CRISPR/Cas系統(tǒng)

李志遠+熊東彥+慕昕

摘 要：CRISPR技術(shù)是近年來興起的繼鋅指核酸酶和TALENs技術(shù)的第三代基因編輯技術(shù)，相比于之前的兩種人工核酸酶，其具有許多無可替代的優(yōu)勢，并已在多種動植物中應(yīng)用。文章就CRISPR系統(tǒng)的發(fā)現(xiàn)、分類、作用機制以及其優(yōu)缺點和對外來應(yīng)用的展望做綜述介紹。

關(guān)鍵詞：CRISPR機制；結(jié)構(gòu)；脫靶

前言

基因編輯指對目標(biāo)基因進行敲除、替換和插入的遺傳操作。最近幾年來基因組定點編輯技術(shù)包括人工核酸酶即鋅指核酸酶、TALENs[1]、CRISPR/Cas系統(tǒng)。鋅指核酸酶是非特異性核酸酶ForkI的切割結(jié)合域與有串聯(lián)鋅指結(jié)構(gòu)的鋅指蛋白融合成的人工核酸酶，串聯(lián)鋅指結(jié)構(gòu)可特異性的結(jié)合DNA序列前者使DNA雙鏈斷裂，產(chǎn)生雙鏈斷裂。TALENs可以與DNA特異性的識別。其也由非特異性核酸酶Fork I和TALE融合而成。要指出的是，以上二者均會產(chǎn)生雙鏈斷裂，而基因組雙鏈斷裂時，會發(fā)DNA損傷修復(fù)機制，包括DNA雙鏈斷裂末端直接連接，其常常會造成連接處堿基突變，如果人為的將缺失部位設(shè)置在外顯子上，可造成移碼突變，實現(xiàn)基因敲除；若利用同源重組，人為加入含同源臂外源DNA，經(jīng)同源重組，將外源同源片段添加到基因組上，即引入了外源基因片段。

CRISPR系統(tǒng)是新興起來的一種基因編輯技術(shù)，它存在于細菌，類似獲得性免疫。并在多種動植物中得到了應(yīng)用，本文主要從其歷史、機理、發(fā)展和應(yīng)用前景作出綜述。

1 CRISPR/Cas系統(tǒng)的發(fā)現(xiàn)和發(fā)展

最早日本科研組于1987年發(fā)現(xiàn)大腸桿菌堿性磷酸酶基因附近存在串聯(lián)間隔重復(fù)，之后發(fā)其廣泛存在于細菌和古細菌基因組[2]，零二年首次將其命名為CRISPR。零五年，發(fā)現(xiàn)CRISPR的間隔序列和細菌內(nèi)一些染色體外的遺傳物質(zhì)高度同源，因此推測，這可能與細菌抵抗外源基因入侵有關(guān)。零六年，利用生物信息學(xué)分析，其可能以類似RNAi的方式行使功能。零七年，發(fā)現(xiàn)細菌可能利用其抵抗噬菌體的入侵，零八年，又發(fā)現(xiàn)細菌可以利用其抵抗外源質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化。至今其功能越來越清晰，重要性也越來越清晰。

2 CRISPR的結(jié)構(gòu)和分類

其首先包含間隔序列和重復(fù)序列，其中，間隔序列高度可變，主要來源于噬菌體和質(zhì)粒，長度在20～70bp，不同的基因座之間的間隔序列的數(shù)目不同，這樣，我們或許可以分析基因座中間隔序列的種類及時間序列，來考慮不同菌的親緣關(guān)系。而重復(fù)序列，也非保守，其長度一般為20～50bp，但是其兩端相對保守，間隔序列與重復(fù)序列間隔排列，且重復(fù)序列中還存在保守回文結(jié)構(gòu)。

之后，人們發(fā)現(xiàn)，在其基因座附近還有一些保守的蛋白質(zhì)基因，即Cas基因，這些基因編碼了包括核酸酶、解旋酶、聚合酶以及與RNA結(jié)合的結(jié)構(gòu)域。并非每一個CRISPR基因座附近都有相應(yīng)的Cas基因，但這種產(chǎn)物也可以通過和其他位置的Cas基因編碼的蛋白質(zhì)結(jié)合，從而發(fā)揮作用。

現(xiàn)目前應(yīng)用最多的為兩類，其中，前者含有Cas3蛋白，它具有解旋酶和核酸酶的功能，此系統(tǒng)中多個Cas蛋白與成熟的crRNA結(jié)合形成病毒防御復(fù)合體，結(jié)合外源DNA，形成R環(huán)結(jié)構(gòu)，Cas3的核酸酶活性識別R環(huán)結(jié)構(gòu)后切開互補鏈，再通過解旋酶活性和核酸酶活性將非互補鏈切開。后者含有Cas9蛋白，其參與crRNA的成熟和外源質(zhì)粒的降解。其存在于細菌中，因為只需要一個Cas參與外源基因剪切，故更為方便。

3 作用機制

其作用機制可以分為三個步驟[3]：

（1）獲取新的間隔序列。

（2）將新引入的原間隔轉(zhuǎn)錄。

（3）和Cas蛋白形成復(fù)合物精準(zhǔn)作用入侵基因座。最后一種應(yīng)用最多，因為其只需要Cas9參與剪切。其有2個核酸酶結(jié)構(gòu)域：氨基端結(jié)構(gòu)域和中間位置的核酸酶結(jié)構(gòu)域，核酸酶結(jié)構(gòu)域可以切割與前轉(zhuǎn)錄物互補配對的模板鏈，切割位點位于PAM上游，氨基端結(jié)構(gòu)域可對另一條鏈進行切割，切點位于PAM上游。在前轉(zhuǎn)錄物與tracr RNA形成的雙鏈RNA的指導(dǎo)下，Cas9蛋白將靶點切割[4]。

4 脫靶問題

脫靶即對基因組非特異性切割。理論上該系統(tǒng)脫靶的概率會較高，特別是最近有科研組發(fā)現(xiàn)在人類中，最多存在五個錯誤堿基的情況下，系統(tǒng)仍然會對該位點進行切割，造成脫靶。因此系統(tǒng)特異性的提高十分重要，主要有以下措施[5]：

（1）突變核酸酶的氨基端結(jié)構(gòu)域或中間核酸酶結(jié)構(gòu)域，使其變?yōu)榍锌诿?，在不引起非同源末端連接修復(fù)機制前提下激活同源重組修復(fù)機制，降低細胞毒性。

（2）利用生物信息學(xué)手段對其同源蛋白進行預(yù)測，尋找高特異性核酸酶。

5 優(yōu)勢及應(yīng)用前景

（1）靶向精準(zhǔn)性高，其可以經(jīng)改造為切口酶，不會引起非同源末端連接，但同源重組機制仍可被激活，故可以作為切口酶來實現(xiàn)目的基因的定點敲入或點突變，大大降低非同源末端連接的風(fēng)險和脫靶效應(yīng)。

（2）可對靶基因多個位點同時敲除：其靶位點很短，故可串聯(lián)若干向?qū)NA，以同時編輯同一個基因不同位點，這可以用于研究同一基因家族不同基因功能以及基因之間的相互作用。

（3）在基因編輯上有靈活性，在Cas9蛋白末端添加其它功能性蛋白，如添加轉(zhuǎn)錄激活域，則可激活靶基因表達；若添加甲基化酶，可以進行靶位點甲基化調(diào)控，有助于表觀遺傳學(xué)調(diào)控研究。

（4）靶點在基因組中數(shù)量眾多，在平均間隔8bp。

6 結(jié)束語

綜上，CRISPR/Cas9技術(shù)是一種強大的基因編輯工具，將在基因功能注釋、基因治療、靶向藥物、人類疾病動物模型創(chuàng)制起到強大作用，且其具有設(shè)計簡單、耗時短、節(jié)約成本、實驗操作性強等優(yōu)勢，故必將成為普通生物學(xué)實驗室的常用技術(shù)。

參考文獻

[1]Huang P， et al. Heritable gene targeting in zebrafish using customized TALENs. Nat Biotechnol， 2011，29（8）：699-700.

[2]Jansen R， et al. Identification of a novel family of sequence repeats among prokaryotes. Omics： a Journal of Integrative Biology， 2002，6（1）：23-33.

[3]Wiedenheft B， et al. RNA-guided complex from a bacterial immune system enhances target recognition through seed sequence interations. Proc Natl Acad Sci USA， 2011，108（25）：10092-10097.

[4]李君，張毅.CRISPR/Cas系統(tǒng)：RNA 靶向的基因組定向編輯新技術(shù)[J].遺傳，2013，35（11）：1265-1273.

[5]方銳，暢飛，孫照霖，等.CRISPR/Cas9介導(dǎo)的基因組定點編輯技術(shù)[J].生物化學(xué)與生物物理進展，2013，40（8）：691-702.

作者簡介：李志遠，就讀于東北農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，研究方向：分子生物學(xué)。