鐵觀音黃片和茶末體外抗人乳腺癌作用研究

林 玲，黃杰榮，魯 靜，張魯榕，林金科，*

（1.福建農(nóng)林大學(xué)園藝學(xué)院，福建福州350002；2.福建農(nóng)林大學(xué)安溪茶學(xué)院，福建泉州362000；3.福建省臨床醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)平臺；4.福建省個體化主動免疫治療重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室；5.福建省放射生物福建省高校重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，福建福州350005）

鐵觀音黃片和茶末體外抗人乳腺癌作用研究

林 玲1，黃杰榮1，魯 靜2，張魯榕3，4，5，林金科1，2*

（1.福建農(nóng)林大學(xué)園藝學(xué)院，福建福州350002；2.福建農(nóng)林大學(xué)安溪茶學(xué)院，福建泉州362000；3.福建省臨床醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)平臺；4.福建省個體化主動免疫治療重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室；5.福建省放射生物福建省高校重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，福建福州350005）

本文研究鐵觀音黃片和茶末體外抗人乳腺癌MDA-MB-468細(xì)胞的作用。以鐵觀音按照1:25的茶水比進(jìn)行浸提30min的茶湯為原始濃度的試驗(yàn)樣品，利用MTT法測定人乳腺癌細(xì)胞增殖抑制率，流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡比例并進(jìn)行凋亡相關(guān)蛋白的檢測。結(jié)果表明：鐵觀音黃片和茶末均能抑制乳腺癌MDA-MB-468細(xì)胞的增殖，其干預(yù)MDA-MB-468細(xì)胞48h的IC50分別為終濃度稀釋119.87±12.22倍和117.56±21.73倍。用其IC50濃度進(jìn)行誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡試驗(yàn)，表明了該兩種品類鐵觀音副產(chǎn)品均能顯著提高M(jìn)DA-MB-468細(xì)胞的凋亡比例，且這兩種鐵觀音副產(chǎn)品均是通過促進(jìn)Caspase 9和Caspase 3蛋白的活化來誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的。

鐵觀音；乳腺癌；細(xì)胞凋亡；作用機(jī)制

乳腺癌是當(dāng)今世界癌癥死亡率較高的疾病，是女性最常見的惡性腫瘤，其發(fā)病率已位居女性惡性腫瘤的首位[1]。目前其治療手段主要以外科手術(shù)為主的綜合治療，并輔以化療藥物。但由于化療藥物的毒副作用、耐藥性等因素，嚴(yán)重影響化療的療效，并在一定程度上降低了患者生存質(zhì)量[2]。近年來，對茶葉保健功效的研究如火如荼，其抗癌作用也是研究的熱點(diǎn)之一。茶葉中的EGCG、茶多酚和茶氨酸等多種成分都被報道具有良好的抗癌作用[3-7]。但以茶湯作為研究對象的報道確極少見。鐵觀音茶是中國的十大名茶之一[8-11]，其在福建茶產(chǎn)業(yè)中占有重要地位，但其在抗乳腺癌的作用方面尚未明確。所以本文選取了鐵觀音產(chǎn)業(yè)鏈中兩種副產(chǎn)品，黃片和茶末，探索其對乳腺癌MDAMB-468細(xì)胞的作用，為鐵觀音副產(chǎn)品綜合利用、拓寬茶葉在抗癌方面的功效研究提供參考價值。

1 實(shí)驗(yàn)材料與方法

1.1 材料

鐵觀音黃片和茶末由安溪縣桃源有機(jī)茶場有限公司提供。

MDA-MB-468細(xì)胞株購于中國科學(xué)院上海細(xì)胞所。

試劑：胎牛血清（FBS）、DMEM高糖培養(yǎng)基、青鏈霉素溶液、胰蛋白酶、（美國Hyclone公司），RIPA裂解液、Marker、SDS-PAGE蛋白上樣緩沖液、超敏ECL化學(xué)發(fā)光試劑盒（上海碧云天生物技術(shù)有限公司），凋亡檢測試劑盒（南京凱基生物科技發(fā)展有限公司），兔抗人β-actin蛋白多克隆抗體、兔抗人Caspase 3蛋白多克隆抗體（武漢三鷹生物技術(shù)有限公司），鼠抗人Caspase 9蛋白多克隆抗體（英國Rab MAb公司），MTT（北京索萊寶科技有限公司）。

儀器：倒置相差顯微鏡（日本Olympus），臺式冷凍離心機(jī)（美國Beckman），CO2培養(yǎng)箱（美國Thermo），化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)（美國Protein Simple），酶標(biāo)儀（美國Thermo），生物潔凈工作臺（蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司），-70℃低溫冰箱（日本SANYO）。

1.2 方法

鐵觀音黃片和茶末按1:25的茶葉重量與水體積比，用沸水在98℃的水浴鍋中浸提30min，濾紙過濾、冷卻后，用0.22um的過濾器進(jìn)行過濾除菌、分裝，-20℃保存，即為相應(yīng)的鐵觀音黃片和茶末原濃度試驗(yàn)樣品。

細(xì)胞培養(yǎng)：人乳腺癌MDA-MB-468細(xì)胞使用含10%胎牛血清、青霉素與鏈霉素各l00U/ml的DMEM高糖培養(yǎng)液培養(yǎng)，置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。待細(xì)胞生長至70%～80%后，用0.25%的胰酶消化傳代[12]。

MTT法檢測細(xì)胞增殖：取生長狀態(tài)良好的對數(shù)生長期MDA-MB-468細(xì)胞，制成細(xì)胞懸液，調(diào)整細(xì)胞濃度為2×104個/ml，利用排槍每孔接種150ul于96孔板中。置于37℃，5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，待細(xì)胞貼壁后加入50ul用完全培養(yǎng)液稀釋的茶湯試驗(yàn)樣品。置于培養(yǎng)箱培養(yǎng)48h后，小心棄去原培養(yǎng)液，每孔加入含有10%MTT（5mg/ml）的完全培養(yǎng)液200ul恒溫培養(yǎng)箱染色4h后，小心吸取上清液，每孔加入150ul DMSO，充分振蕩10min后，用酶標(biāo)儀在490nm處測定各孔的吸光度（OD值），計算細(xì)胞增殖抑制率[13]。

事先對待試驗(yàn)茶湯用完全培養(yǎng)液進(jìn)行稀釋，使得干預(yù)終濃度為原試驗(yàn)茶湯濃度的10，50，100，150，200，250，300倍。各組實(shí)驗(yàn)設(shè)置3個平行孔，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

按照細(xì)胞增殖抑制率（%）=(1—實(shí)驗(yàn)孔OD值/對照孔OD值)×100%，計算各組實(shí)驗(yàn)的細(xì)胞增殖抑制率，并通過SPSS計算出各組實(shí)驗(yàn)IC50所對應(yīng)的相應(yīng)終濃度稀釋倍數(shù)，進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

2.3.2 使用時效。在水產(chǎn)養(yǎng)殖之前，需要定期投放微生物制劑，盡可能將環(huán)境污染因子所造成的影響降至最低。同時使用越早，成效越顯著。在水產(chǎn)養(yǎng)殖后期，水體質(zhì)量相對較差，影響微生物的生長，若在此時才開始運(yùn)用，在短期內(nèi)難以實(shí)現(xiàn)預(yù)期目標(biāo)。根據(jù)相關(guān)資料可知，需要定期應(yīng)用微生物制劑以保持平穩(wěn)的水色與菌藻均衡，在養(yǎng)殖初期需要每周使用1次，后期為了提升水體的透明度，需要每周使用2次，持續(xù)使用兩三次。

流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡：取生長狀態(tài)良好的對數(shù)生長期MDA-MB-468細(xì)胞，制成懸液，調(diào)整細(xì)胞密度為4.5×105個/ml，在6孔板中每孔加入1ml的細(xì)胞懸液。置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，待細(xì)胞貼壁后按照各組MTT中計算的IC50濃度，加入各試驗(yàn)組預(yù)先用完全培養(yǎng)液稀釋后的茶湯25ul，置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48h后，用不含EDTA的胰酶消化收集細(xì)胞，采用Annexin V-FITC法，根據(jù)細(xì)胞凋亡檢測試劑盒說明進(jìn)行操作，用流式細(xì)胞儀進(jìn)行上機(jī)檢測[14]。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

Western blotting檢測凋亡相關(guān)蛋白試驗(yàn)：提取細(xì)胞總蛋白：收集各組茶湯I(xiàn)C50濃度下干預(yù)48h的各組細(xì)胞，蛋白裂解液于冰上裂解細(xì)胞30min后，于4℃，12000rpm離心機(jī)上離心5min，取上清液，用BCA法測定總蛋白濃度，并用裂解液稀釋成相同濃度，加入蛋白上樣緩沖液，充分混勻，沸水浴5min后-20℃保存，待測[15-17]。

取待測蛋白，進(jìn)行電泳1.5h，轉(zhuǎn)膜1h，將蛋白轉(zhuǎn)至PVDF膜上，TBST洗膜2次，5%脫脂奶粉封閉1h，TBST洗膜3次，一抗孵育1h或者4℃冰箱過夜，TBST洗膜3次，二抗孵育1h，TBST洗膜3次，加入發(fā)光液進(jìn)行顯影[15]。

圖像分析，使用Image-J軟件和Excel軟件進(jìn)行光密度值分析。蛋白相對表達(dá)量=蛋白條帶密度/相應(yīng)β-actin條帶密度。

1.3 統(tǒng)計分析

實(shí)驗(yàn)結(jié)果數(shù)據(jù)采用SPSS 22.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)均采用平均值加減標(biāo)準(zhǔn)差（±s）來表示。

2 結(jié)果與分析

鐵觀音黃片和茶末對MDA-MB-468細(xì)胞增殖抑制率的影響均有其稀釋倍數(shù)呈負(fù)相關(guān)關(guān)系，即與茶葉干預(yù)濃度呈正相關(guān)關(guān)系。茶葉濃度越高，對細(xì)胞的增殖抑制越明顯。詳見表1。通過SPSS計算茶葉干預(yù)MDA-MB-468細(xì)胞48h時，其IC50對應(yīng)的茶湯稀釋濃度分別為：黃片組119.87±12.22倍，茶末組117.56±21.73。鐵觀音黃片和茶末的IC50濃度沒有明顯差距，說明了2種鐵觀音副產(chǎn)品對乳腺癌細(xì)胞MDA-MB-468的干預(yù)效果相當(dāng)。

2.2 鐵觀音黃片和茶末對乳腺癌細(xì)胞凋亡的影響

正常組MDA-MB-468細(xì)胞凋亡比例為3.18±0.41%，與正常組對比，黃片組和茶末組的細(xì)胞凋亡比例均顯著增加（P<0.05），分別為18.55±2.08%和19.73±3.09。詳見表2，圖1?？梢婅F觀音黃片和茶末誘導(dǎo)乳腺癌細(xì)胞MDAMB-468凋亡的效果相當(dāng)。

2.3 鐵觀音黃片和茶末對細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)的影響

從圖2和圖3可以看出，鐵觀音黃片和茶末均能顯著提高乳腺癌細(xì)胞MDA-MB-468凋亡相關(guān)蛋白Cleaved-caspase 3和Cleaved-caspase 9的表達(dá)水平（P<0.05）。在Cleaved-caspase3蛋白表達(dá)水平上，黃片組和茶末組的相對表達(dá)水平都提高了2倍以上的。在Cleaved-caspase 9蛋白表達(dá)水平上，黃片組提高了84%，茶末組提高了143%。但對Cleaved-caspase 3和Cleaved-caspase 9兩個蛋白表達(dá)水平的促進(jìn)上，茶末組均比黃片組作用更強(qiáng)。

表1 鐵觀音黃片和茶末對MDA-MB-468細(xì)胞增殖抑制率的影響（%）

表2 鐵觀音黃片和茶末對MDA-MB-468細(xì)胞凋亡的影響（48h，±s）

表2 鐵觀音黃片和茶末對MDA-MB-468細(xì)胞凋亡的影響（48h，±s）

??? ??? ??? ???%? 3.18–0.41 18.55–2.08* 19.73–3.09*

圖1 不同鐵觀音茶對MDA-MB-468細(xì)胞凋亡的影響

圖2 鐵觀音黃片和茶末對MDA-MB-468細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)水平的影響

圖3 鐵觀音黃片和茶末對MDA-MB-468細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)水平的影響

3 討論

在本研究中，鐵觀音黃片和茶末均能有效抑制乳腺癌細(xì)胞MDA-MB-468的增殖，且均通過誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，影響乳腺癌細(xì)胞的正常增殖。該結(jié)果與前人研究茶葉或茶葉單體的抗癌作用結(jié)果一致。尚澤森，馬麗清等[18]研究表明可通過利用EGCG抑制乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞的周期進(jìn)程，抑制乳腺癌細(xì)胞的增殖和遷移。易香華[19]研究普洱茶抑制乳腺癌SHZ-88細(xì)胞及保護(hù)亞基肌誘導(dǎo)的胃癌前病變和放療損傷的作用，其MTT結(jié)果顯示普洱茶呈時間和劑量依賴性顯著抑制SHZ-88細(xì)胞的增殖，流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果表明普洱茶能顯著促進(jìn)SHZ-88細(xì)胞的凋亡和壞死。綜上都表明了茶葉能夠誘導(dǎo)乳腺癌細(xì)胞凋亡，有效抑制乳腺癌細(xì)胞的增殖作用。

Caspase家族在細(xì)胞凋亡的啟動和執(zhí)行階段發(fā)揮著重要作用，其可分為凋亡起始者（如caspases2,8,9,10）和凋亡執(zhí)行者（caspases3,6,7）[20-22]。Caspase 9是內(nèi)源凋亡通路的凋亡啟動起始者，激活Caspase 9進(jìn)而觸發(fā)Caspase級聯(lián)反應(yīng)，活化的Caspase 9即Cleaved-caspase 9對下游的凋亡執(zhí)行者Caspase 3進(jìn)行活化和切割，活化的Caspase 3即Cleaved-caspase 3以細(xì)胞內(nèi)的重要蛋白作為靶點(diǎn)，進(jìn)行水解裂解，導(dǎo)致了細(xì)胞程序性死亡。本研究中，鐵觀音黃片和茶末均能促進(jìn)提高細(xì)胞Caspase 9的活化水平，進(jìn)而發(fā)生Caspase級聯(lián)反應(yīng)，刺激信號通路下游Caspase 3的活化，最終促使乳腺癌MDA-MB-468細(xì)胞的凋亡。該結(jié)果與前人研究茶葉單體對Caspase 3和Caspase 9的作用結(jié)果一致。王旭，強(qiáng)兆艷等[23]研究塞來昔布與茶多酚合用對乳腺癌細(xì)胞細(xì)胞增殖及凋亡的影響，結(jié)果表明塞來昔布和茶多酚單用及合用均能上調(diào)Bax、Cleavedcaspase 3、Cleaved-caspase 9蛋白的表達(dá)，下調(diào)Bcl-2蛋白的表達(dá)，兩藥合用具有協(xié)同作用。徐澤平[24]探討茶多酚誘導(dǎo)人乳腺癌MCF-7細(xì)胞凋亡的作用機(jī)理，結(jié)果表明隨著茶多酚濃度的提高，Caspase 3活力逐漸升高，具有時間—劑量依賴性，說明茶多酚可以誘導(dǎo)MCF-7細(xì)胞Caspase 3活化。

通過對鐵觀音黃片和茶末體外抗人乳腺癌細(xì)胞的效果和機(jī)理的研究，為茶葉在保健功效中的療效提供了理論依據(jù)，同時為更好地研究茶葉在體內(nèi)的作用功效提供了研究方向和參考價值。

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安溪縣人民政府科技資助項(xiàng)目（KH1500790，K1515059A）；福建農(nóng)林大學(xué)科技發(fā)展資金（KF2015122）。

林 玲（1990-），女，碩士研究生，主要從事茶葉保健功能研究。

*通訊作者：林金科（1967-），男，教授，主要從事茶深加工與保健、茶資源育種與生物技術(shù)方面研究。E-mail：ljk213@163.com。