miRNA-29b、MMP-2在大鼠顱內(nèi)動(dòng)脈瘤中的相關(guān)性及藥物干預(yù)

彭浩，陳健龍，趙建農(nóng)，王鵬程，張茂

(海南省人民醫(yī)院神經(jīng)外科，海南?？?70311)

·論著·

miRNA-29b、MMP-2在大鼠顱內(nèi)動(dòng)脈瘤中的相關(guān)性及藥物干預(yù)

彭浩，陳健龍，趙建農(nóng)，王鵬程，張茂

(海南省人民醫(yī)院神經(jīng)外科，海南海口570311)

目的觀察miRNA-29b與MMP-2在顱內(nèi)動(dòng)脈瘤壁組織中的變化，探討其在動(dòng)脈瘤中的相關(guān)性及不同藥物干預(yù)的影響。方法將40只雄性SD大鼠(6周齡)采用隨機(jī)數(shù)字表法分為模型組、多西環(huán)素組、丙戊酸鈉組和對(duì)照組，每組各10只。模型組、多西環(huán)素組、丙戊酸鈉組大鼠均采用頸外動(dòng)脈結(jié)扎制造顱內(nèi)動(dòng)脈瘤模型，對(duì)照組大鼠不做造模處理。前三組于造模成功后分別注射生理鹽水0.1 mL/(kg·d)、多西環(huán)素15 mg/(kg·d)、丙戊酸鈉15 mg/(kg·d)，對(duì)照組大鼠注射生理鹽水0.1 mL/(kg·d)。2個(gè)月后取各組動(dòng)脈組織，采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)miRNA-29b的表達(dá)，采用免疫組化檢測(cè)MMP-2的表達(dá)。結(jié)果模型組、多西環(huán)素組、丙戊酸鈉組和對(duì)照組中miRNA-29b的相對(duì)表達(dá)量分別為(0.27±0.04)，(0.68±0.03)，(0.47±0.15)，(0.95±0.12)，差異均有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F= 10.235，P<0.01)；miRNA-29b表達(dá)量經(jīng)兩兩比較，模型組明顯低于對(duì)照組，丙戊酸鈉組明顯高于模型組，而多西環(huán)素組明顯高于丙戊酸鈉組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；模型組、多西環(huán)素組、丙戊酸鈉組和對(duì)照組中MMP-2陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)分別為(21.10±3.36)，(10.27±1.20)，(15.24±2.13)，(4.50±0.44)，差異均有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=6.013，P<0.01)；MMP-2陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)經(jīng)兩兩比較，模型組明顯高于對(duì)照組，丙戊酸鈉組明顯低于模型組，而多西環(huán)素組則明顯低于丙戊酸鈉組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。結(jié)論miRNA-29b、MMP-2的表達(dá)水平與顱內(nèi)動(dòng)脈瘤的發(fā)生相關(guān)，多西環(huán)素對(duì)MMP-2的抑制作用明顯強(qiáng)于丙戊酸鈉。

顱內(nèi)動(dòng)脈瘤；miRNA-29b；MMP-2；多西環(huán)素；丙戊酸鈉

近年來(lái)，微小RNA(microribonucleic acids，miRNA)與疾病發(fā)生發(fā)展的相關(guān)性研究得到了廣泛的開展。在眾多miRNA中，miRNA-29家族是當(dāng)前研究的熱點(diǎn)。有研究表明，miRNA-29b在顱內(nèi)動(dòng)脈瘤中表達(dá)水平下調(diào)[1]。也有研究表明miRNA-29可以調(diào)控基質(zhì)金屬蛋白酶2(matrix metallalloproteinases 2，MMP2)的生成[2]。目前對(duì)于miRNA-29b與MMP-2在顱內(nèi)動(dòng)脈瘤中的作用機(jī)制尚鮮見報(bào)道，本課題對(duì)miR-NA-29b、MMP-2在顱內(nèi)動(dòng)脈瘤中的表達(dá)、作用機(jī)制進(jìn)行了初步研究，并應(yīng)用多西環(huán)素、丙戊酸鈉對(duì)動(dòng)脈瘤予以干預(yù)，旨在為臨床治療顱內(nèi)動(dòng)脈瘤提供新的思路。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物健康雄性SD大鼠40只，6周齡，體質(zhì)量200～250 g，無(wú)特定病原體級(jí)(SPF級(jí))，購(gòu)自廣東醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心[實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)；SCXK(粵)2013-0008，清潔級(jí)：2級(jí)]。

1.2 主要試劑RNA提取試劑購(gòu)自北京博奧森生物技術(shù)有限公司；miRNAReverse Transcription試劑盒、SYBR Green Mix Kit購(gòu)自德國(guó)凱杰Qiagen公司；PCR擴(kuò)增引物由生工生物工程(上海)股份有限公司提供；miRNA-29b購(gòu)自銳博公司；蛋白提取試劑及BCA定量試劑盒購(gòu)自碧云天公司；一抗(兔抗人MMP-2多克隆抗體，編號(hào)：ZA0331)、二抗(超敏試劑盒，編號(hào)：PV9001)均購(gòu)自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司。

1.3 模型建立及實(shí)驗(yàn)分組將40只雄性SD大鼠(6周齡)采用隨機(jī)數(shù)字表法分為四組：對(duì)照組、模型組、多西環(huán)素組、丙戊酸鈉組，每組10只。模型組、多西環(huán)素組、丙戊酸鈉組大鼠采用頸外動(dòng)脈結(jié)扎制造顱內(nèi)動(dòng)脈瘤模型，對(duì)照組大鼠不做相應(yīng)處理。造模方法：30只大鼠用豬胰彈性蛋白酶滴加到頸外動(dòng)脈及分叉處動(dòng)脈壁周圍，在頸外動(dòng)脈距分叉處約1.5 mm位點(diǎn)，用兩根手術(shù)線結(jié)扎頸外動(dòng)脈，在兩根線之間剪斷頸外動(dòng)脈，使頸外動(dòng)脈的盲段形成頸內(nèi)動(dòng)脈的一個(gè)動(dòng)脈瘤。術(shù)后1周開始1%鹽水飼養(yǎng)。1個(gè)月后行腦血管造影，觀察動(dòng)脈瘤形成情況。飼養(yǎng)室溫保持在18℃～20℃環(huán)境，相對(duì)濕度40%～70%。造模成功后，多西環(huán)素組于腹腔內(nèi)注射多西環(huán)素15 mg/(kg·d)，丙戊酸鈉組于腹腔內(nèi)注射2%丙戊酸鈉200 mg/(kg·d)，持續(xù)1個(gè)月。模型組與對(duì)照組皮下注射生理鹽水0.1 mL/(kg·d)。術(shù)后2個(gè)月，處死動(dòng)物，從大鼠頸總動(dòng)脈分叉部取動(dòng)脈瘤組織標(biāo)本和對(duì)照組正常動(dòng)脈組織標(biāo)本。

1.4 檢測(cè)方法

1.4.1 miRNA-29b的檢測(cè)按照SYBR Green PCR試劑盒說(shuō)明書，以逆轉(zhuǎn)錄合成的cDNA作為模版在實(shí)時(shí)熒光定量PCR(qRT-PCR)儀上進(jìn)行反應(yīng)。反應(yīng)體系為：模版cDNA 0.2 μL，miRNA-29b特異性引物0.6 μL，2 X QuantiTect SYBR Green PCR Mix 5μL，miRNA-29b上游引物5'-CTGACGGAGTTCCTCCAG TTC-3'，下游引物5'-GAGGTTCCCCGAGAAGACGA T-3'；U6作為內(nèi)參，其上游引物為5'-CTCGCTTCGGC AGCACA-3'，下游引物為5'-ACGCTTCACGAATTTG CGT-3'，加DEPC水至總體積為10 μL。PCR反應(yīng)條件為：95℃5 min，95℃5 s，60℃30 s，共40個(gè)循環(huán)。經(jīng)擴(kuò)增得到各目的基因的循環(huán)閾值(Ct)值，以2-ΔΔCT相對(duì)定量的方法分析miRNA-29b與U6拷貝數(shù)的比值。

1.4.2 免疫組化檢測(cè)MMP-2標(biāo)本離體后2 h內(nèi)，經(jīng)10%甲醛固定，酒精梯度脫水，二甲苯透明，石蠟包埋、切片。然后應(yīng)用免疫組化SABC染色法檢測(cè)組織中MMP-2的表達(dá)。陽(yáng)性細(xì)胞表達(dá)計(jì)數(shù)：每張切片隨機(jī)選取5個(gè)400倍視野。

2 結(jié)果

2.1 miRNA-29b在四組中的表達(dá)四組miRNA-29b瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果見圖1。定量分析顯示miRNA-29b在模型組、多西環(huán)素組、丙戊酸鈉組、對(duì)照組中的相對(duì)表達(dá)量分別為(0.27±0.04)，(0.68±0.03)，(0.47±0.15)，(0.95±0.12)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F= 10.235，P=0.000)。模型組中miRNA-29b表達(dá)量明顯低于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。丙戊酸鈉組中miRNA-29b表達(dá)明顯高于模型組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，而多西環(huán)素組中miRNA-29b表達(dá)明顯高于丙戊酸鈉組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

圖1 四組miRNA-29b瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果注：M：100 bp Ladder DNAmarker，條帶由上至下依次為：1 500 bp，1 000 bp，900 bp，800 bp，700 bp，600 bp，500 bp，400 bp，300 bp，200 bp，100 bp。1～5：模型組；6～9：多西環(huán)素組；10～13：丙戊酸鈉組；14～17：對(duì)照組。

2.2 MMP-2在四組中的表達(dá)MMP-2陽(yáng)性表達(dá)主要表現(xiàn)為在細(xì)胞漿著色呈棕色或棕黃色。模型組、多西環(huán)素組、丙戊酸鈉組、對(duì)照組切片在顯微鏡下觀察均有棕黃色的細(xì)胞出現(xiàn)(見圖2)，MMP-2陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)分別為(21.10±3.36)，(10.27±1.20)，(15.24± 2.13)，(4.50±0.44)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=6.013，P= 0.000)。模型組陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)明顯高于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；丙戊酸鈉組陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)明顯低于模型組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，而多西環(huán)素組陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)明顯低于丙戊酸鈉組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

圖2 四組MMP-2免疫組化染色圖(×400)

3 討論

近幾年來(lái)，一些疾病與小分子RNA(microRNA，miRNA)之間的關(guān)系引起許多學(xué)者的關(guān)注[3-4]，但miRNA在腦血管疾病中的研究相對(duì)缺乏。以miRNA為研究基礎(chǔ)探討其在腦動(dòng)脈瘤中的相關(guān)性，對(duì)發(fā)現(xiàn)腦動(dòng)脈瘤的病因與治療等具有重要作用[5]。任何機(jī)體的組成部分在不同的時(shí)間表達(dá)不一樣的miRNA譜，且一個(gè)miRNA可控制多個(gè)靶基因。miRNA和靶基因組成了復(fù)雜的調(diào)節(jié)網(wǎng)絡(luò)，影響著幾乎所有的信號(hào)通路，參與多種病理生理過(guò)程[6]。Merk等[7]發(fā)現(xiàn)過(guò)表達(dá)miRNA-29b會(huì)導(dǎo)致嚴(yán)重的腹主動(dòng)脈瘤擴(kuò)張。同時(shí)，作為miRNA-29b的靶基因，Col1al、Col3al、Col5al、Eln等參與到了疾病的發(fā)生、發(fā)展中。也有研究表明在馬方綜合征小鼠模型中，miRNA-29b的表達(dá)量顯著增加，且TGF-β作為它的靶基因，抑制TGF-β的生成，從而導(dǎo)致細(xì)胞外基質(zhì)的破壞，不能發(fā)揮正常的作用[8]。

基質(zhì)金屬蛋白酶(matrix metalloproteinases，MMPs)主要由體內(nèi)四種細(xì)胞產(chǎn)生，包括內(nèi)皮細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞、成纖維細(xì)胞和巨噬細(xì)胞，其作用是破壞細(xì)胞外基質(zhì)的組成部分，如膠原蛋白、彈性蛋白和非膠原糖蛋白等，導(dǎo)致了細(xì)胞外基質(zhì)的改變，進(jìn)而損壞動(dòng)脈管壁的整體性[9]。研究發(fā)現(xiàn)無(wú)論在人腹主動(dòng)脈瘤還是大鼠腹主動(dòng)脈瘤模型中，MMP-2都有不同程度的表達(dá)增高[10]。Mandelbaum等[11]在研究腦動(dòng)脈瘤標(biāo)本中，發(fā)現(xiàn)瘤壁上MMP-2的表達(dá)量顯著高于對(duì)照組。MMP-2的表達(dá)量上升使胞外基質(zhì)結(jié)構(gòu)出現(xiàn)破壞，從而在導(dǎo)致腦動(dòng)脈瘤的出現(xiàn)。有研究表明多西環(huán)素能夠下調(diào)MMP-2，從而降低大鼠腦動(dòng)脈瘤的發(fā)生率[12]。也有研究表明丙戊酸鈉可以通過(guò)抑制細(xì)胞周期的方式，抑制動(dòng)脈瘤平滑肌細(xì)胞的表型轉(zhuǎn)化，降低細(xì)胞增殖水平，減少基質(zhì)金屬蛋白酶的分泌，從而抑制動(dòng)脈瘤的形成[13]。

在本實(shí)驗(yàn)中，miRNA-29b在顱內(nèi)動(dòng)脈瘤組織的表達(dá)明顯低于正常腦血管動(dòng)脈組織中的表達(dá)，與文獻(xiàn)報(bào)道一致[1]。MMP-2在顱內(nèi)動(dòng)脈瘤組織中高表達(dá)，明顯高于正常腦血管動(dòng)脈組織中的表達(dá)，表明miRNA-29b、MMP-2的表達(dá)水平與動(dòng)脈瘤的形成有關(guān)。有研究表明MMP-2的表達(dá)受miRNA-29b的調(diào)控[2]。在正常腦血管組織中，miRNA29b高表達(dá)，可能抑制了MMP-2的表達(dá)，從而阻斷了對(duì)細(xì)胞外基質(zhì)的破壞；在顱內(nèi)動(dòng)脈瘤中，由于miRNA-29b的表達(dá)明顯減少，可能失去了對(duì)MMP-2的調(diào)控，導(dǎo)致MMP-2的增加，從而出現(xiàn)細(xì)胞外基質(zhì)的降解，導(dǎo)致發(fā)生動(dòng)脈瘤的概率增大。但是在本實(shí)驗(yàn)中，多西環(huán)素組與丙戊酸鈉組MMP-2的表達(dá)較模型組明顯減少，表明多西環(huán)素和丙戊酸鈉在動(dòng)脈瘤形成后抑制了MMP-2的生成，同時(shí)由于MMP-2的減少可能減少了對(duì)miRNA-29b的消耗，因此miRNA-29b較模型組明顯增加。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，多西環(huán)素對(duì)MMP-2的抑制作用強(qiáng)于丙戊酸鈉。因此，多西環(huán)素可作為一種神經(jīng)保護(hù)劑，在腦動(dòng)脈瘤治療中起到一定的保護(hù)作用。

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Correlation of miRNA-29b with MMP-2 in intracranial aneurysms of rats and drug intervention.

PENG Hao,CHEN Jian-long,ZHAO Jian-nong,WANG Peng-cheng,ZHANG Mao.Department of Neurosurgery,Hainan Provincial People's Hospital,Haikou 570311,Hainan,CHINA

ObjectiveTo observe the change of miRNA-29b and MMP-2 in the intracranial aneurysm wall and their correlation,and to explore drug treatment in aneurysm.MethodsForty SD male rats of six weeks'old were randomly divided into four groups:model group(n=10),doxycycline group(n=10),sodium valproate group(n=10), control group(n=10).The last three groups were performed ligation of the external carotid artery to establish intracranial aneurysm model,while rats in the control group were not treated.Then rats of the four groups were injected with saline 0.1 mL/(kg·d),doxycycline 15 mg/(kg·d),sodium valproate 200 mg/(kg·d),saline 0.1 mL/(kg·d)respectively after establishing model successfully.After two months,the intracranial aneurysm tissue and normal arterial tissue were taken.The expression of miRNA-29b was detected by real-time quantitative PCR(qPCR),and the expression of MMP-2 was detected by immunohistochemistry.ResultsThe expression of miRNA-29b in model group(0.27±0.04) was significantly lower than that in the control group(0.95±0.12);sodium valproate(0.47±0.15)significantly improves the level of miRNA-29b(as compared with the model group),and doxycycline(0.68±0.03)further improves the level significantly(as compared with the sodium valproate group);all the differences were statistically significant(P<0.05).The expression of MMP-2 in the model group(21.10±3.36)was significantly higher than that in the control group(4.50±0.44);sodium valproate(15.24±2.13)significantly decreases the level of MMP-2(as compared with the model group),and doxycycline(10.27±1.20)further decreases the level significantly(as compared with the sodium valproate group);all the differences were statistically significant(P<0.05).ConclusionThe expression level of miRNA-29b and MMP-2 may be related to the development of intracranial aneurysms.And the inhibitory effect of doxycycline on MMP-2 was significantly stronger than sodium valproate.

Intracranial aneurysm;miRNA-29b;MMP-2;Doxycycline;Sodium valproate

10.3969/j.issn.1003-6350.2017.10.001

R-332

A

1003—6350（2017）10—1549—03

2016-12-23)

海南省自然科學(xué)基金(編號(hào)：20158354)

陳健龍。E-mail：274619891@qq.com