基于小波-反向搜索及表面增強拉曼的食品中色素的光譜定性分析

彭 穎，張志敏 ，盧紅梅*，梁逸曾，劉 察，陳啟振，劉國坤

(1.中南大學(xué) 化學(xué)化工學(xué)院，湖南 長沙 410083；2.廈門大學(xué) 化學(xué)化工學(xué)院，福建 廈門 361000； 3.廈門大學(xué) 環(huán)境與生態(tài)學(xué)院 海洋環(huán)境科學(xué)國家重點實驗室，福建 廈門 361000)

基于小波-反向搜索及表面增強拉曼的食品中色素的光譜定性分析

彭 穎1,2，張志敏1，盧紅梅1*，梁逸曾1，劉 察1，陳啟振2，劉國坤3

(1.中南大學(xué) 化學(xué)化工學(xué)院，湖南 長沙 410083；2.廈門大學(xué) 化學(xué)化工學(xué)院，福建 廈門 361000； 3.廈門大學(xué) 環(huán)境與生態(tài)學(xué)院 海洋環(huán)境科學(xué)國家重點實驗室，福建 廈門 361000)

使用金納米粒子為增強因子的表面增強拉曼光譜技術(shù)，通過連續(xù)小波變換將拉曼光譜信號轉(zhuǎn)化到小波空間(墨西哥帽小波作為小波基)。該步驟能夠減輕信號中基線變化及隨機噪音的影響并找到峰位置和最佳小波尺度系數(shù)。依據(jù)小波空間中的信息，對混合物光譜及標(biāo)準(zhǔn)譜光譜進行反向搜索得到反向搜索匹配系數(shù)(Reverse match quality，RMQ)，作為判斷混合物中目標(biāo)成分是否存在的依據(jù)。該算法可對混合物中的目標(biāo)物質(zhì)進行準(zhǔn)確定性，并已成功應(yīng)用于多種食品中色素鑒定。食品中色素的檢出率達(dá)到99%，且結(jié)果穩(wěn)健，其效果明顯優(yōu)于傳統(tǒng)的命中質(zhì)量系數(shù)法(Hit quality index，HQI)。這證實了小波空間反向搜索方法是一種快速而準(zhǔn)確的拉曼光譜定性算法。

連續(xù)小波變換；反向搜索；表面增強拉曼光譜；快速定性

拉曼光譜分析方法是上世紀(jì)20年代逐步發(fā)展起來的一門技術(shù)。因其只需簡單的樣品前處理、對樣品無損害，并且能提供豐富的結(jié)構(gòu)信息而得到廣泛的應(yīng)用[1-2]。拉曼光譜數(shù)千個數(shù)據(jù)點中包含著物質(zhì)定性、定量信息，因此拉曼也被稱為指紋圖譜[3]。然而，對混合物中的特定物質(zhì)進行定性分析仍是難題和挑戰(zhàn)[4-5]。表面增強拉曼光譜(Surface enhanced Raman spectroscopy，SERS)具有增強拉曼信號的潛力，可通過納米級粗糙基底表面或者納米級金屬顆粒使信號得到增強[6]。Tian等[7-8]專注運用各種納米結(jié)構(gòu)以提高SERS活性，化學(xué)合成的金納米顆粒，可使信號增強104～105倍。但SERS方法在實際分析工作中，依然存在有熒光背景、隨機噪聲、交替基線、異形峰和樣品雜質(zhì)峰等問題。

為了降低這些問題的影響，研究者們提出了許多算法進行拉曼光譜分析[9-12]。數(shù)值微分法常用來得到局部極值，信噪比(Signal-to-noise ratio，SNR)閾值可剔除假陽性。使用特定的標(biāo)準(zhǔn)基將光譜數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)入新的數(shù)據(jù)空間，可有效發(fā)現(xiàn)基于特征檢測到的特征峰[13]。Zhang等[14]提出了基于懲罰最小二乘與小波變換的基線校正算法，使用墨西哥帽小波進行峰位置檢測，哈爾小波進行峰寬估計，最后采用懲罰最小二乘進行基線擬合。Shao等[15]提出了一種使用小波變換解析近紅外光譜中重疊峰的新方法，可以顯著提高近紅外光譜的分辨率。連續(xù)小波變換(Continuous wavelet transform，CWT)能保持原始數(shù)據(jù)的局部化特征，便于在原始數(shù)據(jù)中查找特征峰[16]。因此基于小波變換的峰檢測算法非常適合拉曼光譜中的峰檢測，通過特征峰比對，利于未知物的定性分析[17]。Chen等[18]提出了一種基于小波的峰值檢測、洛倫茲擬合和多項式擬合的光譜校正方法，可以大大減少甚至消除拉曼光譜儀之間的系統(tǒng)差異，是一種有效實用的方法。Zhang等[19-20]提出了基于小波峰檢測、反向搜索及非負(fù)最小二乘的混合物分析方法(Reverse searching and non-negative least square，RSearch-NNLS)，隨后又提出了多尺度峰檢測方法(Multi-scale peak detection，MSPD)以及遞歸小波峰檢測方法(Recursive wavelet peak detection，RWPD)，通過充分利用小波空間中的其他信息可以準(zhǔn)確檢測到峰。連續(xù)小波變換已經(jīng)成為峰檢測的主流方法之一。然而存在重疊峰、密集峰及弱峰時，基于連續(xù)小波變換的峰檢測方法未能達(dá)到完全滿意的效果?；谛〔ǚ鍣z測的反向檢索方法，提升了混合物中目標(biāo)組分自動化檢索的能力。反向搜索具有強抗干擾能力，能夠自動屏蔽基線與隨機噪音并得到穩(wěn)健的檢索結(jié)果[21]。

本文針對表面增強拉曼光譜進行定性分析，提出了快速而精準(zhǔn)的小波峰匹配算法。本算法基于多尺度峰檢測算法(MSPD)以及反向檢索方法。通過連續(xù)小波變換將信號直接轉(zhuǎn)入小波空間，隨后自動選擇小波空間中峰信息及其最佳小波系數(shù)進行反向檢索，得到反向搜索匹配系數(shù)(Reverse match quality，RMQ)作為定性依據(jù)。本方法已由食品中色素的定性分析實驗得到驗證，檢出率高達(dá)99%，其定性結(jié)果明顯優(yōu)于傳統(tǒng)的命中質(zhì)量系數(shù)法(Hit quality index，HQI)。

1 實驗部分

1.1 連續(xù)小波變換

連續(xù)小波變換具有同時提取時間和頻率信息的優(yōu)點。小波的基底函數(shù)，也稱作小波母函數(shù)，由一組子函數(shù)組成，a和b分別表示尺度和偏移常數(shù)，分別控制小波的尺度及位移：

*MERGEFORMAT(1)

s(t)表示輸入信號，ψ表示經(jīng)過特定的尺度及位移。因此，連續(xù)函數(shù)s(t)在尺度系數(shù)a和位移b時的連續(xù)小波變換的結(jié)果如下：

*MERGEFORMAT(2)

1.2 墨西哥小波峰檢測

為了能夠有效地提取信號信息，小波基需根據(jù)信號的特征有目的地進行選擇。本研究主要針對具有高度局部化特征的拉曼光譜，因此選擇的小波應(yīng)具有高斯峰及洛倫茲峰的特征。本文選擇墨西哥帽小波，其定義如下：

*MERGEFORMAT(3)

峰檢測算法包含3個步驟：①通過小波空間中的局部極值找到脊線；②基于脊線位置識別峰；③優(yōu)化峰檢測參數(shù)。

連續(xù)小波的方法可以非常有效地識別峰。如圖1A是1個有5個峰的模擬信號。圖1B是其小波系數(shù)，圖1C是信號的脊線，脊線對應(yīng)圖1B的紅色或者黃色區(qū)域。脊線是對峰位置的精確判斷。

圖1 模擬信號的小波系數(shù)及脊線 Fig.1 CWT coefficients，ridges of simulated signal with noise and baselineA.signal with noise and baseline;B.CWT coefficients;C.ridges

圖2 基于連續(xù)小波變換的峰檢測及反向檢索Fig.2 Dispaly the detected peaks and elucidate the reverse searching procedure

1.3 反向檢索算法

在光譜庫檢索方法中，兩個光譜(如未知物光譜和參考物光譜)的匹配程度由命中質(zhì)量系數(shù)(HQI)表征，HQI其定義如下[22]:

*MERGEFORMAT(4)

式中，A表示需要識別的光譜，L表示組成光譜庫的參考物光譜,p為向量維數(shù)。當(dāng)未知物光譜與參考物光譜完全相同時，HQI值為1.000，未知物光譜與參考物光譜的相似度越低，此值越接近0。HQI的數(shù)值可以用作匹配系數(shù)，它假定HQI是1個從0跨越到1的1組值，要驗證身份的材料，HQI必須超過預(yù)定的閾值。如果光譜中存在基線漂移及熒光背景，會顯著影響匹配結(jié)果，HQI區(qū)分不同材料的效用也將降低[23]。

眾所周知，在分析純物質(zhì)時，正向搜索優(yōu)于反向搜索，而反向搜索在分析混合物時有明顯的優(yōu)勢。在檢索及匹配的過程中，光譜庫中標(biāo)準(zhǔn)品光譜作為參考標(biāo)準(zhǔn)，在檢索未知物光譜時只選擇與參考光譜對應(yīng)的強度信息，其它干擾信息可以自動忽略。即便未知譜中少量的特征峰處于重疊峰中，反向搜索也能識別出這些峰。此外，基于反向搜索的程序可以模擬人工解譜時進行峰與峰之間的匹配比對，比較穩(wěn)健有效，而這個過程可以通過連續(xù)小波變換的峰檢測功能實現(xiàn)[24-25]。

未知譜和參考譜的匹配系數(shù)可由以上方法得到。從圖2可以了解到連續(xù)小波變換及反向搜索的過程。參考光譜為莧菜紅色素的標(biāo)準(zhǔn)品光譜，樣品譜為含有莧菜紅色素的混合物光譜。圖2A和C分別表示在小波空間中檢索到的脊線。而圖2B闡明了反向搜索的程序及檢測到的峰，根據(jù)脊線，標(biāo)準(zhǔn)譜的峰可用于反向搜索算法。

反向搜索匹配系數(shù)(RMQ)的定義為：

(5)

此算法特別適用于混合物檢索光譜庫，其中pL為向量，pL,i為光譜庫中某條光譜第i個特征峰與其尺度最匹配的小波函數(shù)的對應(yīng)的小波系數(shù)。pU∩L亦為向量，pU∩L為混合物光譜U與數(shù)據(jù)庫中光譜L匹配上的特征峰，pU∩L表示U與L匹配上的第i個特征峰與其尺度最匹配的小波函數(shù)的對應(yīng)的小波系數(shù)。

1.4 試劑與儀器

氯金酸(HAuCl4)、檸檬酸鈉、聚酰胺粉(100～200目)、甲醇、乙醇和氨水(分析純，上海國藥集團化學(xué)試劑有限公司)。亮藍(lán)、莧菜紅、誘惑紅、日落黃、檸檬黃色素標(biāo)準(zhǔn)品(上海阿拉丁生化科技股份有限公司)。

文中SERS譜圖皆采用B&W TEK(必達(dá)泰克光電科技(上海)有限公司)的 i-Raman拉曼光譜儀進行測定。該儀器的激光波長為785 nm，功率為275 mW，10倍物鏡下達(dá)到樣品表面的激光光斑大小約為80 μm。

1.5 SERS增強活性的金納米粒子的制備及表征

金納米粒子由廈門市普識納米科技有限公司提供，粒徑約為55 nm，利用經(jīng)典的檸檬酸鈉還原HAuCl4的方法合成而得[26]。制備過程如下：1.2 mL 1%檸檬酸鈉迅速加至含有1 mmol/L HAuCl4的100 mL沸水溶液中，繼續(xù)劇烈攪拌40 min后，得到粒徑55 nm左右的紅色金納米溶膠。

1.6 實際樣品的前處理及SERS檢測

樣品的提取預(yù)處理過程借鑒傳統(tǒng)的聚酰胺粉法，并結(jié)合SERS檢測的特點進行優(yōu)化。對于薯片等固體樣品，基本步驟如下：①取5 g樣品于50 mL離心管中，加入25 mL乙醇溶液，超聲5 min。②將該溶液以6 000 r/min轉(zhuǎn)速離心，取上層清液。③于注射器中，取25 mL待測溶液與聚酰胺粉混合，反復(fù)抽取吸附多次后擠出液體棄去。④用注射器抽取5 mL水，反復(fù)振蕩10 s后擠出廢液，該步驟重復(fù)3次。⑤依次用甲醇甲酸溶液和乙醇重復(fù)上述操作。⑥吸取1 mL乙醇氨水溶液，靜置1 min后擠出洗脫液待用。整個前處理過程不超過15 min。對于酒品和飲料等液體樣品，前處理可略去前述步驟①和②，直接進行聚酰胺萃取步驟，處理時間可控制在10 min以內(nèi)。需指出，由于SERS的指紋圖譜特點，部分液體樣品可直接進行檢測，而無需任何前處理。

SERS檢測步驟如下：取200 mL金納米溶膠，20 mL pers-A1增強助劑(廈門市普識納米科技公司提供)與20 mL洗脫液、5 ppm標(biāo)準(zhǔn)樣品，混合5 s。根據(jù)色素種類進行分類，然后開始拉曼光譜測試，譜圖采集時間為5～10 s。

2 結(jié)果與討論

2.1 食品中色素的定性結(jié)果

表1中顯示了本方法得到小波空間中的反向匹配系數(shù)及對應(yīng)的HQI結(jié)果。通常選擇0.8作為閾值來判斷物質(zhì)是否存在[27-28]。HQI方法得到的結(jié)果范圍為0.69～0.96，當(dāng)檢測值低于0.8時，檢測結(jié)果即為陰性。而本方法得到的RMQ全部高于0.80，大部分結(jié)果達(dá)到了0.99，表明色素成功檢出，檢出率高達(dá)99%，且結(jié)果穩(wěn)定。因此，基于連續(xù)小波及反向搜索的方法在分析混合物時展現(xiàn)了明顯優(yōu)勢。

從表中可以看出，HQI在液體樣品中的色素檢測具有一定的功效性，但對于固體樣本其檢測能力大大降低，而基于小波-反向搜索的方法均能成功檢出色素的存在?？梢酝茢郒QI由于受基線及混合物中其他物質(zhì)造成干擾的影響較大，結(jié)果不穩(wěn)定。而基于小波-反向搜索的方法能夠忽略基線、噪聲及背景的影響，可得到穩(wěn)定且準(zhǔn)確的結(jié)果。

表1 命中質(zhì)量系數(shù)(HQI)及小波空間中反向搜索匹配系數(shù)(RMQ)對食品中色素的定性結(jié)果Table 1 HQI and RMQ in wavelet space when querying the food sample against the standard spectra

(續(xù)表1)

ColorantSampleHQIDetected(HQI)RMQDetected(RMQ)Allurared(誘惑紅)Lactobacillusdrink0 9599√0 9982√Meringues0 7968-0 9986√Potatochips0 8475√0 9982√Succade0 6941-0 9953√Vitaminwater0 9473√0 9983√

2.2 小波空間中進行峰檢測的優(yōu)勢

當(dāng)信號轉(zhuǎn)入小波空間中，基線及噪聲可以被明顯的抑制。峰檢測不需對信號進行平滑及基線校正處理。這是MSPD和MassSpecWavelet的主要步驟，若假設(shè)信號由下式表達(dá)：

S(t)=P(t)+B(t)+C，t∈[t1,t2]

*MERGEFORMAT(6)

P(t)表示峰，B(t)表示微變化的基線，C表示常數(shù)基線。t1和t2分別表示峰開始及結(jié)束的點。則峰的小波系數(shù)可由下式表示：

*MERGEFORMAT(7)

根據(jù)小波函數(shù)ψ的零均值和二乘范數(shù)歸一化的要求，上式中小波函數(shù)的卷積和常數(shù)基線C將為零。當(dāng)信號中的噪聲變成零均值并且獨立恒等的分布，那么可以通過相鄰點進行平均化實現(xiàn)降噪。信號進行卷積處理時，加權(quán)函數(shù)可以實現(xiàn)信號的平均和加權(quán)平均。連續(xù)小波變化可視為通過不同尺度及位移的小波對信號進行卷積。因此，小波空間中的噪聲將在某種程度上受到抑制。墨西哥帽小波是對稱函數(shù)，其基線變化緩慢而單調(diào)。因此，小波函數(shù)Ψ和單調(diào)且緩慢變化背景B的卷積得到的小波系數(shù)近似為零。總的來說，常數(shù)及緩變的基線都將在連續(xù)小波變換的計算程序中自動被移除。

如圖3所示，用1組模擬光譜來驗證墨西哥帽小波可從基線和噪聲中提取峰特征信息。模擬光譜中包含了一組9個高斯峰，基線及隨機噪聲。在將信號轉(zhuǎn)入小波空間中后，可從圖3中發(fā)現(xiàn)峰面積與最佳小波尺度系數(shù)具有非常強的線性關(guān)系。這意味著拉曼光譜特征峰強度信息在小波空間中也得到了保存，而基線及隨機噪聲被成功移除。根據(jù)連續(xù)小波變換的特征，可以認(rèn)為在小波空間中進行定性及定量分析能取得更好的效果。

圖3 小波空間進行峰信息提取的優(yōu)勢Fig.3 Advantages of extraction peak information in wavelet space A.simulated data;B.wavelet coefficients of the signal;C.the coefficient of areas of Gaussian peaks and the best scale wavelet coefficients

3 結(jié) 論

本文針對表面增強拉曼信號的定性分析，提出了一種基于連續(xù)小波變換及反向檢索的定性算法。本算法通過連續(xù)小波變換將信號轉(zhuǎn)入小波空間中進行峰檢測，隨后利用小波空間中的峰信息，基于光譜庫中已有標(biāo)準(zhǔn)品光譜進行反向檢索得到反向搜索匹配系數(shù)(RMQ)進行定性結(jié)果考察。食品中色素的定性分析實驗結(jié)果證明本算法快速、可靠、準(zhǔn)確，檢出率高達(dá)99%，明顯優(yōu)于傳統(tǒng)的命中質(zhì)量系數(shù)法(HQI)。此外，本研究中發(fā)現(xiàn)小波空間中最佳小波尺度系數(shù)也可以保存拉曼光譜特征峰強度信息，成為使用連續(xù)小波進行定量分析的理論基礎(chǔ)。

[1] Schmitt M，Popp J.J.RamanSpectrosc.，2006，37(1/3):20-28.

[2] Carron K.Anal.Chem.，2010，82(9):3419-3425.

[3] Kneipp K，Kneipp H，Itzkan I，Dasari R R，F(xiàn)eld M S.J.Am.Chem.Soc.，1999，99(50):2957-2975.

[4] Sato-Berru R Y，Medina-Valtierra J，Medina-Gutierrez C，F(xiàn)rausto-Reyes C.Spectrochim.ActaA，2004，60(10):2225-2229.

[5] Chen Z P，Li L M，Jin J W，Nordon A，Littlejohn D，Yang J，Zhang J,Yu R Q.Anal.Chem.，2012，84(9):4088-4094.

[6] Knipp K，Wang Y，Kneipp H，Perelman L T，Itzkan I，Dasari R R，F(xiàn)eld M S.Am.Phys.Soc.，1997，78(9):1667-1670.

[7] Tian Z Q，Ren B，Li J F，Yang Z L.Chem.Commun.，2007，34(34):3514-3534.

[8] Tian Z Q.J.RamanSpectrosc.，2005，36:466-470.

[9] Zhang Z M，Liang Y Z.Chromatographia，2012，75(5):313-314.

[10] Zhang Z M，Chen S，Liang Y Z.Analyst，2010，135(5):1138-1146.

[11] Chen S，Li X N，Liang Y Z，Zhang Z M，Liu Z X，Zhang Q M，Ding L X,Ye F.Spectrosc.SpectralAnal.(陳珊 ，李曉寧，梁逸曾，張志敏，劉朝霞，張啟明，丁麗霞，葉菲.光譜學(xué)與光譜分析)，2010，30(8):52-55.

[12] D?rferr T，Schumacher W，Tarcea N，Schmitt M，Popp J.J.RamanSpectrosc.，2009，41(6):684-689.

[13] Liu Y H ，Aickelin U，F(xiàn)eyereisl J，Durrant L G.Knowl-BasedSyst.，2013，37(2):502-514.

[14] Zhang Z M，Chen S，Liang Y Z，Liu Z X，Zhang Q M，Ding L X，Ye F，Zhou H.J.RamanSpectrosc.，2009，41(6):659-669.

[15] Shao X G，Gu H，Wu J H，Shi Y Y.Appl.Spectrosc.，2000，54(5):731-738.

[16] Shao X G，Leueng A K M，Chau F T.J.Am.Chem.Soc.，2003，36(4):276-283.

[17] Cooper G，Kubik M，Kubik K.Chemom.Intell.Lab.Syst.，2011，107(1):65-68.

[18] Chen H，Zhang Z M，Miao L，Zhan D J，Zheng Y B，Liu Y，Lu F，Liang Y Z.J.RamanSpectrosc.，2015，46(1):147-154.

[19] Zhang Z M，Chen X Q，Lu H M，Liang Y Z，F(xiàn)an W，Xu D，Zhou J，Ye F，Yang Z Y.Chemom.Intell.Lab.Syst.，2014，137(23):10-20.

[20] Zhang Z M，Tong X，Peng Y，Ma P，Zhang M J，Lu H M，Chen X Q，Liang Y Z.Analyst，2015，140(23):7955-7964.

[21] Abramson F P.Anal.Chem.，1975，47(1):45-49.

[22] Lee S，Lee H，Chung H.Anal.Chim.Acta，2013，758:58-65.

[23] Champagne A B，Emmel K V.Vib.Spectrosc.，2011，55(2):216-223.

[24] Kwiatkowski J，Riepe W.Anal.Chim.Acta，1979，112(3):219-231.

[25] Stauffer D B，Mclafferty F W，Ellis R D，Peterson D W.Anal.Chem.，1985，57(3):773-776.

[26] Frens G.Nature，1973，241(105):20-22.

[27] Gryniewicz-Ruzicka C M，Rodriguez J D，Arzhantsev S，Buhse L F，Kauffman J F.J.Pharm.Biomed.，2012，61(5):191-198.

[28] Lee S，Lee H，Chung H.Anal.Chim.Acta，2013,758(3):58-65.

Identification of Colorants in Food by Surface-enhanced Raman Spectroscopy and Wavelet-based Reverse Search

PENG Ying1,2，ZHANG Zhi-min1，LU Hong-mei1*，LIANG Yi-zeng1，LIU Cha1，CHEN Qi-zhen2，LIU Guo-kun3

(1.College of Chemistry and Chemical Engineering，Central South University，Changsha 410083，China;2.College of Chemistry and Chemical Engineering，Xiamen University，Xiamen 361000，China;3.State Key Laboratory of Marine Environmental Science，College of the Environment and Ecology，Xiamen University，Xiamen 361000，China)

In this study，a gold nanocrystal colloid was used as the enhancement factor for surface-enhanced Raman scattering(SERS).Raman spectra were transformed by continuous wavelet transform(CWT)，and Mexican hat wavelet were chosen as the wavelet basis.This procedure could be used to alleviate the influence of baseline variations and random noise，and find peak positions and the best scale wavelet coefficients of signal.Reverse search method was proposed to compare the spectrum of an unknown sample with a spectrum of standard using the information in wavelet space.Reverse match quality(RMQ)could be obtained automatically to determine whether a substance is present.It was used to identify colorants in a variety of food successfully.The colorants could be identified with 99 percent accuracy.It shows a better performance compared with traditional hit quality index(HQI).The study confirmed that the wavelet-based reverse search is feasible and accurate in qualitative analysis.

continuous wavelet transform;reverse search;surface-enhanced Raman spectroscopy(SERS);rapid qualitative identification

2016-12-07；

2017-01-22

國家自然科學(xué)基金資助項目(21375151)；國家重大科學(xué)儀器設(shè)備開發(fā)專項(2011YQ0301240704)

10.3969/j.issn.1004-4957.2017.05.008

O657.3；TS264.4

A

1004-4957(2017)05-0627-06

*通訊作者：盧紅梅，博士，教授，研究方向：化學(xué)計量學(xué)與智能分析儀器，Tel:0731-88830831，E-mail:hongmeilu@csu.edu.cn