褐飛虱可溶性海藻糖酶的分子特性及dsRNA抑制表達(dá)分析

陳堅毅， 張 露， 王莎莎， 丁艷娟， 趙麗娜， 王世貴， 唐 斌

(杭州師范大學(xué)生命與環(huán)境科學(xué)學(xué)院，浙江 杭州 310036)

褐飛虱可溶性海藻糖酶的分子特性及dsRNA抑制表達(dá)分析

陳堅毅， 張 露， 王莎莎， 丁艷娟， 趙麗娜， 王世貴， 唐 斌

(杭州師范大學(xué)生命與環(huán)境科學(xué)學(xué)院，浙江 杭州 310036)

為探究不同昆蟲可溶性海藻糖酶的潛在功能，在獲得褐飛虱2個可溶性海藻糖酶NlTRE1-1和NlTRE1-2的cDNA全長序列的基礎(chǔ)上，采用生物信息學(xué)相關(guān)軟件分析其序列特征以及二級、三級結(jié)構(gòu)等分子特性及生理功能，同時構(gòu)建不同昆蟲海藻糖酶的系統(tǒng)進(jìn)化樹，進(jìn)一步采用RNAi技術(shù)分析單個海藻糖酶基因抑制效果.結(jié)果顯示，褐飛虱可溶性海藻糖酶NlTRE1-1和NlTRE1-2蛋白相似性高，其蛋白質(zhì)二級和三級結(jié)構(gòu)均類似，二級結(jié)構(gòu)中含有相似比例的α螺旋、β-折疊和無規(guī)卷曲；系統(tǒng)進(jìn)化樹分析表明褐飛虱海藻糖酶與大豆蚜、豌豆蚜和灰飛虱等昆蟲的TRE1具有較近的親緣關(guān)系；且兩個褐飛虱特異性TRE1-1和TRE1-2的dsRNA注射后48 h，本基因的表達(dá)極顯著下降.研究結(jié)果為以抑制海藻糖酶基因表達(dá)來進(jìn)行的害蟲防治技術(shù)奠定基礎(chǔ).

褐飛虱；海藻糖酶基因；序列分析；qRT-PCR；RNA干擾

水稻是中國乃至世界上最重要的食物來源，而褐飛虱(Nilaparvatalugens)是水稻生產(chǎn)中最具毀滅性的害蟲之一.褐飛虱屬于半翅目飛虱科，是一種單食性水稻害蟲，具有繁殖速度快、內(nèi)稟增長率高、環(huán)境適應(yīng)性強(qiáng)等特點[1-5].海藻糖酶(Trehalase，常簡稱TRE，Tre或Treh)是昆蟲海藻糖代謝中必不可少的一類酶，亦是昆蟲體內(nèi)幾丁質(zhì)合成通路的第一個酶，由于其重要性被稱為“血糖”.前期研究根據(jù)昆蟲的海藻糖酶是否具有跨膜結(jié)構(gòu)將其分為可溶性海藻糖酶(soluble trehalase，簡稱TRE1、Treh1或TreS)和膜結(jié)合型海藻糖酶(membrane-bound trehalase，簡稱TRE2、Treh2或TreM)兩種類型[6-11]，它們分別為細(xì)胞內(nèi)蛋白和跨膜蛋白，將海藻糖降解為葡萄糖從而為昆蟲的運動等生理活動提供能量[12-13].

相關(guān)研究報道海藻糖酶不僅能夠通過調(diào)節(jié)昆蟲體內(nèi)海藻糖的濃度抵抗低溫、干燥和農(nóng)藥等逆境脅迫[14]，而且能夠通過調(diào)控幾丁質(zhì)合成通路控制昆蟲蛻皮過程中的幾丁質(zhì)合成[15-16].同樣，海藻糖酶抑制劑Validamycin能夠抑制海藻糖酶的活性，從而調(diào)控幾丁質(zhì)代謝，導(dǎo)致昆蟲蛻皮困難及死亡[17].因此，海藻糖酶可作為設(shè)計新型殺蟲劑的潛在靶標(biāo).本文在前期獲得褐飛虱2個可溶性海藻糖酶cDNA序列的基礎(chǔ)上，分析其一、二、三級結(jié)構(gòu)的差異，并采用RNAi技術(shù)探索其抑制靶標(biāo)基因的表達(dá)情況，為基于RNAi技術(shù)抑制海藻糖酶基因表達(dá)的害蟲防治奠定基礎(chǔ).

1 材料與方法

1.1 供試?yán)ハx

本實驗室飼養(yǎng)種群，采集于中國水稻研究所，其后在杭州師范大學(xué)動物適應(yīng)與進(jìn)化重點實驗室長期飼養(yǎng).褐飛虱飼養(yǎng)全部采用感蟲水稻品種TN1，水稻和褐飛虱均放在人工氣候箱或者人工氣候室中培育或者飼養(yǎng)，溫度(25±1)℃、相對濕度70%±5%、光周期14L∶10D.

1.2 儀器與試劑

1.2.1 主要儀器

-80 ℃冰箱(艾本德U410-86)，常規(guī)冰箱(西門子KK25V61TI)；臺式低溫離心機(jī)(Eppendorf)，臺式高速離心機(jī)(Eppendorf和Sigma1-14)；高壓蒸汽滅菌鍋(ZEALWAY GR60DA)，無菌超凈工作臺(ESCO)，恒溫水浴鍋(上海精宏DK-8D)，實時熒光定量PCR儀(Bio-RAD CFX96)和微量測定分光光度計(NanoDropTM2000)等.

1.2.2 主要試劑

常規(guī)的PCR試劑如6×Loading buffer、DNA Marker DL2000、pMD18-T或pMD20-T、AMV反轉(zhuǎn)錄試劑盒及實時熒光定量PCR試劑均從大連TaKaRa公司購買；常規(guī)和熒光實時定量PCR引物均由上海英濰捷基有限公司合成；總RNA提取采用Trizol試劑盒，購自Lifetech Scientific Corporation；實時熒光定量PCR八連管等耗材購自美國Bio-RAD公司；dsRNA合成試劑盒為T7 RiboMax Express RNAi System(Promega，Madison，USA)；瓊脂糖、氯仿、異丙醇、無水乙醇、EDTA等常規(guī)試劑均購自國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司.

1.3 試驗方法

1.3.1 褐飛虱總RNA的抽提及cDNA合成

取5～10頭褐飛虱放入1.5 mL離心管中，置于冰上，加入100 μL Trizol，電動勻漿器研磨；補(bǔ)足Trizol 至1 mL，用力振蕩3 min，室溫靜置；4 ℃，12 000 r/min離心15 min，轉(zhuǎn)移上清至新的1.5 mL離心管，加入500 μL異丙醇，上下顛倒混勻，室溫靜置20 min；離心，棄上清，并加入1 mL 75%的乙醇，將沉淀吹離管壁，洗滌沉淀；4 ℃，7 500 r/min離心5 min；倒去上清，加入1 mL 75%的乙醇，將沉淀吹離管壁，洗滌沉淀；離心后倒掉上清，將離心管倒置在超凈臺上，加入30～50 μL DEPC處理水溶解，吹打混勻；各取1 μL用于電泳檢測和分光光度計濃度檢測.首先在RNase-free的500 μL EP管中配制基因組DNA的去除體系，再按照Takara Prime Script?RT reagent Kit With gDNA Eraser試劑盒說明書要求進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，-20 ℃保存.

1.3.2 PCR擴(kuò)增、膠回收及T克隆

根據(jù)前期褐飛虱的轉(zhuǎn)錄組和美國國家生物科技信息學(xué)中心網(wǎng)站(NCBI)公布的NlTRE1-1(FJ790319)及NlTRE1-2(KU556829)完整cDNA 開放閱讀框序列(Open Reading Frame，ORF)，分別從兩端設(shè)計特異性引物，進(jìn)行PCR全長擴(kuò)增和驗證.具體PCR條件為：94 ℃預(yù)變性5 min，94 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸120 s，共30個循環(huán)，72 ℃充分延伸10 min.反應(yīng)結(jié)束，取 5 μL PCR 產(chǎn)物在1.2%瓊脂糖凝膠上電泳.當(dāng)檢測到大小分別為1 700，1 500 bp的目的條帶后，回收純化，進(jìn)行 T 克隆并連接到T載體中，菌落或者酶切進(jìn)行驗證后，送上海英濰捷基公司測序.

1.3.3 菌落PCR鑒定陽性克隆并測序

取菌落至30 μL ddH2O，用作菌落PCR模板；菌落PCR體系：10×buffer 1.25 μL、dNTP(2.5 Mm)1 μL、正向與反向引物F(10 pmol)各0.5 μL、Hifi(5 U/μL)0.1 μL、菌液0.5 μL、補(bǔ)足滅菌的ddH2O至12.5 μL即可進(jìn)行PCR.

核酸鑒定菌落PCR產(chǎn)物，電泳后，取3 μL 100 μg/mL Amp和陽性克隆剩余菌液加入3 mL LB液體培養(yǎng)基，過夜搖菌；按照600 μL甘油加800 μL過夜菌液的比例配置菌液送往上海英濰捷基有限公司測序.

1.3.4 序列分析與系統(tǒng)進(jìn)化樹分析

將克隆測出的cDNA序列與NCBI數(shù)據(jù)庫進(jìn)行比對分析.同時，使用SOPMA在線分析軟件，進(jìn)行NlTRE1-1和NlTRE1-2的二級結(jié)構(gòu)預(yù)測，并采用SWISS-MODEL進(jìn)行蛋白質(zhì)三維結(jié)構(gòu)的預(yù)測.利用MEGA7軟件中的NJ法構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹.

1.3.5 褐飛虱可溶性海藻糖基因dsRNA引物的設(shè)計及體外合成

利用Primer5和DNASTAR分別設(shè)計褐飛虱可溶性海藻糖酶NlTRE1-1和NlTRE1-2的全長ORF擴(kuò)增及dsRNA引物，具體引物序列見表1.

表1 NlTRE1-1，NlTRE1-2 ORF和dsRNA合成及熒光實時定量PCR引物序列Tab. 1 Primers used for ORF, dsRNA synthesis and qRT-PCR of NlTRE1-1 and NlTRE1-2

T7：GGATCCTAATACGACTCACTATAGG.

分別以含有NlTRE1-1、NlTRE1-2和GFP的質(zhì)粒DNA為模板，通過交叉PCR反應(yīng)獲得用于體外轉(zhuǎn)錄dsRNA的模板.交叉PCR分為: A反應(yīng)的正向引物帶有T7啟動子，PCR產(chǎn)物作為轉(zhuǎn)錄合成正義RNA的模板；B反應(yīng)的反向引物帶有T7啟動子，PCR產(chǎn)物作為轉(zhuǎn)錄合成反義RNA的模板[9,18].按照Omega說明書進(jìn)行膠回收，用NanoDropTM2000測定回收的cDNA的濃度，OD(260/280)和OD(260/230)值均位于1.8～2.2較好，可避免一些蛋白質(zhì)和雜質(zhì)離子等抑制cDNA的反轉(zhuǎn)錄.然后參照T7 RiboMAXTMExpress RNAi System試劑盒說明書進(jìn)行dsRNA的合成.

1.3.6 dsRNA的純化及注射

向離心管中加入4.4 μL 3 mol/L醋酸鈉，110 μL 95%乙醇，輕輕混勻，冰上放置；離心10 min，棄上清；加入0.5 mL 70%的冰乙醇洗滌沉淀，離心，棄上清；室溫干燥后，加入50 μL DEPC處理水溶解沉淀；電泳檢測，NanoDropTM2000測定合成的dsRNA的濃度；-80 ℃長期保存.

將5齡褐飛虱用CO2麻醉后放置于制備有瓊脂膠板的一次性培養(yǎng)皿中，使蟲體腹部朝上，注射第一對足中間偏下較軟部位，每頭注射量為200 ng(海藻糖酶抑制劑注射量相同)，注射后將其放置于裝有新鮮水稻的試管中，48 h后取整體褐飛虱材料用于后期的實時熒光定量PCR檢測與分析[19].

1.3.7 實時熒光定量PCR及數(shù)據(jù)分析

反應(yīng)程序為：95 ℃預(yù)變性3 min；95 ℃變性5 s， 55～60 ℃退火延伸25 s；繪制65～95 ℃溶解曲線.每個樣品至少重復(fù)3次，3個復(fù)孔的CT值相差不超過0.5可用，取平均值用于計算，處理組為NlTRE1-1和NlTRE1-2的dsRNA處理組，以褐飛虱dsGFP注射組為對照.采用2-△△CT法計算特異性基因的表達(dá)水平.

2 結(jié)果

2.1 褐飛虱TRE1-1和TRE1-2 cDNA序列分析

克隆得到褐飛虱海藻糖酶TRE1-1和TRE1-2cDNA開放閱讀框的長度分別為1 692，1 475 bp；翻譯成蛋白的氨基酸數(shù)目分別為564，492個；預(yù)測的蛋白等電點分別為5.51和4.99；預(yù)測蛋白的分子質(zhì)量分別為65.5，57.9 kD.這2個TRE1(圖1)都無跨膜結(jié)構(gòu)，但都具有保守的海藻糖酶信號序列“PGGRFREFYYWDSY”和“QWDYPNAWPP”[6,13](存在個別蛋白的差異).

起始密碼子和終止密碼子用加粗斜體下劃線表示，dsRNA合成引物序列用大框表示，定量PCR引物序列用小框表示，標(biāo)簽序列用黑底表示.圖1 褐飛虱TRE1-1和TRE1-2核苷酸和氨基酸序列Fig. 1 Nucleotide and amino acid sequences of TRE1-1 and TRE1-2 from N. lugens

2.2 褐飛虱TRE1及昆蟲可溶性海藻糖酶系統(tǒng)進(jìn)化分析

從NCBI數(shù)據(jù)庫中獲取已知昆蟲的可溶性海藻糖酶蛋白序列、褐飛虱的TRE2蛋白序列、東亞飛蝗(Locustamigratoria)和異色瓢蟲(Harmoniaaxyridis)的TRE2-like蛋白序列一起進(jìn)行系統(tǒng)進(jìn)化分析.結(jié)果發(fā)現(xiàn)褐飛虱TRE1-1和TRE1-2與大豆蚜(Aphisglycines)、豌豆蚜(Acyrthosiphonpisum)及灰飛虱(Laodelphaxstriatella)的可溶性海藻糖酶具有較近的親緣關(guān)系(圖2).除異色瓢蟲的TRE1-3和TRE1-4外，鞘翅目的異色瓢蟲、赤擬谷盜(Triboliumcastaneum)和黃粉蟲(Tenebriomolitor)可溶性海藻糖酶聚集在相近的分支上.

圖2 昆蟲海藻糖酶氨基酸序列系統(tǒng)進(jìn)化樹Fig. 2 Phylogenetic tree of TREs amino acid sequences from various insects

2.3 褐飛虱TRE1-1和TRE1-2的二級結(jié)構(gòu)及三級結(jié)構(gòu)預(yù)測分析

褐飛虱的TRE1-1和TRE1-2為無跨膜結(jié)構(gòu)的可溶性海藻糖酶.且兩個TRE1的二級結(jié)構(gòu)相似，其無規(guī)則卷曲、α-螺旋和β-折疊所占比例相近(圖3).具體為：TRE1-1和TRE1-2的無規(guī)則卷曲所占比例分別為47.70%和47.15%；α-螺旋分別為43.44%和46.14%；β-折疊比例分別為6.74%，5.89%.

藍(lán)色代表α-螺旋；紅色代表β-折疊.SOMPA:http://npsa-pbil.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl?page=/NPSA/npsa_seccons.html.圖3 SOMPA在線軟件分析TRE1-1和TRE1-2二級結(jié)構(gòu)Fig. 3 The prediction of the secondary structure of TRE1-1 and TRE1-2

在分析NlTRE1-1和NlTRE1-2蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)的基礎(chǔ)上，采用SWISS-MODEL對兩個NlTRE1進(jìn)行蛋白質(zhì)三維結(jié)構(gòu)的預(yù)測.結(jié)果表明NlTRE1-1和NlTRE1-2的蛋白質(zhì)三級結(jié)構(gòu)十分相似，TRE1-1和TRE1-2的3D結(jié)構(gòu)近似球體，存在著較多較長的α螺旋結(jié)構(gòu)和很少量的β折疊，以及一些無規(guī)則卷曲.

圖4 褐飛虱TRE1-1和TRE1-2蛋白質(zhì)三維結(jié)構(gòu)預(yù)測Fig. 4 The prediction of three dimensional structure of TRE1-1 and TRE1-2

2.4 褐飛虱TRE1-1和TRE1-2的RNAi效果分析

在獲得合適的褐飛虱dsTRE1-1、dsTRE1-2和dsGFP的RNA(圖5)后，注射到褐飛虱體內(nèi)48 h，實時熒光定量PCR結(jié)果顯示兩個處理組的NlTRE1-1和NlTRE1-2在mRNA水平下降，與對照注射dsGFP組相比較都存在極顯著性差異(圖6).該結(jié)果顯示外源褐飛虱TRE1-1和TRE1-2的dsRNA注射后可有效抑制TRE1-1和TRE1-2本基因的表達(dá).

1：TRE1-1；2：TRE1-2；3：GFP.圖5 dsTRE1-1, dsTRE1-2, dsGFP合成電泳圖Fig. 5 Agrosegel electrophresis of dsTRE1-1, dsTRE1-2 and dsGFP

圖6 熒光定量PCR檢測TRE1-1和TRE1-2表達(dá)分析Fig. 6 The expression analysis of TRE1-1 and TRE1-2 by qRT-PCR

3 討論

海藻糖是昆蟲的“血糖”，海藻糖酶是昆蟲中唯一能夠水解海藻糖的酶，由海藻糖酶基因編碼.考慮到海藻糖酶不僅能降解海藻糖，而且能夠通過調(diào)控海藻糖的降解調(diào)控昆蟲幾丁質(zhì)的合成途徑，因此，關(guān)于昆蟲海藻糖酶及其基因功能的研究一直受到眾多研究者的關(guān)注.1992年，昆蟲海藻糖酶在黃粉蟲中被發(fā)現(xiàn)并確定為可溶性海藻糖酶基因[20].而后膜結(jié)合型的海藻糖酶也在Bombyxmori中克隆和報道[12].目前，許多昆蟲中已經(jīng)發(fā)現(xiàn)兩類海藻糖酶基因，大多數(shù)昆蟲中僅包含了一個可溶性海藻糖酶和一個膜結(jié)合型海藻糖酶基因.昆蟲的海藻糖酶都包含了“PGGRFREFYYWDSY”和“QWDYPNAWPP”兩個保守的標(biāo)簽序列[6]，不同昆蟲之間也會存在個別蛋白的差異，褐飛虱TRE1-1的標(biāo)簽序列為“PGGRFRELYYWDTY”和“QWDFPNAWAP”，而TRE1-2的標(biāo)簽序列為“PGGTSRELHYWDSY”和“KWDFPNAWAP”(圖1).

系統(tǒng)進(jìn)化分析表明，褐飛虱的兩條TRE1蛋白與大豆蚜、豌豆蚜和灰飛虱具有較近的親緣關(guān)系，它們聚集在一起(圖2).隨著轉(zhuǎn)錄組和基因組測序的發(fā)展，在鞘翅目的赤擬谷盜和異色瓢蟲中分別發(fā)現(xiàn)4～5條可溶性海藻糖酶基因[14,21-22]，且在東亞飛蝗和褐飛虱中發(fā)現(xiàn)了2條可溶性海藻糖酶基因序列.然而，在東亞飛蝗和異色瓢蟲中發(fā)現(xiàn)一類無跨膜結(jié)構(gòu)、但與膜結(jié)合型蛋白同源性高且聚集在一支的類似膜結(jié)合型海藻糖酶(membrane-bound like trehalase，簡稱TRE2-like或TreM-like)[9,17-18,23-24]，其與褐飛虱TRE2蛋白聚集在一支上(圖2)，這類類似膜結(jié)合型海藻糖酶極有可能為可溶性海藻糖酶進(jìn)化到膜結(jié)合型海藻糖酶的中間類型.雖然昆蟲的海藻糖由海藻糖酶來控制，但是相關(guān)結(jié)果推測不同昆蟲組織海藻糖降解可能由不同種類的海藻糖酶直接負(fù)責(zé)，不同的可溶性海藻糖酶基因存在著不同分工.

海藻糖酶活性受激素的調(diào)節(jié)[25-26]，而20E(20-基蛻皮甾酮)同樣能夠調(diào)節(jié)甜菜夜蛾(Spodopteraexigua)SeTRE1的表達(dá)來調(diào)控海藻糖酶的活性[27].在褐飛虱中，TRE1-1和TRE1-2的dsRNA能夠有效地抑制本基因在RNA干擾48 h后mRNA水平上的表達(dá)(圖6)，且降低可溶性海藻糖酶活性、幾丁質(zhì)合成酶(Chitin synthase)和幾丁質(zhì)酶(Chitinase)的表達(dá)，從而導(dǎo)致幾丁質(zhì)含量下降、蛻皮困難及死亡[9].因此，通過RNAi技術(shù)或者采用海藻糖酶抑制劑能夠有效抑制海藻糖酶基因的表達(dá)[17]，并控制害蟲的蛻皮過程和幾丁質(zhì)代謝，這為開發(fā)潛在的海藻糖酶抑制劑或合適的RNAi方法用于生物防治提供可能性，將有助于推動以海藻糖代謝途徑中關(guān)鍵基因如海藻糖酶基因為靶標(biāo)的害蟲生物防治工作的發(fā)展.

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Molecular Characterization of Soluble Trehalase and Expression of dsRNA inNilaparvatalugens

CHEN Jianyi, ZHANG Lu, WANG Shasha, DING Yanjuan, ZHAO Lina, WANG Shigui, TANG Bin

(College of Life and Environmental Sciences, Hangzhou Normal University, Hangzhou 310036, China)

In order to explore the potential functions of different insects’ soluble trehalase, basing on the full-length sequence of two soluble trehalase NlTRE1-1 and NlTRE1-2 cDNAs, the sequence characteristics as well as the secondary and tertiary structures of two TRE1 inNilaparvatalugenswere analyzed using the bioinformatics software. Then, the phylogenetic tree of trehalase from different insects was constructed. And the effect of single trehalase gene by RNAi technique was studied. These results showed that the soluble trehalase NlTRE1-1 and NlTRE1-2 proteins had high similarity, their protein secondary and tertiary structures were similar. The secondary structure contained similar ratio α-helix, β-sheet and random coil. The phylogenetic tree analysis showed that two trehalase ofN.lugenshad a close genetic relationship with the TRE1 ofAphisglycines,AcyrthosiphonpisumandLaodelphaxstriatella. The expression of this gene was significantly decreased when the two specific TRE1-1 and TRE1-2 dsRNAs were injected 48 h. This study results provided a basis for the prevention and treatment of pests that inhibited trehalase gene expression.

Nilaparvatalugens; trehalase gene; sequence analysis; qRT-PCR; RNA interference

10.3969/j.issn.1674-232X.2017.03.007

2016-12-23

國家自然科學(xué)基金項目(31371996，31672081)；杭州市科技局計劃項目(20140432B01).

唐 斌(1980—),男,副研究員,博士,主要從事昆蟲海藻糖代謝及調(diào)控相關(guān)研究.E-mail:tbzm611@163.com

Q966；S476

A

1674-232X(2017)03-0260-08