魚腥草抗單純皰疹病毒作用機(jī)制研究

周良斌

（黃岡職業(yè)技術(shù)學(xué)院，湖北黃岡438002）

科學(xué)實(shí)驗(yàn)研究

魚腥草抗單純皰疹病毒作用機(jī)制研究

周良斌

（黃岡職業(yè)技術(shù)學(xué)院，湖北黃岡438002）

利用體外試驗(yàn)研究魚腥草是否對(duì)第二型單純皰疹病毒（HSV-2）感染具有抑制作用，并進(jìn)一步探討其抑制單純皰疹病毒的效用與機(jī)制。結(jié)果表明：利用溶斑減少試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，魚腥草初萃取物可抑制HSV-1、HSV-2及阿昔洛韋抗藥性HSV-1（HSV-AR）。將魚腥草初萃取物依據(jù)分子量分成1000 Da以下、1000～3000 Da、3000 Da以上三部分，發(fā)現(xiàn)三部分皆具有抗病毒的成分，其中以1000 Da以下的部分抑制效果最好。分析六種魚腥草成分作用發(fā)現(xiàn)，B、E及F具有抗HSV活性。其中B可以同時(shí)抑制病毒進(jìn)入細(xì)胞以及NF-κB活化。可見，魚腥草可直接和病毒顆粒作用而抑制病毒進(jìn)入細(xì)胞。在病毒進(jìn)入細(xì)胞后，魚腥草通過抑制細(xì)胞NF-κB活化而減少NF-κB結(jié)合至HSV的ICP0基因啟動(dòng)子而抑制HSV復(fù)制。

單純皰疹病毒；魚腥草；抗病毒作用

單純皰疹病毒屬于皰疹病毒科中的α皰疹病毒亞科（Alphaherpesvirinae），由于其表面蛋白質(zhì)抗原性有所不同而可區(qū)分為兩種血清型，即第一型單純皰疹病毒（HSV-1）與第二型單純皰疹病毒（HSV-2）。以往抗病毒藥物多半重于西藥開發(fā)，近年來中草藥對(duì)抗病毒功效已慢慢被注意。

本試驗(yàn)利用體外試驗(yàn)方法找出魚腥草抗單純皰疹病毒效用與機(jī)制后，測(cè)試魚腥草是否對(duì)第二型單純皰疹病毒及阿昔洛韋抗藥性HSV-1感染也具有抑制作用，并進(jìn)一步探討其抑制單純皰疹病毒機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 萃取中草藥 清洗魚腥草后，加入適量蒸餾水，以攪拌切割機(jī)打碎，分別以下列比例配制：魚腥草100 g+水1 L，以小火煮沸至體積400 mL。3000 r/min離心10 min，收取上清液。藥液再分別以棉花、100目金屬網(wǎng)、0.2 μm過濾膜依序過濾。分裝至15 mL離心管，置于-70℃保存?zhèn)溆?。?jīng)煎煮的藥液冷凍干燥處理后，再秤重配制成100 mg/L濃度。

1.2 魚腥草內(nèi)含成分制備 購(gòu)買不同魚腥草成分的化合物A、B、C、D、E及F。所有藥物皆溶于二甲亞砜溶液（DMSO）。

1.3 細(xì)胞培養(yǎng) 將體外連續(xù)培養(yǎng)細(xì)胞株Vero細(xì)胞 （猴腎細(xì)胞）、A549細(xì)胞 （人類肺癌細(xì)胞）以及HEp-2細(xì)胞（人類喉癌細(xì)胞）由液態(tài)氮中取出后快速解凍，經(jīng)離心去除冰凍保存液，加入含有胎牛血清的細(xì)胞生長(zhǎng)培養(yǎng)基，移至細(xì)胞培養(yǎng)瓶中，置于含5%CO2的37℃培養(yǎng)箱進(jìn)行培養(yǎng)。細(xì)胞每3～4 d進(jìn)行一次繼代培養(yǎng)，當(dāng)細(xì)胞生長(zhǎng)形成完整的單層細(xì)胞時(shí)，將培養(yǎng)基移除，用磷酸鹽緩沖液清洗兩次后，加入胰蛋白質(zhì)酵素作用5～10 min，見細(xì)胞脫落即可加入生長(zhǎng)培養(yǎng)基，細(xì)胞經(jīng)充分混合均勻后，以1∶4的比例分裝于新的培養(yǎng)瓶中?；蛴?jì)數(shù)細(xì)胞數(shù)目后，稀釋成適當(dāng)?shù)臐舛?，供培養(yǎng)病毒或后續(xù)測(cè)試用。

1.4 病毒培養(yǎng) 將人類單純皰疹病毒HSV接種于細(xì)胞，置于37℃使病毒吸附于細(xì)胞，1 h后，換上新鮮的維持培養(yǎng)基，置于內(nèi)含 5%CO2的37℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)。直至細(xì)胞病變大于75%即可收取病毒，病毒液于4℃、5000 r/min（Hitachi SCR20B）離心30 min以移除細(xì)胞沉淀物，去除細(xì)胞的病毒培養(yǎng)上清液，以少量分裝于小安瓶?jī)?nèi)，保存于-80℃下。

1.5 MTT試驗(yàn)測(cè)試中草藥的細(xì)胞毒性 將3×104的Vero細(xì)胞于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱隔夜培養(yǎng)于96孔盤。稀釋魚腥草粗萃取液，最高濃度的魚腥草與2×濃度的E-4（2×EMEM含4%FBS）以1∶1等體積稀釋，其他濃度以E-2（EMEM含2%FBS）做2×序列稀釋。緩慢吸去細(xì)胞培養(yǎng)基，加入100 μL中草藥稀釋液，細(xì)胞對(duì)照組則加100 μL E-2，37℃培養(yǎng)3 d。加入MTT（5 mg/mL PBSA）25 μL/well，置于37℃2 h。加入裂解液100 μL/well，37℃2 h后，移至室溫放置24 h。以O(shè)D570nm分析。

1.6 溶斑試驗(yàn) 細(xì)胞濃度調(diào)整到8×105cells/mL，放入6孔細(xì)胞培養(yǎng)盤（1 mL/孔），37℃培養(yǎng) 24 h。稀釋病毒，以E-2將HSV稀釋。緩慢吸去細(xì)胞培養(yǎng)基，加入 100 μL病毒稀釋液/well，細(xì)胞對(duì)照組則加100 μL E-2，置于37℃使病毒吸附1 h，準(zhǔn)備含有2%纖維甲醚（MC）的覆蓋介質(zhì)溶液與2×E-4以1∶1的比例混合，加入2 mL/well，37℃培養(yǎng)3 d。加入1 mL 10%福爾馬林溶液，固定1 h。倒掉所有覆蓋液體，滴上1%crystal violet，染色10 min。以清水溫和潤(rùn)洗，計(jì)數(shù)溶斑（PFU）

PFU/mL=（溶斑平均數(shù)）×（1/接種體積）×（1/稀釋倍數(shù)）。

1.7 溶斑減少試驗(yàn) 細(xì)胞濃度調(diào)整度到5×105個(gè)/mL，放入6孔細(xì)胞培養(yǎng)盤，37℃培養(yǎng)24 h。稀釋病毒，以E-2調(diào)整病毒濃度至100 PFU/100 μL。緩慢吸去細(xì)胞培養(yǎng)基，加入100 μL混合液，細(xì)胞對(duì)照組則加100 μL E-2，病毒對(duì)照組直接加入病毒，37℃使病毒吸附1 h。加上含有不同濃度魚腥草粗萃取液的加入第二種溶液，37℃培養(yǎng)3 d。加入1 mL 10%福爾馬林溶液，固定1 h。倒掉所有覆蓋液體，滴上1%crystal violet，染色10 min。以清水溫和地潤(rùn)洗，計(jì)數(shù)溶斑。

1.8 病毒前處理試驗(yàn) 將5×105個(gè)/mL的病毒細(xì)胞在37℃、5%CO2的培養(yǎng)箱隔夜培養(yǎng)于6孔盤。隔天在病毒感染前3 h，先將HSV-1用培養(yǎng)液稀釋并加入不同濃度的魚腥草使病毒力價(jià)為100 PFU/100 μL。將病毒和魚腥草在室溫下作用3 h。之后將細(xì)胞培養(yǎng)液移除，加入已和魚腥草作用過的病毒100 μL，在37℃下感染1 h，然后吸去病毒液，以2 mL PBS潤(rùn)洗細(xì)胞三次。再加入2 mL不含魚腥草的MC覆蓋液。3 d后讀取細(xì)胞溶斑數(shù)。再將加藥物的試驗(yàn)組與病毒控制組做比較。

1.9 細(xì)胞前處理試驗(yàn) 將5×105個(gè)/mL的病毒細(xì)胞于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱隔夜培養(yǎng)于6孔盤。隔天在病毒感染前3 h，先將孔內(nèi)培養(yǎng)液換成含有不同濃度魚腥草的培養(yǎng)液，在37℃下作用3 h。3 h后移去上清液，再以2 mL PBS潤(rùn)洗細(xì)胞三次。每孔感染100 PFU/100 μL的HSV-1，在37℃下感染1 h，之后吸去病毒液，再以2 mL PBS潤(rùn)洗細(xì)胞三次。再加入2 mL不含魚腥草的MC覆蓋液。3 d后讀取細(xì)胞溶斑數(shù)。再將加藥物的試驗(yàn)組與病毒控制組做比較。

1.10 病毒吸附試驗(yàn) 將5×105個(gè)/mL的Vero細(xì)胞于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱隔夜培養(yǎng)于6孔盤。第2天于試驗(yàn)前先將6孔盤置于4℃預(yù)冷，1 h后吸去培養(yǎng)液每孔加入力價(jià)含100 PFU/100 μL HSV-1病毒與特定濃度魚腥草的混合液100 μL，病毒控制組則加入不含藥物的病毒液100 μL，再將6孔盤置于4℃1.5 h，病毒于4℃下只能吸附在細(xì)胞表面，無法進(jìn)入細(xì)胞。1.5 h后將病毒液吸去并以預(yù)冷PBS清洗3次以洗去殘余藥物，再加入2 mL不含魚腥草的MC覆蓋液。3 d后讀取細(xì)胞溶斑數(shù)。再將加藥物的試驗(yàn)組與病毒控制組做比較。

1.11 病毒穿透試驗(yàn) 將5×105個(gè)/mL的Vero細(xì)胞于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱隔夜培養(yǎng)于6孔盤。第2天于試驗(yàn)前先將6孔盤置于4℃預(yù)冷，1 h后吸去培養(yǎng)液，每孔加入力價(jià)含 100 PFU/100 μL HSV-1病毒，在4℃下吸附2 h，之后吸去病毒液，每孔加入1 mL含有魚腥草的培養(yǎng)液，37℃培養(yǎng)15 min，以允許病毒穿透細(xì)胞膜。之后吸去培養(yǎng)液，每孔加入1 mL酸性PBS（pH=3）作用1 min，將細(xì)胞外上外穿透細(xì)胞膜的病毒去活化，再以1 mL PBS潤(rùn)洗細(xì)胞三次以中和酸堿性。之后每孔加入2 mL不含魚腥草的MC覆蓋液。3 d后讀取細(xì)胞溶斑數(shù)。再將加藥物試驗(yàn)組與病毒控制組做比較。

1.12 藥物加入作用時(shí)間點(diǎn)試驗(yàn) 將5×105個(gè)/mL的Vero細(xì)胞于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱隔夜培養(yǎng)于6孔盤。第2天吸去培養(yǎng)液，每孔感染1 MOI的病毒。在37℃下感染1 h后吸去病毒液，再以2 mL PBS潤(rùn)洗細(xì)胞三次。0 h組加入2 mL含有1 mg/mL魚腥草的培養(yǎng)液，其余組則加入不含魚腥草的培養(yǎng)液。分別在感染后的不同時(shí)間點(diǎn)吸去細(xì)胞上清液，以2 mL PBS潤(rùn)洗細(xì)胞，加入2 mL含有1 mg/mL的魚腥草培養(yǎng)液。24 h后，將細(xì)胞上清液移去，以PBS潤(rùn)洗細(xì)胞，利用胰島素將細(xì)胞打下，懸浮于1 mL培養(yǎng)液。在-80℃下冰凍解凍三次。以5000 r/min離心10 min，將上清液保存在-80℃。利用溶斑試驗(yàn)定量不同時(shí)間點(diǎn)加藥的病毒量。

1.13 病毒RNA萃取 將Vero細(xì)胞以5×105個(gè)/mL種于6孔盤，待隔日細(xì)胞長(zhǎng)滿后以1 MOI的病毒感染細(xì)胞。病毒吸附1 h后將病毒液吸起，并補(bǔ)入含1 mg/mL魚腥草的維持培養(yǎng)液1 mL，病毒控制組則補(bǔ)入維持培養(yǎng)液。置于37℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)，分別在之后的第2、10、24 h以trypsin將各組細(xì)胞打下收于1.5 mL微量離心管，以2500 r/min離心10 min后將trypsin移除并以200 μL維持培養(yǎng)液將細(xì)胞混勻，暫時(shí)于4℃保存。之后將細(xì)胞離心并移去維持培養(yǎng)液，加入1 mL TRIzol試劑混合均勻后置于室溫5 min，然后加入0.2 mL氯仿并劇烈混合15 s后靜置于室溫3 min，再以12000 r/min于4℃離心15 min。將上層含RNA的水溶液移至新的1.5 mL微量離心管并加入0.5 mL異丙醇混合均勻后靜置于室溫10 min，以12000 r/min于4℃離心10 min后去除上清液。以1 mL 75%酒精清洗沉淀于管底的RNA，再以7500 r/min于4℃離心5 min后小心的移去酒精，并利用真空抽干5 min將RNA干燥，再以20 μL DEPC水（去除RNase的二次水）回溶RNA。為去除DNA的干擾，RNA中可再加入5 μL DNase I、3 μL 10×DNase緩沖液再補(bǔ)DEPC水至體積30 μL，置于37℃水浴槽作用20 min后，再加入50 mmol/L EDTA 3.5 μL于75℃水浴槽作用10 min后可將RNA保存于-80℃。

1.14 蛋白痕跡（Western blot）試驗(yàn) 取出轉(zhuǎn)漬蛋白完成的 PVDF膜放到干凈的盒子中，加入10.0 mL緩沖液，于室溫中反應(yīng)2 h以上。待遮蔽作用完成后，以PBST清洗PVDF膜三次，每次5 min，接著加入10.0 mL以5%脫脂奶粉稀釋后的一級(jí)抗體，在室溫中反應(yīng)2 h，再以PBST清洗三次，再加入10.0 mL以5%脫脂奶粉稀釋后的二級(jí)抗體，在室溫中反應(yīng)2 h，最后再以PBST清洗二次、PBS清洗一次之后呈色。

2 結(jié)果

2.1 中草藥的細(xì)胞毒性試驗(yàn) 測(cè)試經(jīng)處理后魚腥草粗萃取液對(duì)細(xì)胞的毒性，將藥液連續(xù)兩倍稀釋，加在預(yù)先培養(yǎng)好的細(xì)胞上，以MTT試驗(yàn)來測(cè)試。圖1測(cè)試結(jié)果顯示，即使使用最高濃度（50 mg/mL），細(xì)胞仍然可以維持50%以上的活性，表明本中草藥安全低毒。

圖1 MTT試驗(yàn)測(cè)試魚腥草對(duì)Vero細(xì)胞毒性

2.2 魚腥草抑制病毒試驗(yàn) 先將大量培養(yǎng)的單純皰疹病毒連續(xù)10倍稀釋，以溶斑試驗(yàn)測(cè)定病毒濃度，再將含有100 PFU的病毒液在37℃下感染Vero細(xì)胞1 h。洗去病毒液后，加入含有不同魚腥草粗萃取液濃度的1%MC。3 d后讀取細(xì)胞溶斑數(shù)。圖2測(cè)試結(jié)果顯示，魚腥草抑制HSV-1、HSV-2以及AR-HSV-1的50%感染力的藥液濃度（EC50）分別為0.692l、0.3、1.11 mg/mL。

圖2 溶斑減少試驗(yàn)測(cè)試魚腥草抑制HSV-1、HSV-2以及ACV-HSV-1的作用

2.3 魚腥草抑制HSV-1及HSV-2的機(jī)制 圖3結(jié)果顯示，低于IC50濃度的魚腥草在室溫下和病毒作用3 h后，就可以完全抑制細(xì)胞產(chǎn)生溶斑，而將細(xì)胞先和魚腥草在37℃下作用則無法抑制病毒感染細(xì)胞。此結(jié)果顯示魚腥草可能直接和病毒顆粒作用而抑制病毒進(jìn)入細(xì)胞。在HSV-1以及HSV-2皆可以觀察到相同的結(jié)果。為了進(jìn)一步了解在病毒和魚腥草作用3 h后，病毒是否已死亡，將105PFU的病毒和不同濃度魚腥草作用 3 h后，將病毒稀釋1000倍以降低魚腥草的作用，將稀釋后的病毒感染細(xì)胞，此含有100 PFU的病毒在37℃感染細(xì)胞1 h后，以PBS洗細(xì)胞3次，加入MC覆蓋液。3 d后判讀細(xì)胞溶斑數(shù)。結(jié)果顯示，和最高濃度0.1 mg/mL魚腥草作用3 h后的病毒，其病毒顆粒仍然具有感染力，顯示魚腥草和病毒作用并不會(huì)直接殺死病毒（圖4）。

圖3 細(xì)胞和病毒預(yù)處理試驗(yàn)探討魚腥草抑制HSV-1和HSV-2的機(jī)制

圖4 溶斑試驗(yàn)測(cè)試魚腥草和病毒作用是否會(huì)殺死病毒

2.4 Western blot法試驗(yàn)檢測(cè)魚腥草抑制病毒吸附細(xì)胞試驗(yàn) 將病毒感染預(yù)冷的Vero細(xì)胞同時(shí)給與不同濃度的魚腥草，待病毒吸附1.5 h后，用預(yù)冷的PBS將病毒洗去。之后將細(xì)胞刮下，以抗病毒的醇蛋白D（anti-gD）的抗體偵測(cè)魚腥草是否可以抑制病毒貼附在細(xì)胞上。

圖5顯示，隨著魚腥草濃度增加，病毒貼附到細(xì)胞上的量會(huì)越來越少，顯示魚腥草的確可以抑制病毒貼附在細(xì)胞上。

圖5 Western blot發(fā)檢測(cè)魚腥草抑制病毒貼附細(xì)胞試驗(yàn)

2.5 魚腥草抑制HSV吸附細(xì)胞以及穿透細(xì)胞試驗(yàn) 根據(jù)藥物作用時(shí)間點(diǎn)的結(jié)果，魚腥草應(yīng)該在病毒感染細(xì)胞的前期抑制了HSV感染Vero細(xì)胞。因此進(jìn)一步探討魚腥草抑制病毒進(jìn)入的機(jī)制。將病毒感染預(yù)冷的Vero細(xì)胞給予不同濃度魚腥草，待病毒吸附1.5 h后，用預(yù)冷的PBS將病毒洗去，并加入不含魚腥草的培養(yǎng)液。結(jié)果顯示加魚腥草的試驗(yàn)組有效抑制CPE生成（P＜0.05）。而在魚腥草抑制HSV穿透細(xì)胞試驗(yàn)方面，利用病毒于4℃下只能吸附在細(xì)胞表面，無法穿透細(xì)胞的特性，先將病毒液與細(xì)胞于4℃作用一段時(shí)間，之后再加入藥物并將已被病毒吸附的細(xì)胞于37℃培養(yǎng)。結(jié)果顯示魚腥草同時(shí)也可以抑制病毒穿透細(xì)胞（圖6）。

圖6 魚腥草抑制HSV吸附細(xì)胞及穿透細(xì)胞試驗(yàn)

已知阿昔洛韋不會(huì)抑制細(xì)胞吸附，做為試驗(yàn)控制組。

2.6 檢測(cè)核內(nèi)VP16蛋白質(zhì)及質(zhì)內(nèi)ICP4蛋白質(zhì)表現(xiàn) 分別在病毒吸附以及穿透細(xì)胞時(shí)加入魚腥草，收集細(xì)胞，萃取細(xì)胞核蛋白質(zhì)以及細(xì)胞質(zhì)蛋白質(zhì)，分別以Western blot法偵測(cè)病毒VP16以及ICP4蛋白質(zhì)表達(dá)，藉此確認(rèn)魚腥草是否會(huì)抑制病毒吸附以及穿透細(xì)胞。圖7顯示，隨著魚腥草濃度增加，病毒VP16蛋白質(zhì)以及ICP4蛋白質(zhì)表達(dá)量可看到被抑制的現(xiàn)象。顯示魚腥草確實(shí)可以抑制病毒吸附以及穿透細(xì)胞。

圖7 通過細(xì)胞核內(nèi)VP16以及細(xì)胞質(zhì)內(nèi)ICP4的表達(dá)觀察魚腥草抑制病毒貼附及穿透細(xì)胞效果

2.7 魚腥草抑制病毒糖蛋白 D吸附細(xì)胞試驗(yàn)HSV的糖蛋白D可以和宿主細(xì)胞表面蛋白質(zhì)結(jié)合而調(diào)控病毒進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)，是病毒進(jìn)入細(xì)胞很重要蛋白質(zhì)。為了了解魚腥草是否會(huì)經(jīng)由結(jié)合病毒糖蛋白D而抑制病毒進(jìn)入細(xì)胞，因此利用桿狀病毒系統(tǒng)表現(xiàn)HSV-2的糖蛋白D。將10-5μg/cell的重組糖蛋白D加入Vero細(xì)胞內(nèi)，在37℃下作用1 h，以PBS潤(rùn)洗細(xì)胞3次，之后將細(xì)胞刮下，以Western blot法偵測(cè)魚腥草是否可以抑制糖蛋白D結(jié)合到細(xì)胞上。圖8結(jié)果顯示，隨著魚腥草濃度增加，抑制糖蛋白D結(jié)合到細(xì)胞上的作用就更加明顯。

圖8 魚腥草抑制病毒糖蛋白D貼附細(xì)胞試驗(yàn)

由此試驗(yàn)推斷魚腥草可能是經(jīng)由結(jié)合病毒糖蛋白D而抑制病毒進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)。另外為了證明魚腥草是否抑制gD蛋白質(zhì)結(jié)合到細(xì)胞上而并非抑制gD蛋白質(zhì)表達(dá)，將gD蛋白質(zhì)與不同濃度魚腥草在37℃下作用1 h，利用Western blot法分析gD蛋白質(zhì)的量（圖9），推測(cè)魚腥草并不會(huì)改變糖蛋白D蛋白質(zhì)的量。

圖9 以Western blot法分析魚腥草是否會(huì)抑制糖蛋白D表達(dá)

2.8 藥物作用時(shí)間點(diǎn)試驗(yàn) 為了更進(jìn)一步了解魚腥草抑制病毒的機(jī)制，利用藥物作用時(shí)間點(diǎn)試驗(yàn)探討魚腥草抑制HSV的時(shí)間點(diǎn)。以1 MOI的HSV-1感染細(xì)胞1 h，在感染后的不同時(shí)間點(diǎn)加入1 mg/mL的魚腥草，于24 h后將細(xì)胞上清液移去，再以胰蛋白酶將細(xì)胞打下，懸浮于培養(yǎng)液后，冰凍解凍三次將病毒釋放出，最后利用溶斑試驗(yàn)定量病毒。

圖10顯示，在經(jīng)過感染12 h后加魚腥草，仍然可以抑制98%以上的病毒量，因此推測(cè)魚腥草除了可以抑制病毒進(jìn)入細(xì)胞外，也有可能可以抑制病毒在細(xì)胞內(nèi)的復(fù)制。

圖10 測(cè)試魚腥草抑制HSV-1感染的作用時(shí)間點(diǎn)試驗(yàn)

2.9 免疫熒光法檢測(cè)魚腥草抑制病毒蛋白質(zhì)合成 目前推測(cè)魚腥草除了可以抑制病毒進(jìn)入細(xì)胞外，可能也可以抑制病毒在細(xì)胞內(nèi)的復(fù)制。為了了解魚腥草是抑制病毒復(fù)制的哪一步驟，將分別根據(jù)病毒蛋白質(zhì)合成以及不同時(shí)期基因表現(xiàn)來探討。首先研究魚腥草是否會(huì)抑制病毒蛋白質(zhì)合成。以1 MOI的HSV感染細(xì)胞1 h，等病毒進(jìn)入細(xì)胞后以PBS潤(rùn)洗除去末進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)的病毒，之后加入1 mg/mL的魚腥草，24 h后將細(xì)胞收下，點(diǎn)在玻片上，待細(xì)胞風(fēng)干固定后，以抗HSV （anti-HSV）的抗體偵測(cè)病毒蛋白質(zhì)表達(dá)。結(jié)果顯示加入魚腥草后，病毒的熒光量減少很多（圖11）?？梢婔~腥草可以有效抑制病毒蛋白質(zhì)的合成。

圖11 利用熒光試驗(yàn)檢測(cè)魚腥草是否抑制HSV蛋白質(zhì)合成

2.10 魚腥草對(duì)人類細(xì)胞株毒性以及其抑制HSV-1感染人類細(xì)胞株的活性 先前所有的試驗(yàn)都是在猴腎細(xì)胞株Vero上所進(jìn)行，為了了解魚腥草對(duì)人類細(xì)胞是否具有毒性，因此選用了A549細(xì)胞（人類肺癌細(xì)胞）及HEp-2細(xì)胞（人類喉癌細(xì)胞）。首先以MTT試驗(yàn)研究魚腥草對(duì)這兩株細(xì)胞的毒性。將魚腥草連續(xù)兩倍稀釋，加在預(yù)先培養(yǎng)好的細(xì)胞上，以MTT試驗(yàn)來測(cè)試。結(jié)果顯示，魚腥草對(duì)于A549以及HEp-2細(xì)胞的毒性作用和在Vero細(xì)胞上類似（P＞0.05），與細(xì)胞對(duì)照組比較，即使使用最高濃度（50 mg/mL），細(xì)胞仍然可以維持50%以上的活性（P＞0.05）（圖12）。

圖12 以病毒前處理試驗(yàn)分析B以及E抑制HSV試驗(yàn)

2.11 以溶斑減少試驗(yàn)分析不同分子量魚腥草抗HSV活性分析 為了進(jìn)一步探討在魚腥草中具有抗HSV活性的成分，使用QuixStand系統(tǒng)進(jìn)一步將魚腥草初萃取物依據(jù)分子量分成1000 Da以下、1000～3000 Da、3000 Da以上三個(gè)部分。利用溶斑減少試驗(yàn)進(jìn)一步分析此三種不同分子量的魚腥草抗HSV活性。結(jié)果顯示此三個(gè)部分皆具有抗病毒成分，但其中以1000 Da以下的部分抑制效果最好 （P＜0.01）（EC50=0.069 mg/mL）。而 1000～3000 Da以及 3000 Da以上的 EC50則分別為0.183、0.564 mg/mL。此部分魚腥草抑制單純皰疹病毒濃度結(jié)果總結(jié)于表1中。

表1 魚腥草粗萃取液抑制單純皰疹病毒劑量

2.12 以溶斑減少試驗(yàn)分析不同魚腥草成分抗HSV活性分析 根據(jù)目前文獻(xiàn)指出，魚腥草內(nèi)所含成分中大部分的物質(zhì)分子量都在1000 Da以下，因此接下來將進(jìn)一步分析這些分子中的抗HSV活性以及其機(jī)制。本試驗(yàn)選定了六種成分進(jìn)行分析。首先利用溶斑減少試驗(yàn)分析此六種不同分子的抗HSV活性。根據(jù)顯示，在這六種分子中，B、E以及F具有抗HSV-1以及HSV-2的活性（P＜0.05）（表2）。

2.13 以病毒前處理試驗(yàn)以及Western blot法分析不同魚腥草成分抑制HSV吸附細(xì)胞 之前結(jié)果顯示魚腥草可以經(jīng)由直接和病毒顆粒作用而抑制病毒進(jìn)入細(xì)胞。接下來將進(jìn)一步分析在魚腥草內(nèi)是何種成分抑制病毒進(jìn)入細(xì)胞。首先利用病毒前處理試驗(yàn)分析三種確定具有抗HSV活性的魚腥草成分是否可以抑制病毒進(jìn)入細(xì)胞。將不同濃度的化合物分別和病毒以及細(xì)胞在室溫以及37℃下作用3 h，以100 PFU的病毒在37℃感染細(xì)胞1 h后，以PBS洗細(xì)胞3次，加入MC覆蓋液。3 d后判讀細(xì)胞溶斑數(shù)。

表2 不同魚腥草成分抑制單純皰疹病毒劑量

圖13 MTT試驗(yàn)測(cè)試魚腥草對(duì)HEp-2以及A549細(xì)胞的毒性

圖13顯示，B、E、F三種具有抗HSV活性的物質(zhì)中只有B可以直接和病毒作用而抑制病毒進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)。利用Western blot法做進(jìn)一步確認(rèn)。將病毒感染預(yù)冷的Vero細(xì)胞給予不同濃度魚腥草，待病毒在4℃下吸附5 h后，以預(yù)冷的PBS將病毒洗去。之后將細(xì)胞刮下，以抗病毒糖蛋白D的抗體偵測(cè)魚腥草是否可以抑制病毒進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)。隨著B濃度增加，抑制病毒結(jié)合到細(xì)胞上的作用就更加明顯（前后對(duì)比P＜0.05），而E則無法觀察到此現(xiàn)象（圖14）。顯示 B確實(shí)可以抑制病毒吸附在細(xì)胞上（前后對(duì)比P＞0.05）。

圖14 以Western blot法分析B以及E抑制HSV貼附細(xì)胞

2.14 以Western blot法分析不同魚腥草成分抑制HSV感染所引起的細(xì)胞NF-κB活化 魚腥草除了可以經(jīng)由直接和病毒顆粒作用而抑制病毒進(jìn)入細(xì)胞，在病毒進(jìn)入細(xì)胞后，魚腥草也可以經(jīng)由抑制細(xì)胞 NF-κB活化而減少 NF-κB結(jié)合至HSV的ICP0基因啟動(dòng)子而抑制HSV復(fù)制。接下來分析在魚腥草內(nèi)是何種成分抑制HSV感染所引起的細(xì)胞NF-κB活化。以1 MOI的HSV感染細(xì)胞1 h，等病毒進(jìn)入細(xì)胞后以PBS洗去未進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)的病毒，分別加入不同濃度的化合物，在感染后 3 h收集細(xì)胞，抽取細(xì)胞核蛋白質(zhì)，以Western blot法檢測(cè)是否可以抑制NF-κB的活化。圖15顯示，B可以抑制NF-κB的活化，而E則無此明顯抑制現(xiàn)象。

圖15 Western blot法分析B以及E抑制HSV感染所引起的細(xì)胞NF-κB活化

3 討論與結(jié)論

研究結(jié)果顯示，魚腥草除了可抑制HSV-1，對(duì)于HSV-2以及Acyclovir resistant HSV-1（HSVAR）也具有很好的抑制效果。且魚腥草在高濃度時(shí)對(duì)細(xì)胞無毒性。將魚腥草初萃取物依據(jù)分子量分成 1000 Da以下、1000～3000 Da、3000 Da以上三部分，發(fā)現(xiàn)三部分皆具有抗病毒的成分，而其中又以1000 Da以下的部分抑制效果最好。因?yàn)槔肣uixStand系統(tǒng)分離不同分子量物質(zhì)時(shí)，無法完全將小分子量物質(zhì)從大分子量中分離出來，故分子量3000 Da以上可能仍然含有部分的小分子量物質(zhì)。因此分子量為 1000～3000 Da以及3000 Da以上的抗HSV活性有可能是因?yàn)榉肿恿?000 Da以下殘留所導(dǎo)致。

而在魚腥草抑制病毒機(jī)制研究方面，結(jié)果顯示魚腥草可以抑制病毒感染的不同步驟。首先在病毒感染前，魚腥草直接和病毒的糖蛋白D結(jié)合而抑制病毒進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)。除了糖蛋白D可以和宿主細(xì)胞表面蛋白質(zhì)結(jié)合并調(diào)控病毒進(jìn)入細(xì)胞之外，糖蛋白B也扮演了重要角色，在病毒進(jìn)入細(xì)胞后，魚腥草也可以抑制因 HSV感染所引起的細(xì)胞NF-κB活化，進(jìn)而減少NF-κB結(jié)合至 HSV的 ICP0基因啟動(dòng)子而抑制HSV復(fù)制。本研究證實(shí)了魚腥草確實(shí)可以抑制因HSV感染所引起的細(xì)胞NF-κB活化，減少NF-κB結(jié)合至HSV的ICP0基因啟動(dòng)子而抑制HSV復(fù)制。

目前分析六種魚腥草成分作用發(fā)現(xiàn)其中三種化合物B、E以及F具有抗HSV活性。其中B已被報(bào)道具有抗HSV的功效，然而其抑制HSV的機(jī)制尚未被證明。而E尚未有文獻(xiàn)指出具有抗HSV的活性。本研究指出B可以抑制病毒進(jìn)入細(xì)胞以及NF-κB活化，F(xiàn)與E抑制HSV的機(jī)制目前則尚未了解。B已知為抗氧化物質(zhì)，目前有研究指出B可以抑制NF-κB活化而有抗氧化的功能。另外在HSV感染時(shí)也會(huì)促使NF-κB活化而增加細(xì)胞內(nèi)氧化壓力，且HSV的ICP27也可增加細(xì)胞內(nèi)活性氧（reactive oxygen speces）以促使細(xì)胞凋亡。而B的抗氧化特性和抗病毒活性之間是否具有關(guān)聯(lián)則需進(jìn)一步試驗(yàn)證實(shí)。

[1]Gerald Kleymann，et al.New helicase-primase inhibitors as drug candidates forthetreatmentofherpessimplexdisease[J].NatureMedicine，2002，8：392～398.

[2]Goodkin M L，Ting A T，Blaho J A.NF-kappaB is required for apoptosis preventionduringherpessimplexvirustype1infection[J].JVirol，2003，77：7261～7280.

[3]James J，Crute，et al.Herpes simplex virus helicase-primase inhibitors are active in animal models of human disease[J].Nature Medicine，2002，8：386～391.

[4]KhanMTH，AtherA，ThompsonKD，etal.Extractsandmoleculesfrommedicinal plants against herpes simplex viruses[J]..Antiviral Res，2005，67：107～119.

[5]Kim I S，Kim J H，Kim J S，et al.The inhibitory effect of Houttuyniacordata extract on stem cell factor-induced HMC-1 cell migration[J].J Ethnopharmacol，2007，112（1）：90～95.

In vitro experimental was used to study cordate Houttuynia whether has inhibitory effect on type 2 herpes simplex virus infection，and further explore its inhibition mechanism and utility of herpes simplex virus.The results showed that using dissolve freckle reduction experiment found that its original extract can inhibit the following three kinds of viruses: less than 1000 Da，1000～3000 Da，more than 3000 Da.Among them，less than 1000 Da can show the best effect.Through analysis of six kinds of cordate Houttuynia，it’s found that B，E and F had anti HSV activity，B can suppress the virus into the cell.Cordate Houttuynia can suppress the virus and virus particles directly into the cell.After the virus into cell，cordate houttuynia by inhibiting NF-KB cell to reduce NF-KB combine，then HSVICPO gene start and inhibit the replication of HSV.

herpes simplex virus；Houttuynia；antiviral effect

S816.3

A

1004-3314（2017）10-0010-07

10.15906/j.cnki.cn11-2975/s.20171003