高效液相色譜法測(cè)定牙膏中的氨甲環(huán)酸

楊 培，譚建華，李慧勇，王繼才，夏澤敏，熊小婷，劉家溍，李燕飛

(廣州質(zhì)量監(jiān)督檢測(cè)研究院，廣東 廣州 510000)

高效液相色譜法測(cè)定牙膏中的氨甲環(huán)酸

楊 培*，譚建華，李慧勇，王繼才，夏澤敏，熊小婷，劉家溍，李燕飛

(廣州質(zhì)量監(jiān)督檢測(cè)研究院，廣東 廣州 510000)

建立了丹磺酰氯柱前衍生/高效液相色譜測(cè)定牙膏中氨甲環(huán)酸(TA)的方法。牙膏經(jīng)甲醇提取、氮吹至干，再用丹磺酰氯進(jìn)行衍生。衍生物通過(guò)X-Bridge C18色譜柱(250 mm×4.6 mm×5 μm)分離，以乙腈和0.1%甲酸水溶液為流動(dòng)相梯度洗脫，在紫外波長(zhǎng)250 nm條件下進(jìn)行定量測(cè)定。系統(tǒng)考察了緩沖溶液pH值、衍生溫度和衍生時(shí)間對(duì)氨甲環(huán)酸衍生效率的影響。結(jié)果表明，在優(yōu)化實(shí)驗(yàn)條件下，氨甲環(huán)酸衍生物與基體雜質(zhì)達(dá)到有效分離，在1～425 mg/L范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，相關(guān)系數(shù)為0.999 5；在20，200，1 600 mg/kg 3個(gè)加標(biāo)濃度下的回收率為98.7%～102%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.85%～2.5%，方法檢出限為2.0 mg/kg。該方法準(zhǔn)確、可靠、靈敏度高，適用于各類牙膏中氨甲環(huán)酸的測(cè)定。

氨甲環(huán)酸(TA)；丹磺酰氯；牙膏；高效液相色譜法

氨甲環(huán)酸，又名凝血酸、止血環(huán)酸,是一種合成的氨基酸類抗纖溶制劑[1]，其作用機(jī)制為通過(guò)抑制纖溶酶與纖維蛋白上賴氨酸的結(jié)合，降低纖溶酶降解纖維蛋白[2-3]，從而達(dá)到止血、抗感染、促進(jìn)上皮愈合與引導(dǎo)血管再生的功效[4-5]。1991年，欒慶先等[6]對(duì)含氨甲環(huán)酸牙膏的臨床效果做了簡(jiǎn)單的測(cè)試和評(píng)價(jià)，結(jié)果表明使用含氨甲環(huán)酸牙膏后，患者的牙齦出血狀況得到緩解。近期，行業(yè)調(diào)研結(jié)果顯示，氨甲環(huán)酸作為緩解牙齦出血等癥狀的功效成分越來(lái)越廣泛地被應(yīng)用于牙膏的配方中。然而，氨甲環(huán)酸作為一種藥物，在牙膏中過(guò)量添加可能會(huì)造成潛在危害。因此，為了促進(jìn)企業(yè)更好的把控產(chǎn)品質(zhì)量，保障消費(fèi)者的健康安全，亟需建立牙膏中氨甲環(huán)酸的檢測(cè)方法。

目前，針對(duì)氨甲環(huán)酸的測(cè)定方法包括氣相色譜法[7]、氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法[8]、高效液相色譜法[9-12]、薄層掃描法[13]、分光光度法[14]、液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法[15]、熒光分析法[16-17]等。GB/T 32121-2015采用高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測(cè)定牙膏中氨甲環(huán)酸的含量，該方法靈敏度高，選擇性強(qiáng)。但由于液質(zhì)聯(lián)用儀價(jià)格相對(duì)昂貴，儀器的線性范圍較窄，以及牙膏中高濃度表面活性劑的基質(zhì)干擾等問(wèn)題限制了其應(yīng)用推廣。本研究采用丹磺酰氯柱前衍生/高效液相色譜建立了牙膏中氨甲環(huán)酸的測(cè)定方法，所生成的衍生物具有較理想的反相保留，且改善了氨甲環(huán)酸的紫外吸收特性，在增強(qiáng)定性可靠性的同時(shí)大大提升了方法靈敏度。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

高效液相色譜儀配置PDA二極管陣列檢測(cè)器(美國(guó)Waters公司2695-2998)，N-EVAP系列氮吹儀(美國(guó)Organomation公司)，Milli-Q 超純水器(美國(guó)Millipore公司)，Allegra 64R centrifuge臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)(美國(guó)Beckman Coulter公司)，電子分析天平(精度0.01 mg和0.1 mg)，pH計(jì)。氨甲環(huán)酸標(biāo)準(zhǔn)品(純度98%，上海Anpel公司)，丹磺酰氯(純度98%，美國(guó)賽默飛世爾科技有限公司)，甲酸、乙腈(色譜純，美國(guó)Spectrum公司)，無(wú)水碳酸氫鈉、氫氧化鈉(分析純，廣州試劑廠)，其他試劑均為分析純，實(shí)驗(yàn)用水為超純水。

1.2 標(biāo)準(zhǔn)溶液的制備

準(zhǔn)確稱取適量的氨甲環(huán)酸標(biāo)準(zhǔn)品(精確至0.01 mg)，用甲醇溶液配成約為500 mg/L 的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液，逐級(jí)稀釋成濃度分別為0，1，10，20，40，80 mg/L 的氨甲環(huán)酸系列標(biāo)準(zhǔn)工作溶液。

1.3 樣品的提取

稱取0.5 g 牙膏樣品(精確至0.1 mg)于10 mL 比色管中，甲醇定容，于渦旋振蕩器上混勻1 min，超聲提取10 min，靜置至室溫，得樣品溶液。

1.4 衍生化

標(biāo)準(zhǔn)溶液衍生化：取500 μL 氨甲環(huán)酸標(biāo)準(zhǔn)工作溶液至10 mL 比色管中，40 ℃ 下氮?dú)獯祾咧粮?，再依次加?00 μL 丹磺酰氯溶液(1 mg/mL，丙酮作為溶劑)和500 μL NaHCO3緩沖溶液(100 mmol/L，pH 9.5)，于渦旋振蕩器上混勻1 min，50 ℃水浴保溫3 min 后，混勻過(guò)濾，待測(cè)。

樣品溶液衍生化：取500 μL 的上述樣品溶液至10 mL 比色管中，其他衍生步驟與標(biāo)準(zhǔn)溶液衍生化步驟相同。

1.5 色譜條件

色譜柱：X-Bridge C18(250 mm×4.6 mm×5 μm)；流速：1.0 mL/min；檢測(cè)波長(zhǎng)：250 nm；進(jìn)樣量：10 μL；柱溫：30 ℃；流動(dòng)相：乙腈(A)和0.1%甲酸水溶液(B)，梯度洗脫程序：0～4 min，80% B；4～6 min，80%～57% B；6～20 min，57% B；20～22 min，57%～0% B；22～26 min，0% B；26～28 min，0%～80% B。

2 結(jié)果與討論

2.1 檢測(cè)波長(zhǎng)的選擇

在210～400 nm波長(zhǎng)范圍內(nèi)對(duì)氨甲環(huán)酸衍生物溶液進(jìn)行全波長(zhǎng)掃描，氨甲環(huán)酸衍生物在250，320 nm處均有較大的紫外吸收，其中250 nm為其最大紫外吸收波長(zhǎng)，且溶劑、基質(zhì)的干擾較小，故選擇250 nm作為檢測(cè)波長(zhǎng)。

2.2 衍生試劑的選擇及條件優(yōu)化

氨甲環(huán)酸(TA)極性較強(qiáng)，且紫外吸收為末端吸收。在分析測(cè)試過(guò)程中，方法靈敏度較低且易被牙膏中其他成分干擾。因此，本研究嘗試采用柱前衍生法進(jìn)行分析。目前針對(duì)氨基基團(tuán)常用的衍生試劑有鄰苯二甲醛、苯甲酰氯、丹磺酰氯等，其中丹磺酰氯具有衍生操作簡(jiǎn)單、衍生物穩(wěn)定性好、熒光和紫外吸收較強(qiáng)、靈敏度高、反應(yīng)范圍寬、基體干擾不明顯等優(yōu)點(diǎn)[18-19]。因此本研究采用丹磺酰氯作為衍生試劑。

丹磺酰氯可與伯胺或仲胺基上的活潑氫反應(yīng)，脫掉1分子的HCl生成具有熒光和紫外吸收的衍生物，具體的磺?；磻?yīng)式如下：

圖1 緩沖溶液pH值對(duì)氨甲環(huán)酸衍生物響應(yīng)面積的影響Fig.1 Effect of pH values of buffer solution on response area of TA derivative

在這一反應(yīng)過(guò)程中起決定性作用的條件有緩沖溶液pH值、衍生溫度和衍生時(shí)間[20]。因此本研究針對(duì)這3個(gè)影響因素對(duì)氨甲環(huán)酸的柱前衍生反應(yīng)條件進(jìn)行優(yōu)化。2.2.1 緩沖溶液pH值的選擇 選擇NaHCO3緩沖溶液體系進(jìn)行試驗(yàn)，比較了不同pH值(4.5～12.0)條件下氨甲環(huán)酸的衍生效率。分別采用10% H3PO4水溶液和1% 氫氧化鈉水溶液調(diào)節(jié)NaHCO3溶液的pH值，其他反應(yīng)條件與“1.4”一致。由圖1可知，當(dāng)緩沖溶液pH<9.5時(shí)，氨甲環(huán)酸衍生物的響應(yīng)面積隨著緩沖液pH值的增大而逐漸增大；當(dāng)緩沖溶液pH>9.5時(shí)，氨甲環(huán)酸衍生物的響應(yīng)面積隨著緩沖液pH值的增大而逐漸減小。因此，本文選擇緩沖溶液最佳pH值為9.5，此時(shí)氨甲環(huán)酸的衍生效率最佳。

2.2.2 衍生化溫度的選擇 比較了不同溫度條件對(duì)氨甲環(huán)酸衍生效率的影響。結(jié)果顯示，當(dāng)衍生溫度<50 ℃時(shí)，氨甲環(huán)酸衍生物的響應(yīng)面積隨著溫度升高而逐漸增大；當(dāng)衍生溫度>50 ℃時(shí)，氨甲環(huán)酸衍生物的響應(yīng)面積隨著溫度升高而逐漸減小。因此，本研究選用50 ℃作為氨甲環(huán)酸柱前衍生化的最佳溫度。2.2.3 衍生化時(shí)間的選擇 比較了不同衍生反應(yīng)時(shí)間對(duì)氨甲環(huán)酸衍生效率的影響。結(jié)果顯示，當(dāng)柱前衍生化時(shí)間小于3 min時(shí)，隨著反應(yīng)時(shí)間的增加，氨甲環(huán)酸衍生物的響應(yīng)面積略微增大，當(dāng)柱前衍生化時(shí)間大于3 min時(shí)，繼續(xù)延長(zhǎng)反應(yīng)時(shí)間，氨甲環(huán)酸衍生物的響應(yīng)面積無(wú)明顯變化。因此適宜的反應(yīng)時(shí)間選擇為3 min。

2.2.4 衍生物穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn) 將氨甲環(huán)酸衍生后的溶液分別放置不同時(shí)間(0 h，2 h，8 h，1 d，2 d，3 d)，結(jié)果顯示，3 d內(nèi)氨甲環(huán)酸衍生物的響應(yīng)面積基本不變，說(shuō)明氨甲環(huán)酸衍生物在室溫下3 d內(nèi)穩(wěn)定。

2.3 線性關(guān)系與檢出限

配制濃度分別為1，10，20，40，80，200，425 mg/L的氨甲環(huán)酸系列標(biāo)準(zhǔn)溶液，在優(yōu)化實(shí)驗(yàn)條件下對(duì)氨甲環(huán)酸衍生物進(jìn)行測(cè)定，以質(zhì)量濃度(ρ，mg/L)為橫坐標(biāo)，峰面積(A)為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。結(jié)果表明，在1～425 mg/L范圍內(nèi)，氨甲環(huán)酸衍生物的線性關(guān)系良好，線性方程為A=19 500ρ+78 200，相關(guān)系數(shù)(r2)為0.999 5。以信噪比S/N≈3的濃度作為檢出限，S/N≈10 時(shí)的濃度作為定量下限，得到氨甲環(huán)酸的檢出限和定量下限分別為2.0 mg/kg和7.0 mg/kg，方法的靈敏度可滿足分析要求。

2.4 回收率與精密度

為了驗(yàn)證該方法對(duì)不同基質(zhì)牙膏樣品的適用性，選取3種不同配方體系的空白牙膏樣品(水合硅石，磷酸氫鈣和碳酸鈣體系)作為研究對(duì)象，分別加入低、中、高3個(gè)濃度(20，200，1 600 mg/kg)的氨甲環(huán)酸標(biāo)準(zhǔn)溶液，進(jìn)行加標(biāo)回收率實(shí)驗(yàn)。結(jié)果顯示，3個(gè)加標(biāo)水平的回收率為98.7%～102%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.85%～2.5%，表明方法具有較高的準(zhǔn)確度，且精密度良好(見(jiàn)表1)。

表1 氨甲環(huán)酸標(biāo)準(zhǔn)溶液的回收率與相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(n=5)Table 1 Recoveries and relative standard deviations(RSDs) of TA standard solution(n=5)

2.5 實(shí)際樣品的分析

采用本方法對(duì)8支市售牙膏樣品進(jìn)行氨甲環(huán)酸含量的測(cè)定。結(jié)果顯示，兩支中草藥牙膏檢出氨甲環(huán)酸，其含量分別為0.073%和0.043%，標(biāo)樣譜圖和實(shí)際樣品譜圖見(jiàn)圖2。

3 結(jié) 論

本研究采用丹磺酰氯柱前衍生/高效液相色譜建立了牙膏中氨甲環(huán)酸的檢測(cè)方法。對(duì)緩沖溶液的pH值、衍生溫度和衍生時(shí)間等條件進(jìn)行了優(yōu)化，并將該方法應(yīng)用于不同配方牙膏產(chǎn)品的檢測(cè)。結(jié)果表明：氨甲環(huán)酸衍生物能夠與雜質(zhì)進(jìn)行有效分離，不僅解決了目前檢測(cè)方法干擾多、靈敏度低等問(wèn)題，而且結(jié)果準(zhǔn)確、靈敏、可靠。

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Determination of Tranexamic Acid in Toothpaste by High Performance Liquid Chromatography

YANG Pei*，TAN Jian-hua，LI Hui-yong，WANG Ji-cai，XIA Ze-min，XIONG Xiao-ting，LIU Jia-jin，LI Yan-fei

(Guangzhou Quality Supervision and Testing Institute，Guangzhou 510000，China)

A high performance liquid chromatographic(HPLC) method was developed for the determination of tranexamic acid(TA) in toothpaste.Sample was extracted with methanol, and the extract was evaporated to dryness under nitrogen before it was derived with dansyl chloride.Chromatographic separation was performed on an X-Bridge C18(250 mm×4.6 mm×5 μm) column using 0.1% formic acid-acetonitrile mixture aqueous solution as mobile phase.The ultraviolet detection wavelength was set at 250 nm.Effects of pH value of buffer solution，reaction temperature and time were investigated.Under the optimized experimental conditions，the TA derivative was successfully separated from the other impurities, and showed a good linearity in the range of 1-425 mg/L with a correlation coefficient(r) of 0.999 5.At three spiked concentrations of 20，200，1 600 mg/kg，the recoveries ranged from 98.7% to 102% with relative standard deviations(RSDs) of 0.85%-2.5%.The limit of detection for this method was 2.0 mg/kg.With the advantages of accuracy，reliability and high sensitivity，this method was suitable for the determination of tranexamic acid in different kinds of toothpaste.

tranexamic acid(TA);dansyl chloride;toothpaste;high performance liquid chromatography(HPLC)

2016-12-12；

2017-01-20

10.3969/j.issn.1004-4957.2017.05.015

O657.72;TQ657.3

A

1004-4957(2017)05-0665-04

*通訊作者：楊 培，碩士，工程師，研究方向：日化產(chǎn)品的分析測(cè)試，Tel:020-82022324，E-mail:yangpei0917@163.com