基于振鏡掃描的生物芯片熒光信號光強校正

楊丕胤+甘振華+高躍明

摘要：鑒于傳統(tǒng)生物芯片檢測裝置結(jié)構(gòu)較復雜，共聚焦逐點掃描速度較慢，設(shè)計了一種使用激光光源、二維高速振鏡和冷卻型CCD相結(jié)合的新裝置，并且建立相應的檢測數(shù)學模型。新裝置以STM32為控制核心，采用弓字型掃描方式采集載玻片上的熒光信號。實驗對同一片載玻片上的Cy5熒光染料進行五個不同位置的掃描，并由冷卻型CCD曝光采集圖片。經(jīng)實驗得到了五個相應位置的灰度圖像，通過公式推導建立了檢測數(shù)學模型并用其進行圖像灰度校正，校正后的圖像灰度誤差在2%以內(nèi)，可以滿足光強一致性的要求。

關(guān)鍵詞： 生物芯片； 二維高速振鏡； 冷卻型CCD相機； STM32； 圖像灰度校正

中圖分類號： TH 776 文獻標志碼： A doi： 10.3969/j.issn.1005-5630.2017.02.013

文章編號： 1005-5630（2017）02-0070-07

引 言

生物芯片檢測裝置作為生物芯片上的微點陣信息的采集儀器，在許多方面得到廣泛的應用，例如：DNA序列測序、基因表達檢測和分子擴增等，它的發(fā)展會帶動醫(yī)學中病原體的研究、生物細胞發(fā)育調(diào)控、藥物研發(fā)及遺傳篩選和診斷等領(lǐng)域的發(fā)展[1-3]。目前主流的檢測方式有兩種：一種是采用光電倍增管的激光共聚焦的方式，另一種是高壓氙氣燈或汞燈結(jié)合CCD的成像方式。激光共聚焦方式是將激光聚焦到幾微米并在芯片上來回掃描，激發(fā)單個像素區(qū)域，隨后通過光電倍增管轉(zhuǎn)換成數(shù)字信號；CCD成像方式則是，先將光源過濾成窄帶波長范圍，然后將光照射到芯片的大面積區(qū)域并使熒光標記物受激產(chǎn)生熒光，再經(jīng)CCD相機曝光收集[4]。由于前者的檢測結(jié)構(gòu)復雜且檢測速度相對較慢，后者的檢測精度相對不高，因此本文提出一種新的裝置，即采用二維高速振鏡以控制激光光路，提高掃描速度，并使用冷卻型CCD對信號進行采集，簡化整個檢測裝置的結(jié)構(gòu)。由于激光共焦光路是對單個像素進行垂直激發(fā)，因此它對每個像素的光照強度是一樣的，不存在光強校正的問題，然而新設(shè)計的檢測裝置的激光光束是通過高速振鏡傾斜投射于生物芯片表面，激發(fā)光強隨著傾斜角度的變化而變化，無法保證芯片表面區(qū)域的激發(fā)光強均勻一致，為此需對冷卻型CCD相機所獲得的檢測圖片進行檢測數(shù)學模型的修正，以解決激光斜照射而造成的光照不均勻的影響，實現(xiàn)對生物芯片的檢測。

1 硬件結(jié)構(gòu)

1.1 硬件整體結(jié)構(gòu)

本文設(shè)計的生物芯片檢測裝置的結(jié)構(gòu)簡圖如圖1所示。

固定于光源支架上的紅色激光光源經(jīng)過光束準直擴束后發(fā)射出固定波長的平行光，平行光經(jīng)過圓形小孔整形為小圓斑并將光斑水平照射進二維高速振鏡系統(tǒng)，如圖1（b）所示，二維高速振鏡工作原理如圖2所示。

振鏡系統(tǒng)z軸方向安裝的為X振鏡，平行激光經(jīng)過X振鏡A鏡面的旋轉(zhuǎn)可以實現(xiàn)x方向的掃描；振鏡系統(tǒng)x軸方向安裝的為Y振鏡，平行激光經(jīng)過Y振鏡B鏡面的旋轉(zhuǎn)可以實現(xiàn)y方向的掃描。二維振鏡可以將水平投射到A鏡面的平行光線反射到B鏡面后再次反射出射，通過控制X振鏡和Y振鏡的旋轉(zhuǎn)，可以實現(xiàn)平行激光光束對xOy平面的生物芯片表面的二維掃描，從而使芯片上的熒光染料被逐點激發(fā)，使得熒光染料受激發(fā)出特定波長范圍的熒光信號[5]。生物芯片檢測裝置通過熒光發(fā)射濾光片和冷卻型CCD相機對該熒光信號進行采集和成像。

1.2 二維高速振鏡工作原理

振鏡是類似檢流計的一種比較小的磁電式的偏轉(zhuǎn)器件。通過交變的電流產(chǎn)生變化的磁場，從而使得反射鏡上的轉(zhuǎn)子偏轉(zhuǎn)，控制振鏡的偏轉(zhuǎn)角度就可以使得激光能夠掃描[6]。

在振鏡轉(zhuǎn)子帶動反射鏡偏轉(zhuǎn)的過程中，激光的偏轉(zhuǎn)角度θx和θy與反射鏡的偏轉(zhuǎn)角度即轉(zhuǎn)子的偏轉(zhuǎn)角度αx和αy之間的關(guān)系為[7]θx=2αx和θy=2αy。

本文使用的DQ30二維高速振鏡具有精度高、結(jié)構(gòu)簡單、安裝便捷的優(yōu)點，而且它還支持差分信號和單端信號的輸入，擁有真實的每秒3萬個脈沖的掃描速度。該振鏡是通過電壓來控制鏡面偏轉(zhuǎn)，它的位置輸出比例系數(shù)k為0.5 V/（°），即每輸入0.5 V的電壓振鏡就偏轉(zhuǎn)1°，該高速振鏡的模擬位置輸入范圍為：±5 V。

2 激光掃描控制

二維高速振鏡是通過直流電壓來控制它的偏轉(zhuǎn)角度，因此在振鏡的控制方面選用意法半導體公司基于CoreTexM3內(nèi)核的微控制器STM32F103ZE。該處理器不僅體積小、功耗低而且性能高，具有豐富的片內(nèi)資源[8]。

2.1 STM32硬件電路設(shè)計

STM32F103ZE處理器具有兩個獨立的DAC轉(zhuǎn)換器，剛好和二維高速振鏡的X振鏡與Y振鏡相匹配。數(shù)字輸入經(jīng)過DAC模塊后被線性地轉(zhuǎn)換為模擬電壓的輸出，通過合理地選用參考電壓值可以輸出預期的模擬電壓值。但是，STM32的DAC模塊只能夠輸出正向電壓從0 V到參考電壓VREF+，而二維高速振鏡的正常工作電壓為-5～+5 V，因此以3.3 V為VREF+，設(shè)計一個放大減法的驅(qū)動電路使得STM32的DAC模塊可以間接控制二維振鏡所需要的-5～+5 V的模擬電壓，其硬件電路原理圖如圖3所示。

放大減法驅(qū)動電路采用兩片OP07驅(qū)動芯片，其中一片實現(xiàn)對STM32數(shù)字/模擬轉(zhuǎn)換輸出的放大功能，另外一片則實現(xiàn)減法功能使得電路的輸出具有負值電壓[9]。

2.2 二維高速振鏡控制設(shè)計

采用弓字形的掃描方式對熒光微點陣36 mm×36 mm的矩形區(qū)域進行掃描，即在y方向進行連續(xù)掃描，y方向每掃描一行后，對x軸方向進行一個步進，實現(xiàn)逐行的二維掃描。由于在對xOy平面二維掃描的全過程中，冷卻型相機的快門一直完全打開，不斷地曝光收集每個像素位置的熒光信號，為提高掃描速度，在y方向掃描的回程過程中，同時也進行了另一行y方向的掃描，整個掃描軌跡類似弓字形。同時，因冷卻型CCD相機快門打開，采用弓字形逐行掃描時也不需要在y方向的回程過程中對激發(fā)光源進行截止，從而降低了掃描裝置的復雜性。