吡格列酮、高糖對(duì)3T3—L1細(xì)胞中p—Perilipin 1A蛋白表達(dá)的影響

夏文燕++許榮++方向南++秦永章++歐陽(yáng)龍強(qiáng)

[摘要]目的 探討吡格列酮和高糖對(duì)3T3-L1細(xì)胞中p-Perilipin 1A蛋白表達(dá)的影響。方法 將以3T3-L1前脂肪細(xì)胞誘導(dǎo)分化成3T3-L1脂肪細(xì)胞，進(jìn)行分組，設(shè)對(duì)照組（5 mmol/L葡萄糖）、高糖組（25 mmol/L葡萄糖）、高糖加吡格列酮組（25 mmol/L葡萄糖+100 μmol/L吡格列酮），通過測(cè)定培養(yǎng)基中甘油含量作為評(píng)價(jià)脂肪分解的指標(biāo)，同時(shí)用Western blot檢測(cè)p-Perilipin 1A蛋白表達(dá)。結(jié)果 通過甘油試劑盒監(jiān)測(cè)甘油釋放量，高糖組較對(duì)照組明顯增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01），而高糖加吡格列酮組的甘油釋放量較高糖組明顯減少，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）；同時(shí)Western blot檢測(cè)結(jié)果顯示，與對(duì)照組比較，高糖組p-Perilipin 1A蛋白明顯上調(diào)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01），高糖組與高糖加吡格列酮組比較，顯著抑制了p-Perilipin 1A蛋白的上調(diào)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）。結(jié)論 吡格列酮可能通過阻止p-Perilipin 1A上調(diào)來抑制高糖刺激下的脂肪分解，減少游離脂肪酸，從而改善胰島素抵抗。

[關(guān)鍵詞]吡格列酮；高糖；3T3-L1細(xì)胞；p-Perilipin 1A

[中圖分類號(hào)] R589.2 [文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼] A [文章編號(hào)] 1674-4721（2017）04（c）-0009-04

[Abstract]Objective To investigate the effects of pioglitazone and high glucose on the expression of p-Perilipin 1A protein in 3T3-L1 cells.Methods 3T3-L1 preadipocytes were induced and differentiated into 3T3-L1 adipocytes and then were classified into three groups：control group （5 mmol/L glucose），high glucose group （25 mmol/L glucose）and high glucose plus Pioglitazone group （25 mmol/L glucose + 100 μmol/L Pioglitazone）.The glycerol content of culture medium was determined and taken as the evaluation index of lipolysis；at the same time，Western blot was used to detect the expression of p-Perilipin 1A protein.Results According to the release amount of glycerol monitored by using the glycerol kit，a more obvious increase was seen in high glucose group than in control group，with statistically significant difference （P<0.01）；while，a more obvious decrease of the release amount of glycerol occurred in high glucose plus Pioglitazone group than that in high glucose group，with statistically significant difference （P<0.01）；at the same time，the p-Perilipin 1A proteinof high glucose group detected by Western blot was significantly increased in comparison with control group，with statistically significant difference（P<0.01）；and the expression of p-Perilipin 1A protein was significantly inhibited in high glucose group in contrast with high glucose plus pioglitazone group，with statistically significant difference （P<0.01）.Conclusion Pioglitazone may prevent the up-regulation of p-Perilipin 1A to inhibit glucose-stimulated lipolysis and decrease free fatty acids，thereby improving the insulin resistance.

[Key words]Pioglitazone；High glucose；3T3-L1 cells；p-Perilipin 1A

目前代謝綜合征的發(fā)病率正以驚人的速度上升[1]，脂代謝紊亂是代謝綜合征的病理特點(diǎn)，因?yàn)樵谘h(huán)中增加了源自脂肪組織的非酯化游離脂肪酸（free fatty acid，F(xiàn)FA）[2]。這些FFA可以引發(fā)肌肉、肝臟處胰島素抵抗[3]。FFA的濃度主要由脂肪細(xì)胞的脂肪分解控制。周脂素（PLIN1，Perilipin 1A）能雙重調(diào)控脂類代謝[4]，Perilipin 1A表達(dá)下降和磷酸化上調(diào)都能促進(jìn)脂解，誘發(fā)胰島素抵抗[5]。目前，研究已明確噻唑烷二酮類誘導(dǎo)調(diào)節(jié)糖、脂代謝的相關(guān)蛋白表達(dá)而減輕胰島素抵抗[6]，但是如何調(diào)節(jié)脂代謝的相關(guān)蛋白表達(dá)以改善胰島素抵抗作用的研究尚不多。而本文旨在研究吡格列酮在3T3-L1細(xì)胞是否可通過抑制高糖刺激下的脂滴包被蛋白p-Perilipin1A蛋白的表達(dá)上調(diào)來減少脂肪分解進(jìn)一步減少FFA，以助于減輕胰島素抵抗。

1材料與方法

1.1主要試劑

3T3-L1前脂肪細(xì)胞株（美國(guó)模式培養(yǎng)物集存庫(kù)提供）、葡萄糖（北京益利精細(xì)化學(xué)品有限公司）、地塞米松（D4902）、1-甲基-3-異丁基-黃嘌（I5879）、無酚紅DMEM培養(yǎng)基（美國(guó)Sigmag公司）、胰蛋白酶、5 mmol/L無酚紅葡萄糖（DMEM）培養(yǎng)基（美國(guó)Gibco公司）、兔抗牛p-Perilipin 1A抗體（北京博奧森生物技術(shù)公司）、胰島素（諾和諾德公司）、吡格列酮（原料，純度99.3%，江蘇漣水制藥有限公司）、胎牛血清（美國(guó)PAA公司）、甘油檢測(cè)試劑盒（上海超研生物科技有限公司）、Western blot試劑盒（上海經(jīng)科化學(xué)科技有限公司）。

1.2實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 3T3-L1前脂肪細(xì)胞的培養(yǎng)和誘導(dǎo)分化 3T3-L1前脂肪細(xì)胞以含10%胎牛血清（DMEM）培養(yǎng)基，在室溫、體積分?jǐn)?shù)為0.07的CO2的條件下培養(yǎng)。細(xì)胞融合率為80%～90%時(shí)，行傳代接種。細(xì)胞融合后，加含誘導(dǎo)液（地塞米松、胰島素、1-甲基-3-異丁基-黃嘌呤）的DMEM培養(yǎng)液再孵育2 d；然后以含10 μg/ml胰島素的DMEM培養(yǎng)液孵育2 d，隨后以DMEM培養(yǎng)液繼續(xù)孵育6 d，3T3-L1細(xì)胞在誘導(dǎo)分化約10 d 90%呈脂肪細(xì)胞表型[7]。

1.2.2 3T3-L1脂肪細(xì)胞分組 將3T3-L1脂肪細(xì)胞分為三組：對(duì)照組（5 mmol/L葡萄糖）（第1組）、高糖組（25 mmol/L葡萄糖）（第2組）、高糖+吡格列酮組（25 mmol/L葡萄糖+100 μmol/L吡格列酮）（第3組）。每組細(xì)胞以5 mmol/L葡萄糖培養(yǎng)基培養(yǎng)同步化12 h后，第3組無血清培液中加入吡格列酮，摸索濃度（0、20、40、60、80、100 μmol/L）達(dá)終濃度100 μmol/L，預(yù)處理3 h后，第2組和第3組中加入葡萄糖，終濃度25 mmol/L，溫育24 h。

1.2.3 3T3-L1脂肪細(xì)胞脂肪分解的測(cè)定 將脂肪細(xì)胞進(jìn)行分組，衡量脂肪細(xì)胞分解的指標(biāo)是以孵育后測(cè)定培養(yǎng)基中甘油累積量。將細(xì)胞孵育一定時(shí)間后用GPO-POD酶法直接測(cè)定培養(yǎng)基中甘油含量作為累積值。具體在酶標(biāo)板中每組各設(shè)置5個(gè)孔，將50 μl無酚紅DMEM培養(yǎng)液中加入150 μl工作液中，室溫靜置15 min，于光密度550波長(zhǎng)處比色[8]。繪制曲線計(jì)算甘油濃度。

1.2.4 Western blot檢測(cè)p-Perilipin 1A蛋白的表達(dá) 將總蛋白樣品用SDS-PAGE電泳進(jìn)行分離，并轉(zhuǎn)移至PVDF膜，常溫下以5%脫脂奶粉封閉，加入p-Perilipin 1A多克隆抗體孵育12 h以上，洗滌后，加入辣根過氧化酶（HRP）標(biāo)記的Ⅱ抗室溫孵育1 h，再洗滌，ECL顯影劑顯影，以激光掃描儀進(jìn)行定量掃描。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，兩組間比較采用t檢驗(yàn)，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2結(jié)果

2.1吡格列酮對(duì)高糖誘發(fā)的3T3-L1脂肪細(xì)胞脂肪分解的影響

第2組的甘油量比第1組高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01），第3組較第2組甘油釋放量顯著降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01），而第1組和第3組比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）（圖1）。

2.2吡格列酮對(duì)p-Perilipin 1A蛋白表達(dá)的影響

結(jié)果顯示，第2組中p-Perilipin 1A蛋白的表達(dá)明顯增加，與第1組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）；第3組與第2組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01），而與第1組比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），光密度掃描圖和分析見圖2。

3討論

代謝綜合征是一組復(fù)雜的代謝紊亂群，包括脂代謝紊亂，與心血管疾病的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)[9]，還與其他一系列疾病的發(fā)生率和死亡率密切相關(guān)。有效地封存脂肪可以防止肌肉和肝臟中脂肪酸過度，而破壞代謝綜合征發(fā)生的信號(hào)途徑[10]。Perilipin 1A是屬于最早發(fā)現(xiàn)的脂滴相關(guān)蛋白PAT家族，參與脂肪細(xì)胞內(nèi)三酰甘油的合成與分解，對(duì)糖脂代謝平衡起著關(guān)鍵作用[11]。在正常生理?xiàng)l件下，由兒茶酚胺通過提高細(xì)胞內(nèi)的cAMP濃度并激活cAMP依賴的蛋白激酶PKA，磷酸化p-Perilipin 1A，引發(fā)脂解[12]，且Perilipin的磷酸化是脂解的關(guān)鍵[13]，由此產(chǎn)生適量FFA為機(jī)體供能，保持脂代謝平衡。代謝綜合征患者的FFA升高，原因之一，Perilipin 1A的表達(dá)減少和磷酸化的Perilipin 1A增加，低水平的Perilipin 1A和高水平的p-Perilipin 1A與高脂解率相關(guān)[14]。代謝綜合征患者內(nèi)源性刺激脂解因子的分泌水平增加，如炎癥因子TNF-a、IL-6的分泌等。而最近幾年人們已發(fā)現(xiàn)存在多種抑制劑可以對(duì)這些內(nèi)源性刺激脂解的因子及其信號(hào)通路進(jìn)行抑制，逆轉(zhuǎn)Perilipin 1A的改變，減少脂解。如羅格列酮和橘皮素可以抑制NF-kB的信號(hào)通路，柚皮素可以抑制IL-6的轉(zhuǎn)錄，并能抑制TNF-a和IL-6介導(dǎo)Perilipin 1A的下調(diào)[15]。目前高血糖對(duì)Perilipin 1A磷酸化的影響研究非常少，而高血糖是代謝綜合征的組成部分，因此本研究選擇了以高糖作為刺激脂肪分解的因子，研究發(fā)現(xiàn)，3T3-L1脂肪細(xì)胞在高糖刺激下，高糖組的甘油釋放量明顯較對(duì)照組升高，根據(jù)Western blot法檢測(cè)p-Perilipin 1A蛋白表達(dá)的數(shù)據(jù)顯示，同時(shí)高糖組的p-Perilipin1A蛋白較對(duì)照組增加，并有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，因此本研究顯示高濃度葡萄糖（25 mmol/L）可以提高Perilipin 1A的磷酸化水平，與Zhang等[16]的研究結(jié)果一致，其研究結(jié)果顯示，主要信號(hào)通路可能包括持續(xù)激活磷脂酰肌醇3-激酶（PI3K）和磷脂酶C（PLC），隨之下游信號(hào)蛋白激酶C（PKC）、絲蘇氨酸蛋白激酶（AKT）、絲裂原活化蛋白激酶/胞外調(diào)節(jié)號(hào)1/2（MAPK/ERK1/2）和胞漿型磷脂酶A2（cPLA2）激活而調(diào)節(jié)。

在降血糖的藥物中，噻唑烷二酮類藥物吡格列酮，對(duì)改善胰島素抵抗有著顯著的效能[17]。吡格列酮是PPARγ激動(dòng)劑。已有研究表明PPARγ這個(gè)轉(zhuǎn)錄因子與代謝紊亂的調(diào)節(jié)密切相關(guān)，吡格列酮可通過PPARγ通路調(diào)節(jié)多種信號(hào)因子，影響3T3-L1細(xì)胞脂肪形成[18]，故推測(cè)吡格列酮是否可以逆轉(zhuǎn)Perilipin 1A磷酸化的改變，減少脂解。本研究通過測(cè)定甘油釋放量，吡格列酮預(yù)處理后，可以抑制高糖引發(fā)的脂肪分解，脂肪分解率明顯降低，與高糖組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。同時(shí)根據(jù)Western blot法檢測(cè)p-Perilipin 1A蛋白表達(dá)的數(shù)據(jù)顯示，發(fā)現(xiàn)p-Perilipin1A蛋白表達(dá)下調(diào)，說明吡格列酮可以抑制高糖刺激的p-Perilipin1A蛋白的上調(diào)，進(jìn)一步闡述了高糖刺激下，吡格列酮仍可以通過減少Perilipin1A的磷酸化，減少脂肪分解，則最終可以改善胰島素抵抗。

綜上所述，在代謝綜合征患病率急速上升的趨勢(shì)下，需要尋找有效的藥物來控制各項(xiàng)代謝危險(xiǎn)因素，本研究發(fā)現(xiàn)p-Perilipin 1A蛋白可作為一治療靶點(diǎn)，調(diào)控細(xì)胞的脂肪分解，改善胰島素抵抗，同時(shí)發(fā)現(xiàn)吡格列酮藥物可以有效抑制Perilipin1A的磷酸化，減少脂肪分解，但具體調(diào)控機(jī)制還有待進(jìn)一步研究。

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（收稿日期：2017-02-16 本文編輯：任 念）