是哺乳動物肝實質(zhì)細胞膜表面特有的內(nèi)吞受體，能高效、特異性地識別血清中帶有半乳糖殘基末端的糖蛋白，并與其結(jié)合［4］。這種受體-配體的特異親和能力為本實驗提供了生物分子基礎。本實驗制備出具有肝細胞靶向性能的納米級液態(tài)氟碳脂質(zhì)微球超聲造影劑，通過體外尋靶實驗評價其靶向能力及靶向顯影效果，旨在為后續(xù)評估肝臟儲備功能和肝臟受體表達量的實驗提供依據(jù)。

材料與方法

一、實驗材料

1.實驗試劑：D-半乳糖、多聚賴氨酸（Poly-LLysine，PLL）、硼氫化鈉、二棕櫚酰磷脂酰膽堿（DPPC，美國Echelon公司），帶有活化氨基的二硬脂酰磷脂酰乙醇胺（DSPE-020PA，美國Avanti公司），膽固醇（北京J&K公司），三氯甲烷（川北醫(yī)學院醫(yī)學影像研究所提供），液態(tài)氟碳（上海笛柏化學品技術(shù)有限公司），Hoechst 33342 DNA熒光染料、DiI紅色熒光探針（碧云天生物技術(shù)研究所）。

2.實驗細胞：大鼠正常肝細胞（BRL），人正常肝細胞（L02），均由四川大學華西醫(yī)學中心醫(yī)學與分子實驗室提供。

3.儀器：葡聚糖凝膠柱G-25、磁力攪拌器（川北醫(yī)學院醫(yī)學影像研究所提供）；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（上海亞榮生化儀器廠）；超聲波細胞粉碎機（寧波新藝超聲設備有限公司）；激光粒度儀及電位儀（英國馬爾文儀器有限公司）；光學顯微鏡（川北醫(yī)學院醫(yī)學影像研究所提供）；激光共聚焦顯微鏡（川北醫(yī)學院風濕免疫研究所提供）。

二、實驗方法

1.ASGPR配體即半乳糖化多聚賴氨酸（Gal-PLL）的優(yōu)化配制：采用還原胺化法［5］，將D-半乳糖和PLL按照6∶1的摩爾比溶于6 ml PBS緩沖溶液中，均勻振蕩10 min后，加入與D-半乳糖摩爾數(shù)等量的硼氫化鈉，室溫下避光反應24 h。最后用葡聚糖凝膠柱G25對其進行分離純化，檢測Gal-PLL的合成情況。

2.靶向納米液態(tài)氟碳脂質(zhì)微球超聲造影劑的制備：將DPPC、DSPE-020PA、膽固醇按照5∶2∶1的質(zhì)量比稱取至小燒杯中，加入5 ml三氯甲烷，用透明膜封緊杯口，置于磁力攪拌器進行振蕩，待磷脂粉末完全溶于三氯甲烷后，再將溶液轉(zhuǎn)移至圓底燒瓶，連接旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，50℃恒溫旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)成膜。吸取已制備成功的Gal-PLL溶液6 ml加入圓底燒瓶內(nèi)，置于45℃水浴箱內(nèi)振蕩，待磷脂膜完全洗脫溶解下，DSPE-020PA的氨基末端與Gal-PLL的羧基末端發(fā)生縮合反應而連接在一起，轉(zhuǎn)移至離心管內(nèi)。向離心管內(nèi)逐滴加入1 ml液態(tài)氟碳，同時超聲波細胞粉碎機振蕩4 min（每次8 s，間隔2 s，循環(huán)振蕩24次，功率30%），振蕩同時搖勻離心管。將制備成功的造影劑置于4℃冰箱內(nèi)保存，吸取少量造影劑置于顯微鏡下觀察其形態(tài)是否發(fā)生改變。

3.靶向納米液態(tài)氟碳脂質(zhì)微球超聲造影劑理化性質(zhì)檢測：吸取少量制備成功的靶向造影劑，用PBS緩沖液稀釋后置于電子顯微鏡下觀察其形貌、密度及大小，并采用馬爾文激光粒度儀檢測其粒徑及電位。

4.靶向納米液態(tài)氟碳脂質(zhì)微球超聲造影劑與正常肝細胞的靶向?qū)嶒?/p>

（1）細胞培養(yǎng)與處理：用含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液5%CO2、37℃孵箱內(nèi)培養(yǎng)BRL細胞，含10%胎牛血清的1640培養(yǎng)液5%CO2、37℃孵箱內(nèi)培養(yǎng)L02細胞，分別接種于激光共聚焦專用玻底培養(yǎng)皿各兩瓶，培養(yǎng)24～36 h。對以上細胞進行Hoechest 33342 DNA藍色熒光染色10 min，PBS溶液清洗3遍。

（2）靶向納米液態(tài)氟碳脂質(zhì)微球超聲造影劑的處理：靜置已制備好的靶向造影劑30 min，吸取上清液500 μl加入離心管內(nèi)，進行DiI磷脂膜紅色熒光染色10 min，離心3 min（3000轉(zhuǎn)/min）。再吸出上清液，加入2 ml PBS溶液洗滌造影劑，反復洗滌、離心3次。

（3）體外尋靶實驗：①實驗組分別吸取0.5 ml已染色成功的靶向造影劑加入已完成DNA染色的BRL細胞和L02細胞培養(yǎng)皿中；②對照組分別吸0.5ml取非靶向造影劑（未連接Gal-PLL）加入BRL細胞和L02細胞培養(yǎng)皿中。然后置于孵箱內(nèi)，30min后取出所有培養(yǎng)皿，PBS溶液沖洗3遍，置于普通電子顯微鏡和激光共聚焦顯微鏡下觀察造影劑與細胞的結(jié)合情況。

結(jié)果

一、Gal-PLL的配制

經(jīng)還原胺化法反應樣本分離純化出大量大分子復合物，僅有微量游離物未被結(jié)合（圖1），當D-半乳糖與還原劑摩爾比為1∶1時，反應合成的Gal-PLL與游離組分的曲線分離明顯，D-半乳糖與多聚賴氨酸偶聯(lián)效果較好，反應合成的化合物量大，成功提取出適用的目標配體Gal-PLL。

二、靶向納米液態(tài)氟碳脂質(zhì)微球超聲造影劑的理化性質(zhì)

普通光學顯微鏡下觀察自制的新型攜Gal-PLL的肝靶向納米液態(tài)氟碳脂質(zhì)微球超聲造影劑，大小均一、形態(tài)圓整（圖2）。馬爾文激光粒度儀測得其粒徑140～260 nm，平均200 nm（圖3）；電位20～45 mV，平均35 mV（圖4）。

三、靶向納米液態(tài)氟碳脂質(zhì)微球超聲造影劑與正常肝細胞的靶向?qū)嶒灲Y(jié)果

普通光學顯微鏡下，實驗組靶向納米液態(tài)氟碳脂質(zhì)微球超聲造影劑充分聚集在BRL及L02細胞的細胞膜周圍，而對照組非靶向液態(tài)氟碳造影劑則均未與BRL及L02細胞結(jié)合（圖5，6）。激光共聚焦顯微鏡下，兩組均可見紅色熒光靶向造影劑圍繞藍色熒光BRL、L02細胞的細胞核周圍（圖7）。

圖1 Gal-PLL 分離純化結(jié)果

圖2 光鏡下靶向納米PFOB脂質(zhì)微球超聲造影劑的形態(tài)（×400）

圖3 靶向納米液態(tài)氟碳脂質(zhì)微球超聲造影劑平均粒徑為200 nm

圖4 靶向納米液態(tài)氟碳脂質(zhì)微球超聲造影劑平均電位為35 mV

圖5 兩組造影劑在光鏡下BRL細胞膜周圍的聚集情況（×200）

圖6 兩組造影劑在光鏡下L02細胞膜周圍的聚集情況（×200）

討論

圖7 激光共聚焦顯微鏡下靶向造影劑在BRL和L02細胞核周圍的聚集情況（×630）

目前超聲造影對肝臟腫瘤等占位性病變的診斷價值已達成共識［6-7］，但其在慢性肝病的分級及肝功能的定量評估中缺乏確切的標準和依據(jù)。隨著影像技術(shù)在分子生物和細胞水平的實驗研究不斷深入，期望通過制備納米級肝靶向性超聲造影劑，實時、無創(chuàng)地對肝臟儲備功能進行在體監(jiān)測，對慢性肝病做出定性、定量評估。ASGPR顯像劑對肝臟疾病的早期診斷、指導治療及評價預后具有重要臨床意義［8］，成為了靶向肝細胞的首選媒介［9］。當肝細胞受損時，ASGPR數(shù)量隨之減少，結(jié)合半乳糖基糖蛋白的能力也隨之下降，由此可對不同程度肝損傷的超聲造影結(jié)果進行定量分析和評估，這將是今后實時在體監(jiān)測并定量評估肝臟損傷程度的超聲顯影研究方向。本實驗成功制備了具有肝細胞靶向功能的超聲造影劑，并通過體外尋靶實驗評價其靶向能力及靶向顯影效果，為后續(xù)評估肝臟儲備功能和肝臟受體表達量的實驗提供依據(jù)，這是解決特異性配體的優(yōu)化制備、造影劑原料的選擇問題的關鍵。

李崇輝等［10］深入研究了Gal-PLL的肝靶向特征，以還原胺化法合成了Gal-PLL，并首次利用放射性失蹤實驗測定了Gal-PLL在小鼠體內(nèi)的肝靶向特征，認為Gal-PLL不僅具有較高的肝靶向性能，且在合成和應用方面，較ASGPR的天然配體更具優(yōu)勢。根據(jù)這一特點，本實驗探索了底物與還原劑的優(yōu)化配比及實驗反應條件，成功合成出高效ASGPR人工配體Gal-PLL。

本實驗中，在造影劑原料上，根據(jù)周洋等［11］報道的方法成功制備了脂質(zhì)包裹的納米液態(tài)氟碳微球造影劑，其具有直徑小、數(shù)量多且大小均勻等特點。該造影劑是將液態(tài)氟碳與脂質(zhì)通過微液化技術(shù)所得，液態(tài)氟碳在室溫下呈液態(tài)的特性使其對空氣暴露、熱和剪切應力、壓力等相對穩(wěn)定，應用較為便捷。其脂質(zhì)被膜的DSPE-020PA成分末端經(jīng)過氨基修飾后可與Gal-PLL中的羧基發(fā)生縮合反應，成為靶向肝細胞的載體［12］。

本實驗體外細胞尋靶結(jié)果證實，自制的靶向納米級液態(tài)氟碳脂質(zhì)微球?qū)Ω渭毎哂邪邢蚬δ?，且靶向效果較為理想。但對于肝臟超聲顯影效果力求明確、精準，才能為后期肝臟儲備功能的評估提供更為確切、定性、定量的信息，故今后在靶向造影劑的制備上需做進一步優(yōu)化，以增加造影劑的靶向性能。且本實驗自制配體Gal-PLL的化學鍵尚未得到證實，其穩(wěn)定性也有待考究，其在靶向過程中化學性質(zhì)是否改變及其對肝靶向作用是否存在影響等均是本實驗存在的問題，在今后的實驗中將會針對配體的性質(zhì)及其肝靶向條件做進一步研究，以取得最佳靶向環(huán)境和效果。

綜上所述，自制攜Gal-PLL的脂質(zhì)包裹的納米級液態(tài)氟碳微球超聲造影劑具有性質(zhì)穩(wěn)定、靶向性等優(yōu)點，為今后實時在體監(jiān)測并定量評估肝臟損傷程度的超聲顯影研究提供了前期基礎。

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The manufacture of a novel ultrasound contrast agent：hepatocyte targeted perfluorocarbon lipid nanoparticle，and its targeting study in vitro of liver

SHI Hong，YANG Yanhui，LIU Jian，LI Yang，YU Jinhong
Department of Function，the First People’s Hospital of Neijiang，Sichuan 641000，China

Objective To prepare a new type of ultrasound contrast agent，perfluorooctyl bromide lipid nanoparticle with Galactocylated Poly-L-Lysine（Gal-PLL），and study the ability of this contrast for hepatocyte targeting in vitro. Methods The preparation of high-efficiency Gal-PLL ligand of the asialoglycoprotein receptor in liver was optimized by chemical reactions of reductive amination.Lipid membrane prepared before was eluted with Gal-PLL，adding perfluorocarbon in it，then objective ultrasound contrast agent was prepared by means of ultrasonic cell disruptor agitation，its feature was observed，the grain diameter and electric potential were detected.Targeting contrast agent and non-targeting contrast agent were instilled into normal adherence growth rat hepatocyte BRL and human hepatocyte L02，respectively.The targeting effect of the contrast agent for both rat hepatocyte BRL and human hepatocyte L02 were observed and compared.ResultsHigh-efficiency Gal-PLL ligand of the asialoglycoprotein receptor for hepatocyte and novel ultrasound contrast agent-perfluorooctyl bromide lipid nanoparticle were successfully prepared.The contrast agent was round with size stability（the average diameter was 200 nm），under the electron microscope，meanwhile，with stable property.Its average electric potential was 35 mV.The contrast agent flocked together around the rat hepatocyte BRL and human hepatocyte L02 cells.ConclusionThe self-perpared novel ultrasound contrast agent，perfluorooctyl bromide lipid nanoparticle，is stable in property with targeting function for hepatocyte.This novel contrast may be used for evaluation on liver damage degree quantitatiely in real time in future.

Ultrasonography；Contrast agent；Nanoparticle；Lipid perfluorocarbon；Targeted；Hepatocyte；Rat

R445.1

A

2016-11-01）

國家自然科學基金青年基金項目（31300688）

641000 四川省內(nèi)江市，內(nèi)江市第一人民醫(yī)院功能科（石紅），胸外科（楊彥輝）；川北醫(yī)學院附屬醫(yī)院超聲科（劉健、余進洪），放射科（李楊）

余進洪，Email：525293623@qq.com