胃癌干細胞CSC-G在胃癌侵襲和轉(zhuǎn)移中的作用研究

胃癌干細胞CSC-G在胃癌侵襲和轉(zhuǎn)移中的作用研究

宋海濤 盛玉龍 劉國香 孫廣寧 張秀榮 尹鳳玲 路中

目的探討胃癌干細胞CSC-G在胃癌侵襲和轉(zhuǎn)移中的作用。方法體外培養(yǎng)胃癌干細胞CSC-G和普通胃癌細胞SGC7901采用Western blot法檢測兩種胃癌細胞中干細胞標志物的表達情況，對比兩種胃癌細胞的侵襲性檢測結(jié)果和球形克隆形成情況。結(jié)果胃癌干細胞CSC-G的干細胞標志物SOX2、OCT4的表達水平高于胃癌細胞SGC7901（P＜0．05）。球形克隆檢測結(jié)果顯示，胃癌干細胞CSC-G的瘤球數(shù)量為（65．49±10．22）個，多于胃癌細胞SGC7901的（7．36±1．14）個（P＜0．05）。侵襲能力檢測結(jié)果顯示，胃癌干細胞CSC-G穿過基底膜的數(shù)量為（168．71±32．50）個，多于胃癌細胞SGC7901的（92．44±13．06）個（P＜0．05）。結(jié)論胃癌干細胞CSC-G在胃癌侵襲和轉(zhuǎn)移過程中發(fā)揮著促進作用。

胃癌干細胞；CSC-G；胃癌侵襲；胃癌轉(zhuǎn)移

胃癌患者預(yù)后較差，現(xiàn)階段我國臨床迫切需要能夠用于評估胃癌患者疾病侵襲和轉(zhuǎn)移情況的指標，旨在能夠盡早發(fā)現(xiàn)患者疾病復(fù)發(fā)征兆，及時采取治療措施，預(yù)防疾病的復(fù)發(fā)[1]。胃癌干細胞是一類具有自我更新、自我分化潛能的癌細胞，難以被化療、放療殺死，目前被認為是引起胃癌患者疾病復(fù)發(fā)的主要原因[2]。本研究對胃癌干細胞CSC-G在胃癌侵襲和轉(zhuǎn)移中的作用進行深入探討，現(xiàn)將研究內(nèi)容進行以下報導(dǎo)。

1 材料與方法

1.1 一般材料

使用材料：胃癌干細胞CSC-G、普通胃癌細胞SGC7901，兩者均由中國科學(xué)院上海細胞庫提供。

1.2 研究方法

1.2.1 細胞培養(yǎng) 將胃癌細胞SGC7901凍存管取出置入水浴中融化，轉(zhuǎn)移至培養(yǎng)皿中，在培養(yǎng)皿中加培養(yǎng)液培養(yǎng)，第2天更換培養(yǎng)液，在光學(xué)顯微鏡下觀察細胞產(chǎn)生長情況。待培養(yǎng)皿中的細胞數(shù)量超過85%時進行細胞傳代培養(yǎng)，將營養(yǎng)液吸出，使用磷酸緩沖鹽溶液洗滌，經(jīng)胰蛋白酶消化，加含有血清的培養(yǎng)液終止消化，制成細胞混懸液分裝至不同的培養(yǎng)瓶中加培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)。選擇各培養(yǎng)品中生長良好的細胞，再次使用磷酸緩沖鹽溶液洗滌，經(jīng)胰蛋白酶消化，將細胞轉(zhuǎn)移至離心試管中進行離心，棄上清液，凍存在-80℃的冰箱中，次日轉(zhuǎn)移至液氮罐中。最終將胃癌細胞SGC7901接種至PRMI培養(yǎng)基中培養(yǎng)，每間隔2日更換1次培養(yǎng)液，當細胞融合比例高于90%時進行胰蛋白酶消化和傳代培養(yǎng)。將胃癌干細胞CSC-G接種至無血清的DMEM/F12培養(yǎng)基中進行培養(yǎng)，每日均添加一次營養(yǎng)液，10 d后進行傳代培養(yǎng)。

1.2.2 球形克隆試驗 兩種細胞傳代培養(yǎng)10 d后進行球形克隆試驗，評價兩種細胞在胃癌轉(zhuǎn)移中的作用。將兩種細胞分別接種至6孔板中進行培養(yǎng)，均加入無血清培養(yǎng)基進行培養(yǎng)，每日在光學(xué)顯微鏡下觀察兩種細胞的瘤球形成情況，連續(xù)培養(yǎng)3周，取兩種細胞隨機3個顯微鏡視野統(tǒng)計瘤球個數(shù)，取三個視野的平均值。

1.2.3 干細胞標志物檢測 采用Western blot法檢測兩種胃癌細胞中干細胞標志物的表達情況，傳代培養(yǎng)10 d后取生長良好的細胞，磷酸緩沖鹽溶液洗滌后，消化離心，經(jīng)RIPA裂解液裂解，經(jīng)超聲粉碎后再次離心，獲得細胞總蛋白，采用BCA法檢測相關(guān)蛋白表達水平。

1.2.4 侵襲性檢測 取生長良好的傳代培養(yǎng)10 d后的細胞，使用無血清培養(yǎng)基稀釋ECW基質(zhì)膠培養(yǎng)，然后加入到Transwell小室中懸浮，并在小室中加入含胎牛血清的培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)，最后將Transwell小室取出，風(fēng)干，染色，磷酸緩沖鹽溶液洗滌，在顯微鏡下進行拍照計數(shù)。

1.3 觀察指標

對比胃癌干細胞CSC-G、普通胃癌細胞SGC7901的干細胞標志物的表達水平以及兩種細胞的侵襲能力、轉(zhuǎn)移能力。

1.4 數(shù)據(jù)分析處理

基于SPSS 21.0版本統(tǒng)計學(xué)軟件建立數(shù)據(jù)分析模型，計量資料均以（均數(shù)±標準差）的形式描述，指標差異采用獨立樣本t檢驗，P＜0.05表示兩者比較差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 兩種細胞的干細胞標志物表達水平比較

檢測結(jié)果顯示胃癌干細胞CSC-G的干細胞標志物SOX2、OCT4的表達水平高于胃癌細胞SGC7901（P＜0.05），β-actin的表達水平比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），詳見圖1所示。

2.2 兩種細胞的球形克隆試驗結(jié)果比較

球形克隆檢測結(jié)果顯示，胃癌干細胞CSC-G的瘤球數(shù)量多于胃癌細胞SGC7901，兩者比較差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），詳見表2所示。

2.3 兩種細胞的侵襲能力比較

侵襲能力檢測結(jié)果顯示，胃癌干細胞CSC-G穿過基底膜的數(shù)量多于胃癌細胞SGC7901，兩者比較差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），詳見表2所示。

表2 兩種細胞的球形克隆試驗結(jié)果、侵襲能力比較

3 討論

胃癌是我國臨床最為常見的一種消化系統(tǒng)惡性腫瘤疾病，好發(fā)于50歲以上的人群，男性發(fā)病率高于女性，具有復(fù)發(fā)率高、預(yù)后不佳的臨床特點[3-4]。據(jù)不完全數(shù)據(jù)統(tǒng)計結(jié)果顯示，我國每年約有68萬例胃癌新發(fā)病例，占全球胃癌病例的50%左右，其中大部分患者在診斷時已為進展期胃癌，治療難度大，術(shù)后復(fù)發(fā)率高。利用胃癌干細胞治療胃癌是現(xiàn)階段我國醫(yī)療領(lǐng)域的研究熱點[5]。胃癌干細胞是患者腫瘤組織中具有自我更新能力和多向分化能力的腫瘤細胞，該類腫瘤細胞的殺死難度較普通胃癌細胞大，因此患者腫瘤組織中胃癌干細胞數(shù)量越多，預(yù)后越差[6-7]。

圖1 兩種細胞的干細胞標志物β-actin、SOX2、OCT4的表達情況

長期臨床研究發(fā)現(xiàn)，胃癌干細胞具有特異性，并不是所有胃癌干細胞均具有侵襲和轉(zhuǎn)移的能力。目前，我國臨床尚未完全明確胃癌的發(fā)病機制，近年來不斷有研究學(xué)者通過對胃癌干細胞的作用機制進行分析，探討胃癌患者疾病復(fù)發(fā)的原因，尋找制定胃癌治療方案的新思路和新方向[8]。本研究對胃癌干細胞CSC-G在胃癌侵襲和轉(zhuǎn)移中的作用進行探討，研究結(jié)果顯示胃癌干細胞CSC-G的干細胞標志物SOX2、OCT4的表達水平高于胃癌細胞SGC7901，球形克隆瘤球數(shù)量和穿過基底膜數(shù)量均多于胃癌細胞SGC7901。李向輝[9]等的臨床研究也對胃癌干細胞CSC-G在胃癌侵襲和轉(zhuǎn)移中的作用進行探討，結(jié)果顯示胃癌干細胞CSC-G克隆瘤球數(shù)量和穿過基底膜的數(shù)量均明顯升高，認為胃癌干細胞CSC-G在胃癌侵襲和轉(zhuǎn)移中發(fā)揮著重要作用。本次研究結(jié)果與李向輝等的研究結(jié)果一致。

對上述研究結(jié)果進行深入分析認為胃癌干細胞CSC-G在胃癌侵襲和轉(zhuǎn)移中發(fā)揮的作用明顯強于普通胃癌細胞SGC7901，與患者疾病復(fù)發(fā)存在密切關(guān)系，可通過監(jiān)測胃癌干細胞對患者疾病復(fù)發(fā)及預(yù)后進行評估。

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Study on the Role of CSC-G in Gastric Cancer Stem Cells in Invasion and Metastasis of Gastric Cancer

SONG Haitao SHENG Yulong LIU Guoxiang SUN Guangning ZHANG Xiurong YIN Fengling LU Zhong Department of Oncology, Affiliated Hospital of Weifang Medical University, Weifang Shandong 261031, China

ObjectiveTo investigate the role of CSC-G in gastric cancer stem cell invasion and metastasis.MethodsThe expression of stem cell markers in gastric cancer stem cells (CSC-G) and SGC7901 cells weredetected by Western blot. The invasive test results and the formation of spherical clones were compared between the two gastric cancer cells.ResultsThe expression levels of SOX2 and OCT4 in gastric cancer stem cells were signif i cantly higher than those in gastric cancer cells SGC7901 (P＜ 0.05). The number of tumor cells in gastric cancer stem cells was (65.49±10.22), which was more than that of gastric cancer cells SGC7901 (7.36±1.14) (P＜ 0.05). The number of CSC-G through gastric basement cells was (168.71±32.50), which was higher than that of gastric cancer cell SGC7901 (92.44±13.06) (P＜ 0.05).ConclusionCSC-G plays an important role in the invasion and metastasis of gastric cancer.

gastric cancer stem cells; CSC-G; gastric cancer invasion; gastric cancer metastasis

R735．2

A

1674-9316（2017）11-0136-03

10．3969/j．issn．1674-9316．2017．11．082

山東省醫(yī)藥衛(wèi)生科技發(fā)展計劃項目（2013WS0293）

山東省濰坊醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院腫瘤內(nèi)科，山東 濰坊 261031

路中