人脂肪間充質干細胞體外高效擴增新方法

黃鄧高，高元慧，王順蘭，曹卉，鄭琳麟，張淑芳，余平

（1.中南大學湘雅醫(yī)學院免疫系，湖南長沙410013；2.?？谑腥嗣襻t(yī)院暨中南大學湘雅醫(yī)院附屬?？卺t(yī)院中心實驗室，海南?？?70208）

人脂肪間充質干細胞體外高效擴增新方法

黃鄧高1，高元慧2，王順蘭2，曹卉2，鄭琳麟2，張淑芳2，余平1

（1.中南大學湘雅醫(yī)學院免疫系，湖南長沙410013；2.?？谑腥嗣襻t(yī)院暨中南大學湘雅醫(yī)院附屬?？卺t(yī)院中心實驗室，海南?？?70208）

目的運用低強度脈沖場超聲(LIPUS)刺激促進人脂肪間充質干細胞(hASCs)增殖，為臨床干細胞體外高效增殖提供新方法。方法通過LIPUS體外刺激hASCs細胞生長，采用Scepter 2.0手持細胞計數器進行細胞計數，運用熒光倒置顯微鏡觀察細胞形態(tài)，運用流式細胞儀檢測細胞表面標志物，并進行干細胞臨床前質量檢測。結果刺激組50 mW/cm2和60 mW/cm2的LIPUS刺激強度均能促進細胞增殖，60 mW/cm2強度更顯著，與對照組比較差異均具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；細胞倍增時間比對照組縮短，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，刺激后刺激組細胞表面標志物無變化，增殖后干細胞質量檢測符合標準要求。結論LIPUS刺激可促進hASCs有效增殖，低強度脈沖場超聲可作為干細胞體外擴增的新方法。

低強度脈沖場超聲；人脂肪間充質干細胞；細胞增殖；質量檢測

低強度脈沖場超聲(low-intensity pulsed ultrasound，LIPUS)作為高頻、小振幅和脈沖壓力波傳遞機械刺激經皮進入生物組織的一種非侵入性的治療方式[1]，目前被廣泛應用于臨床治療。有報道，LIPUS刺激既促進細胞DNA和蛋白質合成[2]，又促進細胞對鈣的吸收[3]。LIPUS亦可提高細胞活性、細胞因子釋放、基因表達、礦化率、Akt信號、鉀流動、血管生成、腺苷酸環(huán)化酶活性和TGF-β合成的影響等[4-6]，對再生醫(yī)學具有重要意義。

脂肪間充質干細胞(adipose tissue-derived mesenchymal stem cells，ASCs)由于其來源廣、且容易獲得等特點，已經成為新一代組織工程種子細胞的來源之一。隨著近年來干細胞研究領域的快速發(fā)展，人們對干細胞生物學的了解越來越深入。人脂肪間充質干細胞(hASCs)因具有低的免疫原性和強大的免疫調節(jié)特性，被用于同種異體的細胞移植等，治療多種疾病和組織損傷[7-8]，促進了干細胞移植和再生醫(yī)學的發(fā)展。

LIPUS促進體內組織的修復，那么它應先促進體內細胞增殖然后再作用于損傷部位。然而，以往的研究者未見運用LIPUS對hASCs細胞增殖的研究，且促進細胞增殖機制未明確。本實驗中，我們運用LIPUS刺激促進hASCs增殖，增殖后干細胞質量檢驗符合要求，實驗結果為hASCs體外高效擴增和產業(yè)化提供依據。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細胞來源人脂肪間充質干細胞購自廣州賽業(yè)生物科技有限公司，按標準操作進行培養(yǎng)和傳代[9-11]。

1.1.2 儀器和試劑人脂肪間充質干細胞完全培養(yǎng)基(廣州賽業(yè)生物科技有限公司)；0.25%胰酶消化液(Gibco公司)；流式抗體CD105-PE、CD73-PE、CD34-PE、CD14-PE、CD45-PE、HLA-DR-PE和HLA-ABC-PE(廣州BD公司)；支原體培養(yǎng)和鑒定藥敏檢測試劑盒(中山市天祥電子生物傳感器有限公司)；實時定量PCR法檢試劑盒(中山達安基因檢測有限公司)；細菌內毒素檢查試劑盒(廈門市鱟試劑實驗廠有限公司)；快速革蘭氏染色試劑盒(珠海貝索生物技術有限公司)；細胞培養(yǎng)皿、12孔板、50 mL離心管(Grenier公司)；手持細胞計數儀(Merck Millipore公司)；細胞擴增儀SonaCell (加拿大Intelligent-Nano公司)；細胞培養(yǎng)箱(美國Thermo)；實時定量PCR儀(瑞士羅氏公司)；熒光倒置顯微鏡(日本Olympus公司)。

1.2 方法

1.2.1 SonaCell細胞擴增儀LIPUS刺激Sona-Cell(Jie Chen提供)超聲設備是基于生物學和臨床研究的基礎上設置的：超聲頻率為1.5 MHz，脈沖重復頻率為1 kHz，脈沖循環(huán)為20%。超聲平均強度可調整在0～100 mW/cm2。儀器探頭通過耦合劑緊貼培養(yǎng)皿底部進行輻照，本實驗選用SonaCell細胞擴增儀40 mW/ cm2、50 mW/cm2、60 mW/cm2強度的LIPUS刺激[12]為刺激組，0 mW/cm2強度為對照組。取hASCs第3代細胞2×104個的密度1 mL接種于12孔板相應的孔中，細胞培養(yǎng)24 h后換液，然后使用SonaCell設備的LIPUS刺激部件于細胞培養(yǎng)箱中刺激，5 min/d，連續(xù)刺激4d(即細胞培養(yǎng)24 h、48 h、72 h、96 h)，第5天收集細胞并計數。細胞倍增時間(population doubling time，PDT)計算方法：t=T/3.32(lgN2-lgN1)，T為對數期的持續(xù)增長時間，N1和N2分別是對數增長開始和結束的細胞數量。做5組重復實驗，對數據進行統(tǒng)計學分析。

1.2.2 細胞計數運用Scepter 2.0手持細胞計數器進行細胞計數，用0.25%胰酶-EDTA消化液消化并收集細胞，用適量的D-PBS重懸細胞，取150μL細胞懸液至1.5 mL離心管中，使用Scepter 2.0計數器的60μL感應探頭插入液面以下。根據制造商的說明書進行操作。使用Scepter Software Pro軟件進行數據分析，準確測量細胞的直徑和每毫升體積內細胞的數量。

1.2.3 細胞形態(tài)觀察由于細胞生長至第5天(120 h)后，顯微鏡下觀察不好分辨細胞的數量。本實驗選擇第2次刺激后12 h(即細胞培養(yǎng)60 h)，對數生長期初始階段，將刺激組和對照組細胞置于倒置顯微鏡下觀察，運用Image-Pro Plus軟件拍照。

1.2.4 hASCs免疫表型測定通過流式細胞儀測定hASCs刺激組與對照組表面標記物CD105、CD73、CD34、CD14、CD45、HLA-DR和HLA-ABC的表達情況。取消化待測細胞，用D-PBS緩沖液清洗兩次。調整細胞濃度為3×105個/mL，加入適量熒光標記的單克隆抗體，室溫，避光孵育30 min。再清洗一次，重懸，上機檢測，運用BD FACSDIVA軟件進行分析。

1.2.5 取第3代刺激后hASCs進行無菌試驗、支原體檢測、內毒素檢測、革蘭氏染色、人源特定病毒檢測參照《干細胞制劑質量控制及臨床前研究指導原則》和《中華人民共和國藥典》2010年版三部附錄進行[13-14]。

1.3 統(tǒng)計學方法應用SPSS20.0統(tǒng)計學軟件包進行數據分析，采用GraphPad Prism6軟件作圖。首先對數據行正態(tài)性檢驗，若不符合正態(tài)分布，通過正態(tài)性轉換后再下一步處理。組內比較采用One-way ANOVA檢驗方法，組間比較采用獨立樣本t檢驗，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 LIPUS刺激促進hASCs體外增殖LIPUS刺激hASCs體外增殖，第5天計數結果顯示刺激組50 mW/cm2和60 mW/cm2強度都有促進細胞增殖的效果，其中60 mW/cm2刺激強度最明顯，細胞倍增時間較對照組縮短，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，見圖1和圖2。

圖1 LIPUS刺激后刺激組與對照組細胞計數結果

圖2 LIPUS刺激后刺激組與對照組PDT的比較

2.2 細胞形態(tài)觀察細胞培養(yǎng)60 h(即第2次刺激后12 h)時觀察細胞發(fā)現刺激組60 mW/cm2孔中間細胞密度明顯比邊緣多，細胞排列緊密，渦旋式生長；對照組細胞均勻分布(見圖3)。

2.3 hASCs細胞表面標志物鑒定LIPUS連續(xù)刺激4 d后取第3代hASCs流式細胞儀檢測結果顯示，刺激組(60 mW/cm2)與對照組細胞表面標志：CD105、CD73和HLA-ABC均高表達；CD14、CD34、CD45和HLA-DR均低表達，見圖4。

2.4 無菌試驗和支原體檢測刺激后的第3代hASCs細胞檢測，48 h均無細菌生長，檢測結果均為陰性；支原體培養(yǎng)結果均為陰性，見圖5。

圖3 LIPUS刺激后細胞形態(tài)圖(×100)

圖4 hASCs細胞表面標志物檢測

圖5 LIPUS刺激后hASCs質量檢測圖

2.5 細胞內源致病因子的檢測刺激后的第3代hASCs細胞進行實時定量PCR檢測人源特定病毒包括HBV、HCV、CMV進行DNA表達量，檢測結果均為陰性(<5.00E+02 copy)。

2.6 內毒素檢測結果刺激后的第3代hASCs細胞通過“鱟試劑靈敏度復核試驗”法檢測細胞培養(yǎng)上清中內毒素含量，結果均為陰性，λ=0.25 EU/mL，濃度值均<2.83 EU/mL。

2.7 革蘭氏染色結果刺激后的第3代hASCs細胞染色，油鏡下觀察，結果均無革蘭氏細菌生長。

3 討論

干細胞應用于臨床治療和再生醫(yī)學的潛能已被干細胞研究者們廣泛關注。而一個治療的療程至少需要1×107個細胞，但從患者、捐贈者身上無法獲得足夠的hASCs，限制了其應用[15]。有學者探索通過改變各種培養(yǎng)條件，如不同的細胞因子和生長因子，促進體內來源的ASCs體外擴增，目前尚未取得臨床相關結論。Jie Chen團隊研究發(fā)現LIPUS不僅促進人類臍帶和骨髓來源的間充質干細胞(MSC)的增長和集落形成，而且促進造血祖干細胞(HSPC)增殖和分化[12]，表明可利用LIPUS來獲得更多MSC以用于臨床[12，16]。

通過研究，筆者發(fā)現強度為60 mW/cm2的LIPUS有效促進hASCs的擴增，與對照組比較細胞數量增加約17%，細胞倍增時間縮短為對照組的0.875倍。需要的細胞數量少，且刺激時間短，是有效擴增hASCs的方法之一。本實驗存在的不足是未進行更低頻率刺激和延長刺激時間研究。

研究顯示，LIPUS不僅能促進HSPC亦能促進hASCs有效增殖。LIPUS刺激不改變干細胞培養(yǎng)條件，只改變細胞微環(huán)境或能量轉換使干細胞增殖，避免外源細胞因子和生長因子等影響。因此，我們的研究結果將可以為干細胞體外快速增殖和產業(yè)化提供新途徑。下一步我們將驗證其增殖的安全性。

[1]Qin L,Fok P,Lu H,et al.Low intensity pulsed ultrasound increases the matrix hardness of the healing tissues at bone-tendon insertion-a partial patellectomy model in rabbits[J].Clin Biomech(Bristol, Avon),2006,21(4):387-394.

[2]He R,Zhou W,Zhang Y,et al.Combination of low-intensity pulsed ultrasound and C3H10T1/2 cells promotes bone-defect healing[J]. Int Orthop,2015,39(11):2181-2189.

[3]Leung KS,Cheung WH,Zhang C,et al.Low intensity pulsed ultrasound stimulates osteogenic activity of human periosteal cells[J]. Clin Orthop Relat Res,2004,(418):253-259.

[4]Hanawa K,Ito K,Aizawa K,et al.Low-intensity pulsed ultrasound induces angiogenesis and ameliorates left ventricular dysfunction in a porcine model of chronic myocardial ischemia[J].PLoS One, 2014,9(8):e104863.

[5]Bernal A,Pérez LM,De Lucas B,et al.Low-Intensity pulsed ultrasound improves the functional properties of cardiac mesoangioblasts [J].Stem Cell Rev,2015,11(6):852-865.

[6]Padilla F,Puts R,Vico L,et al.Stimulation of bone repair with ultrasound:a review of the possible mechanic effects[J].Ultrasonics, 2014,54(5):1125-1145.

[7]dos Santos L,Santos AA,Gon?alves GA,et al.Bone marrow cell therapy prevents infarct expansion and improves border zone remodeling after coronary occlusion in rats[J].Int J Cardiol,2010,145(1):34-39.

[8]Mummery CL,Davis RP,Krieger JE.Challenges in using stem cells for cardiac repair[J].Sci Transl Med,2010,2(27):27ps17.

[9]Zuk PA,Zhu M,Ashjian P,et al.Human adipose tissue is a source of multipotent stem cells[J].Mol Biol Cell,2002,13(12):4279-4295.

[10]Lee RH,Kim B,Choi I,et al.Characterization and expression analysis of mesenchymal stem cells from human bone marrow and adipose tissue[J].Cell Physiol Biochem,2004,14(4-6):311-24.

[11]Kern S,Eichler H,Stoeve J,et al.Comparative analysis of mesenchymal stem cells from bone marrow,umbilical cord blood,or adipose tissue[J].Stem Cells,2006,24(5):1294-1301.

[12]Xu P,Gul-Uludag H,Ang WT,et al.Low-intensity pulsed ultrasound-mediated stimulation of hematopoietic stem/progenitor cell viability,proliferation and differentiation in vitro[J].Biotechnol Lett, 2012,34(10):1965-1973.

[13]國家衛(wèi)生計生委辦公廳,食品藥品監(jiān)管總局辦公廳.衛(wèi)計委印發(fā)干細胞制劑質量控制及臨床前研究指導原則(試行)通知[S].2015. http://www.nhfpc.gov.cn/qjjys/s3581/201508/15d0dcf66b734f338c31 f67477136cef.shtml.

[14]國家藥典委員會.中華人民共和國藥典[M].3版.北京:中國醫(yī)藥科技出版社,2010,附錄:IX B-XIII D.

[15]Bernal A,Pérez LM,De Lucas B,et al.Low-Intensity rulsed ultrasound improves the functional properties of cardiac mesoangioblasts [J].Stem Cell Rev,2015,11(6):852-865.

[16]Xing JZ,Yang X,Xu P,et al.Ultrasound-enhanced monoclonal antibody production[J].Ultrasound Med Biol,2012,38(11):1949-1957.

A new method for efficient amplification of human adipose-derived mesenchymal stem cells in vitro.

HUANG Deng-gao1,GAO Yuan-hui2,WANG Shun-lan2,CAO Hui2,ZHENG Lin-lin2,ZHANG Shu-fang2,YU Ping1. 1.Department of Immunology,Xiangya Hospital,Central South University,Changsha 410013,Hunan,CHINA;2.Central Laboratory,Haikou People's Hospital(Affiliated Haikou Hospital of Central South University Xiangya School of Medicine), Haikou 570208,Hainan,CHINA

ObjectiveTo provide a new method for efficient amplification of clinical stem cells in vitro using low-intensity pulsed ultrasound(LIPUS)-stimulated proliferative human adipose-derived stem cells(hASCs).MethodshASCs cells growth was stimulated by LIPUS in vitro;cell counting was performed using a Scepter 2.0 handheld cell counter;cell morphology was observed by inverted fluorescence microscope;human cell surface marker was detected by flow cytometry and the preclinical quality of stem cells was measured.ResultsCells in stimulation group treated with 50 mW/cm2and 60 mW/cm2LIPUS were both promoted in proliferation,but 60 mW/cm2intensity was more effective(P<0.05),of which cell doubling time was significantly shorten compared to that in control group(P< 0.05).There was no changes in cell surface markers of the stimulation group,and stem cell quality testing met the requirements of standard after proliferation.ConclusionLIPUS stimulation may promote effective proliferation of hASCs,and low-intensity pulsed ultrasound may be used as a new method for expansion of stem cells in vitro.

Low-intensity pulsed ultrasound;Human adipose-derived mesenchymal stem cells;Cell proliferation;Quality control

10.3969/j.issn.1003-6350.2017.12.10.023

R329.2+7

A

1003—6350（2017）10—1617—04

2017-02-15)

海南省重大科技項目(編號：2013-SZK-01-039)；海南省自然科學基金面上項目(編號：20168317)

張淑芳。E-mail：haikuoyiyuan@163.com；余平。E-mail：yuping1953@sina.com