HPLC法測(cè)定龍須藤乙酸乙酯部位中4種黃酮類成分的含量

孫承韜 賴 昕 張 華 陳抒云 葉永華 徐 偉

福建中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，福建 福州 350122

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HPLC法測(cè)定龍須藤乙酸乙酯部位中4種黃酮類成分的含量

孫承韜 賴 昕 張 華 陳抒云 葉永華 徐 偉*

福建中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，福建 福州 350122

目的：建立HPLC測(cè)定龍須藤乙酸乙酯部位中3’,4’,5’,5,7-五甲氧基黃酮、楊梅素、槲皮素和山奈酚含量的方法，考察不同產(chǎn)地龍須藤中4種黃酮類成分的含量。方法：Diamonsil C18 色譜柱(250×4.6 mm，5μm)，流動(dòng)相乙腈(A)-0.1%的磷酸(B)，梯度洗脫(0 min，25 % A，75 % B；15 min，45 % A，55 % B；40 min，50 % A，50 % B)，流速為0.8 mL/min，檢測(cè)波長(zhǎng)為324 nm。結(jié)果：3’,4’,5’,5,7-五甲氧基黃酮、楊梅素、槲皮素和山奈酚進(jìn)樣量10 μL分別在0.5100～5.100 μg(r=0.9962)、0.1006～50.30 μg(r= 0.9998)、1.440～288.0 μg(r=0.9997)和0.2910～14.55 μg(r=0.9998)以上濃度范圍內(nèi)與峰面積呈良好的線性關(guān)系，平均回收率分別為99.48 %、99.32 %、98.99 %和98.75 %，RSD分別為0.40 %、0.62 %、0.50 %和0.44 %(n=6)。結(jié)論：該方法操作簡(jiǎn)單，穩(wěn)定性、精密度、重復(fù)性良好，適合于測(cè)定該藥材中3’,4’,5’,5,7-五甲氧基黃酮、楊梅素、槲皮素和山奈酚含量的測(cè)定。

高效液相色譜；龍須藤；黃酮；含量測(cè)定

龍須藤又稱羊蹄藤、烏郎藤、過(guò)崗圓龍、九龍?zhí)?、梅花入骨丹等，為雙子葉植物豆科羊蹄甲屬植物多年生藤，分布于華東、華中、華南、西南等地。龍須藤作為一種畬醫(yī)病證論治中針對(duì)痹癥治療的特色藥，其苦、澀、平，具有祛風(fēng)除濕，活血止痛，健脾理氣等功效[1]，臨床用于治療風(fēng)濕痹痛、中風(fēng)偏癱、胃脘脹痛、跌打損傷、小兒疳積、痢疾等癥[2]。龍須藤乙酸乙酯部位是龍須藤抗炎鎮(zhèn)痛、治療類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的有效部位[3]，其主要化學(xué)成分為黃酮類，另外還含有原花青素類、揮發(fā)油、糖類及沒食子酸等成分[4]，現(xiàn)代藥理研究表明龍須藤提取物具有較強(qiáng)的抗炎、鎮(zhèn)痛等活性[5-6]，其中總黃酮的抗炎作用顯著[7]。目前，對(duì)龍須藤的基礎(chǔ)研究尚不夠深入，且其抗類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的有效成分尚不清楚，以主要成分為基礎(chǔ)的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究較少。因此，實(shí)驗(yàn)采用HPLC對(duì)龍須藤藥材中3’,4’,5’,5,7-五甲氧基黃酮、楊梅素、槲皮素和山奈酚進(jìn)行含量測(cè)定，以對(duì)龍須藤藥材的質(zhì)量進(jìn)行有效控制。

1 儀器與試藥

1.1 儀器 XS105Du十萬(wàn)分之一電子天平(Mettler Toledo)；SHIMADZU LC-20A配SPD-20A雙波長(zhǎng)紫外檢測(cè)器(日本島津)；Milli-Q純水器(Millipore公司，美國(guó))。

1.2 試藥 3’,4’,5’,5,7-五甲氧基黃酮對(duì)照品(批號(hào)：MUST-05071306，成都曼思特生物科技有限公司)；楊梅素對(duì)照品(批號(hào)：MUST-04102214，成都曼思特生物科技有限公司)槲皮素標(biāo)準(zhǔn)品(批號(hào)：100081-200406，中國(guó)藥品生物制品檢定所)；山奈酚對(duì)照品(批號(hào): 0861-200002，中國(guó)藥品生物制品檢定所)；藥材由江蘇藥物研究所提供，經(jīng)福建中醫(yī)學(xué)院藥學(xué)系中藥鑒定教研室楊成梓副教授鑒定為豆科羊蹄甲屬植物龍須藤Bauhinia championii Benth.的藤；乙腈為色譜純(美國(guó)DIKMA公司)；實(shí)驗(yàn)用水為超純水，其他試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件及系統(tǒng)適應(yīng)性試驗(yàn) Diamonsil C18 色譜柱(250×4.6mm，5μm)，流動(dòng)相乙腈(A)-0.1%的磷酸(B)，梯度洗脫(0min，25 % A，75 % B；15min，45 % A，55 % B；40min，50 % A，50 % B)，柱溫為30 ℃，檢測(cè)波長(zhǎng)為324nm，流速為0.8mL/min，進(jìn)樣量為10μL。在此色譜條件下，3’,4’,5’,5,7-五甲氧基黃酮、楊梅素、槲皮素、山奈酚4種成分色譜峰理論板數(shù)不低于1500，峰間分離度良好。結(jié)果見圖1。

2.2 對(duì)照品溶液的制備 分別精密稱取3’,4’,5’,5,7-五甲氧基黃酮、楊梅素、槲皮素、山奈酚標(biāo)準(zhǔn)對(duì)照品適量，置于量瓶中，加入甲醇分別制備含8.30、5.03、0.96、2.92 mg/mL單一對(duì)照品儲(chǔ)備液。混合對(duì)照品溶液均由各標(biāo)品儲(chǔ)備液混合并稀釋得到，均置于4 ℃保存。 2.3 供試品溶液的制備 取龍須藤干燥藥材2 kg，95 %乙醇浸泡回流提取，提取3次后合并提取液，加熱濃縮后加適量水混懸，依次用石油醚(1∶1)、乙酸乙酯(1∶1)進(jìn)行萃取，得乙酸乙酯部位13.810 g。取龍須藤乙酸乙酯部位0.35021 g，置于100 mL的量瓶中，加甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻后用0.45 μm的微孔濾膜過(guò)濾，作為供試品溶液。2.4 線性關(guān)系的考察 分別將不同濃度梯度對(duì)照品溶液按照“2.1”項(xiàng)下的色譜條件進(jìn)行分析，以峰面積為縱坐標(biāo)，對(duì)照品溶液的濃度為橫坐標(biāo)，得到4種成分的回歸方程和相關(guān)系數(shù)，見表1。由表1可知，4種黃酮類成分在相應(yīng)的濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

表1 四種黃酮類成分標(biāo)準(zhǔn)曲線

2.5 精密度試驗(yàn) 分別取對(duì)照品原始溶液，按照“2.1”項(xiàng)下的色譜條件連續(xù)進(jìn)樣6次，計(jì)算得4種黃酮類成分(3’,4’,5’,5,7-五甲氧基黃酮、楊梅素、槲皮素、山奈酚)的峰面積的RSD分別為1.10 %、1.41 %、1.59 %、1.73 %，表明儀器的精密度良好。2.6 重復(fù)性試驗(yàn) 取同一批次龍須藤藥材，按“2.3”項(xiàng)下方法得到乙酸乙酯部位并制備供試品溶液，平行制備6份供試品溶液，測(cè)定峰面積，計(jì)算藥材中3’,4’,5’,5,7-五甲氧基黃酮的平均含量為(n=6，RSD=1.57 %)、楊梅素的平均含量為(n=6，RSD=1.64 %)、槲皮素的平均含量為(n=6，RSD=1.15 %)和山奈酚的平均含量為(n=6，RSD=1.86 %)，表明方法的重復(fù)性良好。2.7 穩(wěn)定性試驗(yàn) 同一批次龍須藤藥材，按“2.3”項(xiàng)下方法得到乙酸乙酯部位并制備供試品溶液，分別于制備好后的0、2、4、8、12、24 h測(cè)定峰面積，得供試品溶液中4種黃酮類成分(3’,4’,5’,5,7-五甲氧基黃酮、楊梅素、槲皮素、山奈酚)在24h內(nèi)的峰面積RSD分別為1.98 %、1.57 %、1.01 %、1.57 %，表明供試品溶液在制備好后的24 h內(nèi)穩(wěn)定。2.8 加樣回收率試驗(yàn) 取已知3’,4’,5’,5,7-五甲氧基黃酮、楊梅素、槲皮素和山奈酚濃度的龍須藤乙酸乙酯部位粉末0.35g，共6份，精確稱定，置入100mL容量瓶中，分別精確加入質(zhì)量濃度4.98mg/mL的3’,4’,5’,5,7-五甲氧基黃酮對(duì)照品溶液2.70mL、質(zhì)量濃度0.08mg/mL的楊梅素對(duì)照品溶液0.8mL、質(zhì)量濃度為0.96mg/mL的槲皮素對(duì)照瓶溶液2.00mL及質(zhì)量濃度0.23mg/mL的山奈酚對(duì)照品溶液1mL。加甲醇溶解并稀釋至刻度，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件，注入高效液相色譜儀測(cè)定，計(jì)算4 種成分的平均回收率。結(jié)果見表2。

表2 加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果 (n=6)

2.9 樣品的測(cè)定 分別稱取不同產(chǎn)地龍須藤藥材2 kg，按“2.3”項(xiàng)下方法操作，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件測(cè)定，計(jì)算這4種黃酮類成分的含量，結(jié)果表明，不同產(chǎn)地龍須藤乙酸乙酯部位中黃酮類成分含量均有一定差異。結(jié)果見表3。

表3 不同產(chǎn)地龍須藤藥材乙酸乙酯部位中4種黃酮類成分的平均含量 (n=3)

3 討論

3.1 供試樣品溶液的配制 對(duì)龍須藤中4種黃酮類成分的提取，實(shí)驗(yàn)中曾采用超聲提取、浸漬法和回流提取這3種方法，結(jié)果超聲提取法重復(fù)性較差，浸漬法提取法提取效果較回流提取差，綜合評(píng)定，最終選用回流提取。

3.2 流動(dòng)相的選擇 實(shí)驗(yàn)比較了甲醇-水、甲醇-0.1%磷酸、乙腈-水以及乙腈-0.1 %磷酸，結(jié)果表明乙腈-0.1 %磷酸溶液對(duì)黃酮類成分的分離較好，保留時(shí)間適宜，峰型好，加入0.1 %磷酸能有效改善拖尾效應(yīng)；采用梯度洗脫可明顯改善特征峰的分離度，使其與其他雜質(zhì)成分有效分離，故本實(shí)驗(yàn)用乙腈-0.1%磷酸溶液作為流動(dòng)相。

3.3 不同產(chǎn)地龍須藤藥材的質(zhì)量差異 實(shí)驗(yàn)通過(guò)考察龍須藤乙酸乙酯部位中四種黃酮類成分的含量，對(duì)不同產(chǎn)地的龍須藤進(jìn)行測(cè)定。經(jīng)測(cè)定：福建閩侯所產(chǎn)龍須藤中的3’,4’,5’,5,7-五甲氧基黃酮和槲皮素含量最高，3’,4’,5’,5,7-五甲氧基黃酮含量為廣東清遠(yuǎn)所產(chǎn)龍須藤的1.57倍；槲皮素含量為福建永泰所產(chǎn)龍須藤的1.39倍。福建永泰所產(chǎn)龍須藤中楊梅素含量最高，含量為廣東清遠(yuǎn)所產(chǎn)龍須藤的1.27倍。福建連江所產(chǎn)龍須藤中的山奈酚含量最高，含量為廣東清遠(yuǎn)所產(chǎn)龍須藤的2.53倍。綜上，四種黃酮類成分中，產(chǎn)地差異最明顯的為山奈酚。

[1]南京中醫(yī)藥大學(xué).中藥大辭典(上)[M].2版.上海:上?？茖W(xué)技術(shù)出版社，2006:878.

[2]廣東省食品藥品監(jiān)督管理局.廣東省中藥材標(biāo)準(zhǔn)(第2冊(cè))[M].廣州:廣東科技出版社,2011:114.

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Determination of Four Flavonoid Components in Ethyl AcetateParts of BauhiniaChampionii by HPLC

SUN Chengtao LAI Xin ZHANG Hua CHEN Shuyun YE Yonghua XU Wei*

Pharmacy college of Fujian University of Traditional Chinese Medicine,Fuzhou 350122,China

Objective To establish a quantitative determination method of HPLC for Four flavonoid components in ethyl acetate parts of Bauhinia championii.To investigate the content of 4 kinds of flavonoids in different regions of bauhinia championii.Methods The determination was performed on a Diamonsil ODS column (250mm× 4.6mm，5μm) with acetonitrile(A)-0.1% phosphoric acid(B) as the mobile phase by gradint elution(0min,25%A, 75% B;15min,45%A, 55%B; 40min,50%A,55%B).The flow rate was 0.8 mL/min and the detection wavelength was set at 324 nm.Results 3’,4’,5’,5,7-pentamethoxyflavone,Myricetin,Quercetin and Kaempferol injection volume 10uL respectively 0.1674mg/mL ～ 1.674mg / mL (r=0.9998), 0.0688mg/mL ～ 0.6880mg/mL(r=0.9998) and 0.1704mg / mL～1.7040mg /mL(r=0.9997) within the above range of concentrations peak area with excellent linearity.3’,4’,5’,5,7-pentamethoxyflavone,Myricetin,Quercetin and Kaempferol average recoveries were respectively 99.48 %, 99.32 %, 98.99 % and 98.75 %,RSDwere respectively 0.40 %, 0.62 %, 0.50 % and 0.44 %(n=6).Conclusion This method is simple and in good reproducibility, precision and stability. It can be used as the quality control of the four flavonoid components in ethyl acetate parts of Bauhinia championii.

HPLC; Bauhinia Championii; Flavonoids; Quantitative Determination

福建省高等學(xué)校新世紀(jì)優(yōu)秀人才支持計(jì)劃(閩教科〔2015〕54號(hào))；國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(81674046)。

孫承韜(1992-)，男，漢族，碩士研究生在讀，研究方向?yàn)樘烊划a(chǎn)物的提取和分離。E-mail:363937598@qq.com

徐偉(1975-)，男，漢族，博士，教授，碩士研究生導(dǎo)師，研究方向?yàn)樘烊划a(chǎn)物的提取和分離。E-mail：xwfjtcm@sina.com

R284.1

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1007-8517(2017)09-0016-04

2017-03-06 編輯：陶希睿)