GICA檢測(cè)登革熱病毒NS1抗原和（或）IgG/IgM抗體的臨床意義

鐘秀茵++楊曉斌++何湘鵑++黃少霞++蔡藝

[摘要]目的 分析并探討膠體金免疫層析法（GICA）檢測(cè)登革熱病毒NS1抗原和（或）IgG/IgM抗體的效果。方法 選擇我院2014年1月～2015年6月收治的1200例門(mén)診疑似登革熱病毒感染者作為研究對(duì)象，應(yīng)用隨機(jī)分組法將患者分為兩組各600例，分別接受聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）熒光探針?lè)ê兔嘎?lián)免疫吸附測(cè)定法（ELISA），再將上述兩類(lèi)樣本分別隨機(jī)分為3份，每份200例，A組用GICA檢測(cè)NSI抗原，B組用GICA檢測(cè)IgG/IgM抗體，C組共同檢測(cè)NS1抗原和 IgG/IgM抗體。另D組選取60名健康人群使用GICA聯(lián)合檢測(cè)NS1抗原和IgG/IgM抗體。結(jié)果 ELISA組結(jié)果：A組結(jié)果與ELISA結(jié)果相比，陽(yáng)性、陰性、總體符合率分別為82.88%、90.00%、83.00%，結(jié)果有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P<0.05）；B組結(jié)果與ELISA結(jié)果相比，陽(yáng)性、陰性、總體符合率分別為88.20%、71.79%、85.00%，結(jié)果有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P<0.05）；C組結(jié)果與 ELISA結(jié)果相比，陽(yáng)性、陰性、總體符合率分別為94.87%、47.73%、84.50%，結(jié)果無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P>0.05）；PCR組結(jié)果：A組結(jié)果與 PCR結(jié)果相比，陽(yáng)性、陰性、總體符合率分別為87.68%、83.87%、86.50%，結(jié)果有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異；B組結(jié)果與PCR結(jié)果相比，陽(yáng)性、陰性、總體符合率分別為91.45%、85.42%、90.00%，結(jié)果有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P<0.05）；C組結(jié)果與 PCR結(jié)果相比，陽(yáng)性、陰性、總體符合率分別為95.43%、60.00%、91.00%，結(jié)果無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P>0.05）；D組結(jié)果均為陰性，特異性為100%。結(jié)論 GICA對(duì)NIS抗原和IgG/IgM抗體的聯(lián)合檢測(cè)結(jié)果與ELISA和PCR檢測(cè)結(jié)果較為接近，且特異性比較好，可用于登革熱病毒感染的早期篩查和輔助診斷。

[關(guān)鍵詞]膠體金免疫層析法；酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定法；聚合酶鏈反應(yīng)；登革熱病毒

[中圖分類(lèi)號(hào)] R512.82 [文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼] A [文章編號(hào)] 1674-4721（2017）04（c）-0156-04

[Abstract]Objective To analyze and explore the effect of application of colloidal gold immunochromatography assay （GICA） in the detection of Dengue virus NS1 antigen and/or IgG/IgM antibody.Methods Altogether 1200 cases of suspected Dengue virus infection patients who were treated in our hospital from January 2014 to June 2015 were involved as the object of this research and divided into two groups （PCR group and ELISA group） by using the random grouping method， with 600 casesin each group.Two groups were treated with polymerase chain reaction（PCR） fluorescence probe and enzyme-linked immunosorbent assay（ELISA），respectively.The two types of samples aforementioned were randomly divided into 3 sub-groups，with 200 samples in each sub-groups：GICA was used in group A to detect NSI antigen；GICA was used in group B to detect IgG/IgM antibody；it was also used in group C for detection of NS1 antigen and IgG/IgM antibody.Additionally，60 healthy volunteers were selected as Group D，whose NS1 antigen and IgG/IgM antibody were detected by using GICA.Results ELISA group results：compared with the results of ELISA group， the positive，negative and overall coincidence rate of group A were 82.88%，90.00% and 83.00%，with statistically significant difference（P<0.05）；compared with the results of ELISA group，the positive，negative and overall coincidence rate of group B were 88.20%，71.79% and 85.00%，with statistically significant difference（P<0.05）；compared with the results of ELISA Group，the positive，negative and overall coincidence rate of group A were 94.87%，47.73% and 84.50%，without statistically significant difference（P>0.05）；PCR group results：compared with the results of PCR group，the positive， negative and overall coincidence rate of group A were 87.68%， 83.87% and 86.50%，with statistically significant differenc（P<0.05）；compared with the results of PCR group，the positive，negative and overall coincidence rate of group B were 91.45%，85.42% and 90%，with statistically significant difference（P<0.05）；compared with the results of PCR Group，the positive， negative and overall coincidence rate of Group B were 95.43%，60.00% and 91.00%，without statistically significant difference（P>0.05）.The result of Group D was negative and its specificity was 100%.Conclusion The result achieved by application of GICA is close to that of ELISA and PCR in detection of NIS and IgG/IgM with good specificity.tcan be used for early screening and diagnosis of dengue virus infections.

[Key words]Colloidal gold immunochromatographic assay；Enzyme-linked immunosorbent assay；Polymerase chain reaction；Dengue virus

登革熱（dengue fever，DF）和登革熱出血熱（dengue hemorrhagic fever，DHF）是由登革熱病毒（dengue virus，DV）引起的熱帶蟲(chóng)媒傳染病，DV分為4個(gè)血清型（DV1、DV2、DV3、DV4），流行于全球熱帶和亞熱帶的60多個(gè)國(guó)家和地區(qū)，以東南亞國(guó)家最為嚴(yán)重。我國(guó)40年代在東南亞沿海曾有散發(fā)流行，至1978年在廣東佛山暴發(fā)流行以來(lái)，就不斷出現(xiàn)登革熱暴發(fā)和流行。其中，2014年，廣東省及廣州市登革熱疫情更是出現(xiàn)了史無(wú)前例的大爆發(fā)流行，報(bào)告病例數(shù)將近4萬(wàn)，引起了嚴(yán)重的公共衛(wèi)生問(wèn)題，引起國(guó)家及社會(huì)公眾的高度關(guān)注，嚴(yán)重影響正常的社會(huì)秩序和廣大群眾的身體健康及日常生活。本研究主要擬采用GICA法和ELISA法及核酸檢測(cè)PCR法3種方法進(jìn)行比較檢測(cè)登革熱病毒，對(duì)3種常用的檢測(cè)方法的實(shí)驗(yàn)條件進(jìn)行摸索和優(yōu)化，分析每種方法的優(yōu)缺點(diǎn)和適用范圍以及其各自的靈敏度和特異性等，結(jié)合疫情選擇合適的檢測(cè)方法，必要時(shí)聯(lián)合使用，使得實(shí)驗(yàn)室診斷結(jié)果既快速準(zhǔn)確，又科學(xué)高效[1-6]，現(xiàn)報(bào)道如下。

1資料與方法

1.1一般資料

選取我院2014年1月～2015年6月收治的1200例門(mén)診疑似登革熱病毒感染者作為研究對(duì)象，年齡16～60歲，平均35.8歲；男723例，女477例；文化水平：小學(xué)及以下414例，中學(xué)456例，大學(xué)及以上330例；排除有既往病史，藥物過(guò)敏史者。將患者隨機(jī)分為PCR組和ELISA組，各600例，分別采用PCR和ELISA檢測(cè)。對(duì)兩組患者進(jìn)行再次分組，分別分為A、B、C三組，各200例。另選60名健康人群作為對(duì)照（D組），各組患者的年齡、性別、文化程度等一般資料比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），具有可比性。所有實(shí)驗(yàn)流程均詳情告知參與研究者并簽署知情同意書(shū)，本實(shí)驗(yàn)經(jīng)本院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.2檢測(cè)方法

PCR組和ELISA組患者分別接受PCR熒光探針?lè)ê虴LISA，PCR反應(yīng)條件：42℃ 8 min，95℃ 10 s，95℃ 5 s，60℃ 34 s，45個(gè)循環(huán)；退火溫度按55～60℃間隔1℃分別試驗(yàn)優(yōu)化，退火溫度為60℃時(shí)，反應(yīng)曲線(xiàn)呈典型的S型，熒光信號(hào)最強(qiáng)，本實(shí)驗(yàn)選擇60℃作為退火溫度進(jìn)行下面的所有熒光PCR反應(yīng)；ELISA采用間接法。A組用GICA檢測(cè)NSI抗原，B組用GICA檢測(cè)IgG/IgM抗體，C組共同檢測(cè)NS1抗原和IgG/IgM抗體，D組使用GICA聯(lián)合檢測(cè)NS1抗原和IgG/IgM抗體。所有檢測(cè)指標(biāo)均以檢出抗原或抗體為陽(yáng)性，未檢出為陰性。其中DENV核酸試劑由江蘇碩世生物有限公司提供；ELISA試劑盒由澳大利亞PanBio公司提供；DENV NS1抗原和或IgG/IgM抗體檢測(cè)試劑由澳大利亞PanBio公司提供。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)數(shù)資料用率表示，組間比較采用χ2檢驗(yàn)，計(jì)量資料組間比較采用t檢驗(yàn)，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2結(jié)果

2.1 ELISA組中A組檢測(cè)結(jié)果

DENV NS1抗原檢測(cè)與ELISA的陽(yáng)性符合率為82.88%，陰性符合率為90.00%，總體符合率為83.00%，NS1抗原檢測(cè)結(jié)果與ELISA檢測(cè)結(jié)果比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）（表1）。

2.2 ELISA組中B組檢測(cè)結(jié)果

IgG/IgM抗體檢測(cè)與ELISA的陽(yáng)性符合率為88.20%，陰性符合率為71.79%，總體符合率為85.00%，IgG/IgM抗體檢測(cè)結(jié)果與ELISA檢測(cè)結(jié)果比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）（表2）。

2.3 ELISA組中C組檢測(cè)結(jié)果

DENV NS1抗原檢測(cè)聯(lián)合IgG/IgM抗體檢測(cè)與ELISA的陽(yáng)性符合率為94.87%，陰性符合率為47.73%，總體符合率為84.50%，NS1抗原檢測(cè)聯(lián)合IgG/IgM抗體檢測(cè)與ELISA檢測(cè)結(jié)果比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）（表3）。

2.4 PCR組中A組檢測(cè)結(jié)果

DENV NS1抗原檢測(cè)與PCR的陽(yáng)性符合率為87.68%，陰性符合率為83.87%，總體符合率為86.50%，NS1抗原檢測(cè)結(jié)果與PCR檢測(cè)結(jié)果比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）（表4）。

2.5 PCR組中B組檢測(cè)結(jié)果

IgG/IgM抗體檢測(cè)與PCR的陽(yáng)性符合率為91.45%，陰性符合率為85.42%，總體符合率為90.00%，IgG/IgM抗體檢測(cè)結(jié)果與PCR檢測(cè)結(jié)果比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）（表5）。

2.6 PCR組中C組檢測(cè)結(jié)果

DENV NS1抗原檢測(cè)聯(lián)合IgG/IgM抗體檢測(cè)與PCR的陽(yáng)性符合率為95.43%，陰性符合率為60.00%，總體符合率為91.00%，NS1抗原檢測(cè)聯(lián)合IgG/IgM抗體檢測(cè)與PCR檢測(cè)結(jié)果比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）（表6）。

2.7 D組檢測(cè)結(jié)果

采用GICA聯(lián)合檢測(cè)NS1抗原及IgG/IgM抗體，所得結(jié)果均為陰性，說(shuō)明檢測(cè)特異性為100%，具有高特異性。

3討論

常用于登革熱抗體檢測(cè)的方法主要有血凝抑制試驗(yàn)（HAI）、間接免疫熒光法（IFA）、ELISA法、免疫斑點(diǎn)法（DIBA）、膠體金免疫層析法（GICA）及核酸檢測(cè)PCR法等[7-11]。其中，HAI法雖然是WHO推薦的方法，但是由于其試劑和試驗(yàn)操作不易標(biāo)準(zhǔn)化，操作繁瑣、檢測(cè)周期長(zhǎng)，在基層實(shí)驗(yàn)室難以開(kāi)展；IFA法操作條件難以控制，非特異性反應(yīng)較高，交叉反應(yīng)明顯，易出現(xiàn)假陽(yáng)性，也難在基層醫(yī)療機(jī)構(gòu)建立。由于登革熱疫苗研究尚未取得突破性進(jìn)展，因此，登革熱病毒進(jìn)行快速檢測(cè)和分型對(duì)登革熱的臨床診斷和綜合防治有重要意義。然而，在2014年疫情暴發(fā)之前，廣州市各區(qū)疾控中心及相關(guān)醫(yī)療機(jī)構(gòu)在登革熱病毒實(shí)驗(yàn)室診斷方面仍缺乏檢驗(yàn)經(jīng)驗(yàn)，方法不完善，因此建立有效的適合基層實(shí)驗(yàn)室的檢測(cè)方法極其重要和迫切[12-14]。

本研究主要探索登革熱病毒檢測(cè)的實(shí)驗(yàn)室診斷方法，采用GICA、ELISA法及核酸檢測(cè)PCR法3種方法檢測(cè)登革熱病毒，結(jié)合登革熱疫情的流行病學(xué)資料，為基層實(shí)驗(yàn)室應(yīng)對(duì)登革熱疫情提供檢測(cè)方法的參考和依據(jù)。分析檢測(cè)結(jié)果，PCR技術(shù)應(yīng)用于登革熱病毒的檢測(cè)極大提高了檢測(cè)速度，重復(fù)性好，特異性高，可快速分型，為登革熱的臨床診斷提供了一種有效的手段[15]，但由于PCR技術(shù)含量高，費(fèi)用昂貴，不適合基層實(shí)驗(yàn)室。ELISA法檢測(cè)DV-IgM/IgG抗體敏感性和特異性較高，對(duì)檢測(cè)設(shè)備條件要求低，但檢測(cè)時(shí)間較長(zhǎng)，適合爆發(fā)流行期間大批量標(biāo)本檢測(cè)。GICA在聯(lián)合檢測(cè)NS1抗原和IgG/IgM時(shí)與ELISA法和PCR檢測(cè)結(jié)果相近，有理想的敏感性和特異性，無(wú)需特殊的儀器設(shè)備，檢測(cè)手段簡(jiǎn)單，能快速出結(jié)果，適合于臨床的推廣應(yīng)用。

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（收稿日期：2016-12-29 本文編輯：馬 越）