HIV陰性免疫力低下患者痰液中耶氏肺孢子的實時熒光定量PCR檢測

佘 軒, 姚云清, 趙 川

(1. 四川省遂寧市中心醫(yī)院 感染科, 四川 遂寧, 629000; 2. 重慶醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院, 重慶, 400016)

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HIV陰性免疫力低下患者痰液中耶氏肺孢子的實時熒光定量PCR檢測

佘 軒1, 姚云清2, 趙 川1

(1. 四川省遂寧市中心醫(yī)院 感染科, 四川 遂寧, 629000; 2. 重慶醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院, 重慶, 400016)

目的 探討實時熒光定量PCR對HIV陰性免疫力低下合并肺孢子肺炎(PCP)患者的診斷價值。方法 選取71例臨床存在肺部感染并不能排除PCP的HIV陰性免疫力低下患者的痰液標(biāo)本，分別運用ITS-巢式PCR法和ITS-實時熒光定量PCR法檢測標(biāo)本中耶氏肺孢子。結(jié)果 71例患者中, 18名臨床診斷為PCP。巢式PCR檢測陽性結(jié)果25例，假陽性率為36.00%, 靈敏度、特異度、陽性預(yù)測值分別為88.89%、83.01%和64.00%。若閾值為103copies/mL, 實時熒光定量PCR的特異度和陽性預(yù)測值均顯著高于巢式PCR。PCP患者中，實時定量PCR檢測出耶氏肺孢子的基因載量顯著高于非PCP患者。結(jié)論 在HIV陰性免疫力低下患者中, RT-PCR較巢式PCR能更準(zhǔn)確、快速地診斷PCP, 并可區(qū)分耶氏肺孢子定植與感染。

實時熒光定量PCR; 診斷; 肺孢子肺炎; HIV陰性免疫力低下

耶氏肺孢子(PJ), 又名卡氏肺孢子(PC), 是一種真菌，常常感染艾滋病(AIDS)患者及其他免疫力低下患者，引起肺孢子肺炎(PCP)。PCP患者若不經(jīng)積極的診斷與治療，死亡率高達100%。對于人類免疫缺陷病毒(HIV), 其陽性和陰性的PCP患者的臨床表現(xiàn)差異很大，其中HIV陰性的患者往往發(fā)病更急、病情更重，病死率更高[1]。HIV陰性患者體內(nèi)的P.jiroveci病原體載量比HIV陽性者更低，這大大降低了HIV陰性患者的病原體檢出率。PCP的早期診斷較為困難，主要通過染色法檢測患者呼吸道樣本，以檢出PJ的包囊或滋養(yǎng)體為確診依據(jù)[2]。聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)是一種用于擴增特定DNA片段的分子生物學(xué)技術(shù)，該技術(shù)可以通過檢測患者肺泡灌洗液中PJ的DNA用于確診PCP, 成功率較高[3]。實時熒光定量PCR是近年來發(fā)展起來的核酸定量技術(shù)，具有敏感性高、準(zhǔn)確性高、污染少的優(yōu)勢，可大大降低PJ檢出的假陽性率，提高檢測的特異性[4]。然而，大多數(shù)研究均使用支氣管肺泡灌洗液(BALF)為標(biāo)本，多數(shù)PCP患者的病情危重，往往不能耐受支氣管肺泡灌洗這類侵襲性操作。本實驗比較了RT-PCR和普通PCR檢測HIV陰性免疫力低下患者痰液中的PJ載量，現(xiàn)報告如下。

1 資料與方法

1.1 標(biāo)本來源

收集2012年6月—2013年1月重慶醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院收治的71例HIV陰性免疫力低下患者的痰液標(biāo)本，其中包含23例結(jié)締組織疾病患者, 21例腫瘤放化療患者, 15例血液系統(tǒng)疾病患者, 7例肝移植患者以及5例腎移植患者。所有患者HIV抗體均為陰性。納入標(biāo)準(zhǔn): ① CT片等影像學(xué)檢查可見磨玻璃樣改變和(或)肺間質(zhì)彌漫浸潤病變等典型表現(xiàn); ② 抗PJ類抗生素藥物治療有效，但對其他抗生素治療無反應(yīng)和(或)顯微鏡下檢測出PJ; ③ 合并非刺激性咳嗽、呼吸急促、進行性缺氧等典型體征; ④ 患者簽署知情同意書。排除無法配合研究者。

1.2 試劑

Taq酶、dNTP、SYBR Premix Ex Taq(Tli RNaseH Plus)購自大連寶生物工程有限公司; DNA提取試劑盒購自上海生物工程有限公司; PMD18-T、DH5a等引物購自上海英濰捷基貿(mào)易有限公司; 分子量標(biāo)準(zhǔn)100 bp LadderⅡ、QIAGEN QIAprep Miniprep試劑盒購自重慶鼎國生物有限公司。

1.3 方法

1.3.1 標(biāo)本處理及DNA提取[5-7]: 收集患者清晨第一口痰液，約3 mL, 先加入3 mL的無水乙醇于4 ℃冷藏30 min, 然后在14 000 r/min條件下離心7 min, 取沉淀，并加入2 mL 0.1%DTT溶液, 37 ℃水浴30 min后14 000 r/min離心5 min, 棄上清，沉淀用PBS-EDTA洗滌2次后，棄上清, -80 ℃保存。參照說明書，采用DNA提取試劑盒從處理后的痰液標(biāo)本中提取DNA, -20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2 ITS-巢式PCR法：以提取的基因組DNA為模版，進行ITS-巢式PCR擴增。參照文獻[8], 設(shè)計擴增PJ ITS1-5.8S rRNA-ITS2基因的外引物為1724F: 5′-AAGTTGATCAAATTTGGTC-3′, ITS2R: 5′-CTCGGACGAGGATCCTCGCC-3′; 內(nèi)引物為ITS1F: 5′-CGTAGGTGAACCTGCGGAAGGATC-3′, ITS2R1: 5′-GTTCAGCGGGTGATCCTGCCTG-3′。

采用20 μL反應(yīng)體系，第一步反應(yīng)體系包括: 10×PCR Buffer 2 μL, dNTP Mixture 1 μL, MgCl21.5 μL, 20 μmol/L 引物各2 μL, 5.0 U Taq 酶0.5 μL, 模版DNA 3 μL, 滅菌蒸餾水 8 μL。第二步反應(yīng)體系模版DNA為第一步PCR反應(yīng)產(chǎn)物2 μL, 滅菌蒸餾水9 μL, 其余成分同第一步反應(yīng)體系。第一步反應(yīng)條件: 94 ℃預(yù)變性5 min, 94 ℃變性1 min, 47 ℃退火1 min, 72 ℃延伸1.5 min, 30個循環(huán)后72 ℃延伸8 min。第二步反應(yīng)條件: 94 ℃預(yù)變性5 min, 94 ℃變性1 min, 62 ℃退火1 min, 72 ℃延伸1 min, 30個循環(huán)后72℃延伸8 min。取5 μL第二步PCR擴增產(chǎn)物于1×TBE電泳緩沖液中進行瓊脂糖凝膠電泳，用紫外線凝膠成像系統(tǒng)分析儀觀察結(jié)果。

1.3.3 標(biāo)準(zhǔn)品制備及標(biāo)準(zhǔn)曲線建立：以ITS基因測序證實含有PJ的DNA為模版，參照1.6引物、反應(yīng)體系和擴增條件擴增PJ ITS基因，將擴增的目的片段(約500 bp)做TA克隆，載體為PMD18-T, 然后轉(zhuǎn)化入感受態(tài)細胞DH5a, 參照QIAGEN QIAprep Miniprep說明書將標(biāo)準(zhǔn)樣品基因片段與載體重組質(zhì)粒小量制備及測序驗證，制備標(biāo)準(zhǔn)品。

將構(gòu)建好的標(biāo)準(zhǔn)品質(zhì)粒測OD值為1.97, 濃度為16.9 ng/μL, 質(zhì)粒拷貝數(shù)為5.41×109copies/μL。取1 μL重組質(zhì)粒，稀釋100倍后作為標(biāo)準(zhǔn)品。用已知起始拷貝數(shù)的標(biāo)準(zhǔn)樣品做出標(biāo)準(zhǔn)曲線，其中以起始拷貝數(shù)的對數(shù)為橫坐標(biāo)，以Ct值為縱坐標(biāo), 10倍梯度稀釋5.41×(10～107)制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，回歸系數(shù)R2=0.999, 具有良好的線性關(guān)系，斜率(slope)為-3.332, 換算成擴增效率E=10-1/slope-1=0.995, 符合0.8～1.2的有效范圍。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線由每個樣本擴增的Ct值計算樣本的起始拷貝數(shù)。

1.3.4 RT-PCR: 參照文獻[9], PJ ITS-RT-PCR的上游引物為5′-CAGAAAAAA GGGGATTGGGC-3′, 下游引物為5′-TCCCAGCGAATTTTTACG ACAC-3′。選擇SYBR Premix Ex Taq 12.5 μL的反應(yīng)體系, DNA模版2 μL, 上游引物0.5 μL, 下游引物0.5 μL, 滅菌蒸餾水 9.5 μL, 共25 μL。反應(yīng)條件: 95 ℃ 2 min(1個循環(huán)), 95 ℃ 10 s、60 ℃ 30 s、70 ℃ 30 s(40個循環(huán))，溶解溫度 70～95 ℃。擴增結(jié)束后進行溶解曲線分析。每次擴增均設(shè)陰性對照(滅菌蒸餾水為模版)，監(jiān)測污染和引物二聚體; 設(shè)立梯度稀釋的標(biāo)準(zhǔn)樣品管，用于繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。每份模版采取3管平行檢測。

1.4 判斷標(biāo)準(zhǔn)和結(jié)果評價

本試驗設(shè)定大于103copies/mL為陽性，小于103copies/mL為陰性。以臨床PCP診斷結(jié)果為標(biāo)準(zhǔn)計算巢式PCR和RT-PCR的靈敏度、特異度、陽性預(yù)測值、陰性預(yù)測值及假陽性率。

1.5 統(tǒng)計學(xué)分析

采用SPSS 13.0軟件進行統(tǒng)計學(xué)分析，計數(shù)資料用率表示，采用卡方檢驗，計量資料以均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，采用t檢驗。P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 病例臨床特征和PCP診斷

71例研究對象中，按上述臨床診斷標(biāo)準(zhǔn), 18例診斷為PCP, 包含5例腫瘤放化療患者、4例血液系統(tǒng)疾病患者、4例結(jié)締組織疾病和5例肝腎臟疾病患者。在確診的18例患者中, 14例曾經(jīng)大劑量使用過免疫抑制劑如皮質(zhì)類激素等, 4例未使用免疫抑制劑的患者中, 1例是肺癌患者經(jīng)放射治療過后患病，另3例患者為血液系統(tǒng)疾病患者。巢式PCR結(jié)果顯示16例患者檢測出PJ, 2例結(jié)果為陰性。而標(biāo)本鏡下檢測出PJ的只有2例，陽性檢出率為11.1%, 顯著低于巢式PCR 88.9%的陽性檢出率(P<0.05)。

2.2 RT-PCR測定的起始拷貝數(shù)

根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計算樣本的起始拷貝數(shù)[10], 結(jié)果顯示, 16例標(biāo)本的PJ DNA呈陽性，陽性標(biāo)本PJ DNA定量在1.02×103～1.59×107copies/mL。同時, RT-PCR檢出PJ DNA的載量在PCP患者中為8.65×101～1.59×107copies/mL, 顯著高于非PCP患者的0～1.02×103copies/mL(P<0.05)。

2.3 巢式PCR和RT-PCR比較

71例痰液標(biāo)本經(jīng)臨床診斷確診，陽性患者18例，陰性患者53例。巢式PCR結(jié)果顯示16例真陽性, 9例假陽性, 44例真陰性, 2例假陰性，其靈敏度、特異度、陽性預(yù)測值和陰性預(yù)測值分別是88.89%、83.01%、64.00%和95.65%。RT-PCR結(jié)果顯示, 15例真陽性, 1例假陽性, 52例真陰性, 3例假陰性，其靈敏度、特異度、陽性預(yù)測值和陰性預(yù)測值分別是83.33%、98.11%、93.75%和94.55%。與巢式PCR相比, RT-PCR的假陽性患者更少，真陰性患者更多，兩種方法有相近的靈敏度，但RT-PCR的特異度和陽性預(yù)測值顯著高于巢式PCR(P<0.05)。見表1。

表1 兩種方法的檢測結(jié)果比較

與巢式PCR比較, *P<0.05。

3 討 論

臨床上痰液用于診斷PCP具有一定的診斷價值，尤其對于艾滋病患者，但其檢測PCP的靈敏度較低[11]。對于部分非艾滋病的PCP患者，尤其是PJ載量低于HIV陽性的PCP患者，痰液鏡檢的靈敏度更低。大量研究[12-14]證明，巢式PCR檢測痰液或BALF時，其診斷PCP的靈敏度比傳統(tǒng)鏡檢法更高，但是對于無癥狀的PJ定植者或亞臨床感染者中，巢式PCR檢查的假陽性率較高。本研究中，巢式PCR的陽性預(yù)測值僅為64.00%, Weig M的研究結(jié)果也印證了這一點。

近年來，國外已有大量研究將RT-PCR檢測PJ用于診斷PCP, 但國內(nèi)卻鮮有相關(guān)報道。已有研究[15-17]發(fā)現(xiàn)，使用患者BALF標(biāo)本時, RT-PCR對PJ無癥狀攜帶者和PCP患者的區(qū)分度良好。然而, HIV陰性的PCP患者呼吸道標(biāo)本中的PJ載量顯著低于HIV陽性者，因此RT-PCR用于診斷PCP的閾值應(yīng)針對HIV陽性和陰性患者有所不同。不同標(biāo)本的PJ DNA載量不一，因此痰液和BALF的閾值也應(yīng)有所差異。本研究旨在尋找出一個適用于痰液標(biāo)本的RT-PCR閾值，用于HIV陰性免疫力低下患者PCP的診斷。

對于PJ而言, ITS基因的拷貝數(shù)可反映病原體載量，因此本實驗選擇ITS基因作為靶基因。結(jié)果顯示，當(dāng)閾值為103copies/mL時, RT-PCR與巢式PCR有相似的高靈敏度，但特異度和陽性預(yù)測值遠遠高于巢式PCR, 表明RT-PCR可大大降低假陽性檢測率[18-19]。同時，檢測結(jié)果表明，臨床非PCP患者的PJ DNA載量明顯偏低。因此，將PJ DNA載量低于103copies/mL作為確定PJ定植的標(biāo)準(zhǔn)，治療時無需應(yīng)用抗肺孢子藥物，而將PJ DNA載量高于103copies/mL確定為PJ感染的標(biāo)準(zhǔn)，應(yīng)積極治療，降低病死率。

綜上所述，對于HIV陰性免疫力低下的患者，使用痰液為標(biāo)本時, RT-PCR有助于準(zhǔn)確而快速地診斷PCP, 并且可以區(qū)分PJ定植與感染，較直接鏡檢及巢式PCR更有參考價值。

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RT-PCR detection for pneumocystis jirovecii in phlegm of patients with HIV-negative hypoimmunity

SHE Xuan1, YAO Yunqing2, ZHAO Chuan1

(1.DepartmentofInfection,SuiningCentralHospital,Suining,Sichuan, 629000;2.TheFirstHospitalAffiliatedtoChongqingMedicalUniversity,Chongqing, 400016)

Objective To explore the value of RT-PCR in diagnosis of patients with HIV-negative hypoimmunity and pneumocystis pneumonia (PCP). Methods Totally 71 phlegm samples of pulmonary infection patients with suspected PCP and HIV-negative hypoimmunity were selected. ITS-nested PCR and ITS-real-time fluorescence quantitative PCR were used to detect pneumocystis jiroveci in samples. Results Among the 71 patients, 18 cases were diagnosed as PCP. There were 25 cases with positive results by n-PCR, but the false-positive rate was 36.00%, and sensitivity, specificity and positive predictive values of n-PCR were 88.89%, 83.01% and 64.00%, respectively. If the threshold was 103copies/mL, the specificity and positive predictive value of RT-PCR were significantly higher than n-PCR. In patients with PCP, the the gene load of pneumocystis by RT-PCR was significantly higher than non-PCP patients. Conclusion In patients with HIV-negative hypoimmunity, RT-PCR is more accurate and rapid than nested PCR in the diagnosis of PCP, and it can distinguish the infection and colonization of pneumocystis.

RT-PCR; diagnosis; pneumocystis pneumonia; HIV-negative hypoimmunity

2017-01-11

R 593.3

A

1672-2353(2017)09-069-04

10.7619/jcmp.201709018