人脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞體外高效擴(kuò)增新方法

黃鄧高，高元慧，王順蘭，曹卉，鄭琳麟，張淑芳，余平

（1.中南大學(xué)湘雅醫(yī)學(xué)院免疫系，湖南長(zhǎng)沙410013；2.?？谑腥嗣襻t(yī)院暨中南大學(xué)湘雅醫(yī)院附屬海口醫(yī)院中心實(shí)驗(yàn)室，海南?？?70208）

人脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞體外高效擴(kuò)增新方法

黃鄧高1，高元慧2，王順蘭2，曹卉2，鄭琳麟2，張淑芳2，余平1

（1.中南大學(xué)湘雅醫(yī)學(xué)院免疫系，湖南長(zhǎng)沙410013；2.海口市人民醫(yī)院暨中南大學(xué)湘雅醫(yī)院附屬?？卺t(yī)院中心實(shí)驗(yàn)室，海南?？?70208）

目的運(yùn)用低強(qiáng)度脈沖場(chǎng)超聲(LIPUS)刺激促進(jìn)人脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞(hASCs)增殖，為臨床干細(xì)胞體外高效增殖提供新方法。方法通過(guò)LIPUS體外刺激hASCs細(xì)胞生長(zhǎng)，采用Scepter 2.0手持細(xì)胞計(jì)數(shù)器進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)，運(yùn)用熒光倒置顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)，運(yùn)用流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞表面標(biāo)志物，并進(jìn)行干細(xì)胞臨床前質(zhì)量檢測(cè)。結(jié)果刺激組50 mW/cm2和60 mW/cm2的LIPUS刺激強(qiáng)度均能促進(jìn)細(xì)胞增殖，60 mW/cm2強(qiáng)度更顯著，與對(duì)照組比較差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；細(xì)胞倍增時(shí)間比對(duì)照組縮短，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，刺激后刺激組細(xì)胞表面標(biāo)志物無(wú)變化，增殖后干細(xì)胞質(zhì)量檢測(cè)符合標(biāo)準(zhǔn)要求。結(jié)論LIPUS刺激可促進(jìn)hASCs有效增殖，低強(qiáng)度脈沖場(chǎng)超聲可作為干細(xì)胞體外擴(kuò)增的新方法。

低強(qiáng)度脈沖場(chǎng)超聲；人脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞；細(xì)胞增殖；質(zhì)量檢測(cè)

低強(qiáng)度脈沖場(chǎng)超聲(low-intensity pulsed ultrasound，LIPUS)作為高頻、小振幅和脈沖壓力波傳遞機(jī)械刺激經(jīng)皮進(jìn)入生物組織的一種非侵入性的治療方式[1]，目前被廣泛應(yīng)用于臨床治療。有報(bào)道，LIPUS刺激既促進(jìn)細(xì)胞DNA和蛋白質(zhì)合成[2]，又促進(jìn)細(xì)胞對(duì)鈣的吸收[3]。LIPUS亦可提高細(xì)胞活性、細(xì)胞因子釋放、基因表達(dá)、礦化率、Akt信號(hào)、鉀流動(dòng)、血管生成、腺苷酸環(huán)化酶活性和TGF-β合成的影響等[4-6]，對(duì)再生醫(yī)學(xué)具有重要意義。

脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞(adipose tissue-derived mesenchymal stem cells，ASCs)由于其來(lái)源廣、且容易獲得等特點(diǎn)，已經(jīng)成為新一代組織工程種子細(xì)胞的來(lái)源之一。隨著近年來(lái)干細(xì)胞研究領(lǐng)域的快速發(fā)展，人們對(duì)干細(xì)胞生物學(xué)的了解越來(lái)越深入。人脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞(hASCs)因具有低的免疫原性和強(qiáng)大的免疫調(diào)節(jié)特性，被用于同種異體的細(xì)胞移植等，治療多種疾病和組織損傷[7-8]，促進(jìn)了干細(xì)胞移植和再生醫(yī)學(xué)的發(fā)展。

LIPUS促進(jìn)體內(nèi)組織的修復(fù)，那么它應(yīng)先促進(jìn)體內(nèi)細(xì)胞增殖然后再作用于損傷部位。然而，以往的研究者未見(jiàn)運(yùn)用LIPUS對(duì)hASCs細(xì)胞增殖的研究，且促進(jìn)細(xì)胞增殖機(jī)制未明確。本實(shí)驗(yàn)中，我們運(yùn)用LIPUS刺激促進(jìn)hASCs增殖，增殖后干細(xì)胞質(zhì)量檢驗(yàn)符合要求，實(shí)驗(yàn)結(jié)果為hASCs體外高效擴(kuò)增和產(chǎn)業(yè)化提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細(xì)胞來(lái)源人脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞購(gòu)自廣州賽業(yè)生物科技有限公司，按標(biāo)準(zhǔn)操作進(jìn)行培養(yǎng)和傳代[9-11]。

1.1.2 儀器和試劑人脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞完全培養(yǎng)基(廣州賽業(yè)生物科技有限公司)；0.25%胰酶消化液(Gibco公司)；流式抗體CD105-PE、CD73-PE、CD34-PE、CD14-PE、CD45-PE、HLA-DR-PE和HLA-ABC-PE(廣州BD公司)；支原體培養(yǎng)和鑒定藥敏檢測(cè)試劑盒(中山市天祥電子生物傳感器有限公司)；實(shí)時(shí)定量PCR法檢試劑盒(中山達(dá)安基因檢測(cè)有限公司)；細(xì)菌內(nèi)毒素檢查試劑盒(廈門市鱟試劑實(shí)驗(yàn)廠有限公司)；快速革蘭氏染色試劑盒(珠海貝索生物技術(shù)有限公司)；細(xì)胞培養(yǎng)皿、12孔板、50 mL離心管(Grenier公司)；手持細(xì)胞計(jì)數(shù)儀(Merck Millipore公司)；細(xì)胞擴(kuò)增儀SonaCell (加拿大Intelligent-Nano公司)；細(xì)胞培養(yǎng)箱(美國(guó)Thermo)；實(shí)時(shí)定量PCR儀(瑞士羅氏公司)；熒光倒置顯微鏡(日本Olympus公司)。

1.2 方法

1.2.1 SonaCell細(xì)胞擴(kuò)增儀LIPUS刺激Sona-Cell(Jie Chen提供)超聲設(shè)備是基于生物學(xué)和臨床研究的基礎(chǔ)上設(shè)置的：超聲頻率為1.5 MHz，脈沖重復(fù)頻率為1 kHz，脈沖循環(huán)為20%。超聲平均強(qiáng)度可調(diào)整在0～100 mW/cm2。儀器探頭通過(guò)耦合劑緊貼培養(yǎng)皿底部進(jìn)行輻照，本實(shí)驗(yàn)選用SonaCell細(xì)胞擴(kuò)增儀40 mW/ cm2、50 mW/cm2、60 mW/cm2強(qiáng)度的LIPUS刺激[12]為刺激組，0 mW/cm2強(qiáng)度為對(duì)照組。取hASCs第3代細(xì)胞2×104個(gè)的密度1 mL接種于12孔板相應(yīng)的孔中，細(xì)胞培養(yǎng)24 h后換液，然后使用SonaCell設(shè)備的LIPUS刺激部件于細(xì)胞培養(yǎng)箱中刺激，5 min/d，連續(xù)刺激4d(即細(xì)胞培養(yǎng)24 h、48 h、72 h、96 h)，第5天收集細(xì)胞并計(jì)數(shù)。細(xì)胞倍增時(shí)間(population doubling time，PDT)計(jì)算方法：t=T/3.32(lgN2-lgN1)，T為對(duì)數(shù)期的持續(xù)增長(zhǎng)時(shí)間，N1和N2分別是對(duì)數(shù)增長(zhǎng)開始和結(jié)束的細(xì)胞數(shù)量。做5組重復(fù)實(shí)驗(yàn)，對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。

1.2.2 細(xì)胞計(jì)數(shù)運(yùn)用Scepter 2.0手持細(xì)胞計(jì)數(shù)器進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)，用0.25%胰酶-EDTA消化液消化并收集細(xì)胞，用適量的D-PBS重懸細(xì)胞，取150μL細(xì)胞懸液至1.5 mL離心管中，使用Scepter 2.0計(jì)數(shù)器的60μL感應(yīng)探頭插入液面以下。根據(jù)制造商的說(shuō)明書進(jìn)行操作。使用Scepter Software Pro軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，準(zhǔn)確測(cè)量細(xì)胞的直徑和每毫升體積內(nèi)細(xì)胞的數(shù)量。

1.2.3 細(xì)胞形態(tài)觀察由于細(xì)胞生長(zhǎng)至第5天(120 h)后，顯微鏡下觀察不好分辨細(xì)胞的數(shù)量。本實(shí)驗(yàn)選擇第2次刺激后12 h(即細(xì)胞培養(yǎng)60 h)，對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期初始階段，將刺激組和對(duì)照組細(xì)胞置于倒置顯微鏡下觀察，運(yùn)用Image-Pro Plus軟件拍照。

1.2.4 hASCs免疫表型測(cè)定通過(guò)流式細(xì)胞儀測(cè)定hASCs刺激組與對(duì)照組表面標(biāo)記物CD105、CD73、CD34、CD14、CD45、HLA-DR和HLA-ABC的表達(dá)情況。取消化待測(cè)細(xì)胞，用D-PBS緩沖液清洗兩次。調(diào)整細(xì)胞濃度為3×105個(gè)/mL，加入適量熒光標(biāo)記的單克隆抗體，室溫，避光孵育30 min。再清洗一次，重懸，上機(jī)檢測(cè)，運(yùn)用BD FACSDIVA軟件進(jìn)行分析。

1.2.5 取第3代刺激后hASCs進(jìn)行無(wú)菌試驗(yàn)、支原體檢測(cè)、內(nèi)毒素檢測(cè)、革蘭氏染色、人源特定病毒檢測(cè)參照《干細(xì)胞制劑質(zhì)量控制及臨床前研究指導(dǎo)原則》和《中華人民共和國(guó)藥典》2010年版三部附錄進(jìn)行[13-14]。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法應(yīng)用SPSS20.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件包進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，采用GraphPad Prism6軟件作圖。首先對(duì)數(shù)據(jù)行正態(tài)性檢驗(yàn)，若不符合正態(tài)分布，通過(guò)正態(tài)性轉(zhuǎn)換后再下一步處理。組內(nèi)比較采用One-way ANOVA檢驗(yàn)方法，組間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 LIPUS刺激促進(jìn)hASCs體外增殖LIPUS刺激hASCs體外增殖，第5天計(jì)數(shù)結(jié)果顯示刺激組50 mW/cm2和60 mW/cm2強(qiáng)度都有促進(jìn)細(xì)胞增殖的效果，其中60 mW/cm2刺激強(qiáng)度最明顯，細(xì)胞倍增時(shí)間較對(duì)照組縮短，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見(jiàn)圖1和圖2。

圖1 LIPUS刺激后刺激組與對(duì)照組細(xì)胞計(jì)數(shù)結(jié)果

圖2 LIPUS刺激后刺激組與對(duì)照組PDT的比較

2.2 細(xì)胞形態(tài)觀察細(xì)胞培養(yǎng)60 h(即第2次刺激后12 h)時(shí)觀察細(xì)胞發(fā)現(xiàn)刺激組60 mW/cm2孔中間細(xì)胞密度明顯比邊緣多，細(xì)胞排列緊密，渦旋式生長(zhǎng)；對(duì)照組細(xì)胞均勻分布(見(jiàn)圖3)。

2.3 hASCs細(xì)胞表面標(biāo)志物鑒定LIPUS連續(xù)刺激4 d后取第3代hASCs流式細(xì)胞儀檢測(cè)結(jié)果顯示，刺激組(60 mW/cm2)與對(duì)照組細(xì)胞表面標(biāo)志：CD105、CD73和HLA-ABC均高表達(dá)；CD14、CD34、CD45和HLA-DR均低表達(dá)，見(jiàn)圖4。

2.4 無(wú)菌試驗(yàn)和支原體檢測(cè)刺激后的第3代hASCs細(xì)胞檢測(cè)，48 h均無(wú)細(xì)菌生長(zhǎng)，檢測(cè)結(jié)果均為陰性；支原體培養(yǎng)結(jié)果均為陰性，見(jiàn)圖5。

圖3 LIPUS刺激后細(xì)胞形態(tài)圖(×100)

圖4 hASCs細(xì)胞表面標(biāo)志物檢測(cè)

圖5 LIPUS刺激后hASCs質(zhì)量檢測(cè)圖

2.5 細(xì)胞內(nèi)源致病因子的檢測(cè)刺激后的第3代hASCs細(xì)胞進(jìn)行實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)人源特定病毒包括HBV、HCV、CMV進(jìn)行DNA表達(dá)量，檢測(cè)結(jié)果均為陰性(<5.00E+02 copy)。

2.6 內(nèi)毒素檢測(cè)結(jié)果刺激后的第3代hASCs細(xì)胞通過(guò)“鱟試劑靈敏度復(fù)核試驗(yàn)”法檢測(cè)細(xì)胞培養(yǎng)上清中內(nèi)毒素含量，結(jié)果均為陰性，λ=0.25 EU/mL，濃度值均<2.83 EU/mL。

2.7 革蘭氏染色結(jié)果刺激后的第3代hASCs細(xì)胞染色，油鏡下觀察，結(jié)果均無(wú)革蘭氏細(xì)菌生長(zhǎng)。

3 討論

干細(xì)胞應(yīng)用于臨床治療和再生醫(yī)學(xué)的潛能已被干細(xì)胞研究者們廣泛關(guān)注。而一個(gè)治療的療程至少需要1×107個(gè)細(xì)胞，但從患者、捐贈(zèng)者身上無(wú)法獲得足夠的hASCs，限制了其應(yīng)用[15]。有學(xué)者探索通過(guò)改變各種培養(yǎng)條件，如不同的細(xì)胞因子和生長(zhǎng)因子，促進(jìn)體內(nèi)來(lái)源的ASCs體外擴(kuò)增，目前尚未取得臨床相關(guān)結(jié)論。Jie Chen團(tuán)隊(duì)研究發(fā)現(xiàn)LIPUS不僅促進(jìn)人類臍帶和骨髓來(lái)源的間充質(zhì)干細(xì)胞(MSC)的增長(zhǎng)和集落形成，而且促進(jìn)造血祖干細(xì)胞(HSPC)增殖和分化[12]，表明可利用LIPUS來(lái)獲得更多MSC以用于臨床[12，16]。

通過(guò)研究，筆者發(fā)現(xiàn)強(qiáng)度為60 mW/cm2的LIPUS有效促進(jìn)hASCs的擴(kuò)增，與對(duì)照組比較細(xì)胞數(shù)量增加約17%，細(xì)胞倍增時(shí)間縮短為對(duì)照組的0.875倍。需要的細(xì)胞數(shù)量少，且刺激時(shí)間短，是有效擴(kuò)增hASCs的方法之一。本實(shí)驗(yàn)存在的不足是未進(jìn)行更低頻率刺激和延長(zhǎng)刺激時(shí)間研究。

研究顯示，LIPUS不僅能促進(jìn)HSPC亦能促進(jìn)hASCs有效增殖。LIPUS刺激不改變干細(xì)胞培養(yǎng)條件，只改變細(xì)胞微環(huán)境或能量轉(zhuǎn)換使干細(xì)胞增殖，避免外源細(xì)胞因子和生長(zhǎng)因子等影響。因此，我們的研究結(jié)果將可以為干細(xì)胞體外快速增殖和產(chǎn)業(yè)化提供新途徑。下一步我們將驗(yàn)證其增殖的安全性。

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A new method for efficient amplification of human adipose-derived mesenchymal stem cells in vitro.

HUANG Deng-gao1,GAO Yuan-hui2,WANG Shun-lan2,CAO Hui2,ZHENG Lin-lin2,ZHANG Shu-fang2,YU Ping1. 1.Department of Immunology,Xiangya Hospital,Central South University,Changsha 410013,Hunan,CHINA;2.Central Laboratory,Haikou People's Hospital(Affiliated Haikou Hospital of Central South University Xiangya School of Medicine), Haikou 570208,Hainan,CHINA

ObjectiveTo provide a new method for efficient amplification of clinical stem cells in vitro using low-intensity pulsed ultrasound(LIPUS)-stimulated proliferative human adipose-derived stem cells(hASCs).MethodshASCs cells growth was stimulated by LIPUS in vitro;cell counting was performed using a Scepter 2.0 handheld cell counter;cell morphology was observed by inverted fluorescence microscope;human cell surface marker was detected by flow cytometry and the preclinical quality of stem cells was measured.ResultsCells in stimulation group treated with 50 mW/cm2and 60 mW/cm2LIPUS were both promoted in proliferation,but 60 mW/cm2intensity was more effective(P<0.05),of which cell doubling time was significantly shorten compared to that in control group(P< 0.05).There was no changes in cell surface markers of the stimulation group,and stem cell quality testing met the requirements of standard after proliferation.ConclusionLIPUS stimulation may promote effective proliferation of hASCs,and low-intensity pulsed ultrasound may be used as a new method for expansion of stem cells in vitro.

Low-intensity pulsed ultrasound;Human adipose-derived mesenchymal stem cells;Cell proliferation;Quality control

10.3969/j.issn.1003-6350.2017.12.10.023

R329.2+7

A

1003—6350（2017）10—1617—04

2017-02-15)

海南省重大科技項(xiàng)目(編號(hào)：2013-SZK-01-039)；海南省自然科學(xué)基金面上項(xiàng)目(編號(hào)：20168317)

張淑芳。E-mail：haikuoyiyuan@163.com；余平。E-mail：yuping1953@sina.com