接種鄰苯二甲酸酯（PAEs）降解菌緩解PAEs對(duì)玉米脅迫效應(yīng)和機(jī)制研究

陳學(xué)斌，趙海明，莫測(cè)輝，蔡全英

暨南大學(xué)環(huán)境學(xué)院，廣東 廣州 510632

接種鄰苯二甲酸酯（PAEs）降解菌緩解PAEs對(duì)玉米脅迫效應(yīng)和機(jī)制研究

陳學(xué)斌，趙海明，莫測(cè)輝，蔡全英*

暨南大學(xué)環(huán)境學(xué)院，廣東 廣州 510632

鄰苯二甲酸酯（PAEs）是一類(lèi)典型的環(huán)境內(nèi)分泌干擾物，國(guó)內(nèi)農(nóng)業(yè)土壤普遍受PAEs的污染。土壤中的PAEs可被農(nóng)作物吸收累積，影響植物的生理生化特性和農(nóng)產(chǎn)品的質(zhì)量安全。探索PAEs污染土壤的生物修復(fù)技術(shù)以及高效降解菌緩解PAEs污染脅迫和降低農(nóng)作物吸收累積PAEs迫在眉睫。以在土壤中的質(zhì)量分?jǐn)?shù)和檢出頻率均較高的鄰苯二甲酸二（2-乙基己基）酯（DEHP）為目標(biāo)化合物，采用DEHP污染土壤（18 mg·kg-1和75 mg·kg-1）進(jìn)行盆栽玉米（Zea mays）試驗(yàn)，研究接種PAEs高效降解菌（嗜吡啶紅球菌Rhodococcus pyridinivorans XB）緩解DEHP脅迫對(duì)玉米生長(zhǎng)、吸收積累DEHP的影響及其抗氧化酶系統(tǒng)的響應(yīng)。結(jié)果顯示，經(jīng)DEHP處理的玉米丙二醛質(zhì)量摩爾濃度顯著增加（P＜0.05），尤其是高濃度處理的玉米根系丙二醛質(zhì)量摩爾濃度增加464%；且高濃度處理的玉米根系過(guò)氧化氫酶和多酚氧化酶活性顯著增加（P＜0.05），生物量顯著下降（P＜0.05），說(shuō)明DEHP嚴(yán)重影響玉米的生長(zhǎng)。與不接種微生物處理相比，玉米接種菌株XB能顯著提高玉米體內(nèi)超氧化物歧化酶（10%～154%）、過(guò)氧化氫酶（11%～34%）及多酚氧化酶（48%～288%）活性，顯著降低丙二醛質(zhì)量摩爾濃度（30%～60%），提高玉米生物量（5%～85%），減少玉米對(duì)DEHP的吸收積累（4%～60%）。結(jié)果說(shuō)明菌株XB能緩解土壤DEHP對(duì)玉米生長(zhǎng)的脅迫，降低玉米吸收積累DEHP，有利于保障農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全。

鄰苯二甲酸二（2-乙基己基）酯；嗜吡啶紅球菌；玉米；抗氧化酶系統(tǒng)；吸收累積

鄰苯二甲酸二（2-乙基己基）酯（DEHP）是一種具有長(zhǎng)側(cè)鏈的鄰苯二甲酸酯（PAEs）化合物，被廣泛用作增塑劑，其在塑料膜中的質(zhì)量分?jǐn)?shù)可高達(dá)40%～60%（魯磊安等，2016）。隨著地膜覆蓋和塑料大棚的推廣應(yīng)用，大量DEHP被釋放到環(huán)境中。長(zhǎng)側(cè)鏈的DEHP在環(huán)境中難以降解（Wang et al.，2015），在中國(guó)農(nóng)田土壤中普遍檢測(cè)出DEHP，其質(zhì)量分?jǐn)?shù)比其他短側(cè)鏈PAEs化合物的高（Cai et al.，2008；楊國(guó)義等，2007）。例如，珠三角菜地和稻田土壤乃至全國(guó)農(nóng)業(yè)土壤單個(gè)PAEs化合物的平均質(zhì)量分?jǐn)?shù)均以DEHP最高（Cai et al.，2008；Niu et al.，2014；蔡全英等，2005；魯磊安等，2016）。DEHP是一種內(nèi)分泌干擾物（Meng et al.，2014），可產(chǎn)生“致癌”毒性，被美國(guó)環(huán)保局（USEPA）和中國(guó)環(huán)境監(jiān)測(cè)總站列為“優(yōu)控污染物”。因此，土壤DEHP污染及其危害備受關(guān)注。

農(nóng)田土壤中的DEHP會(huì)被植物包括農(nóng)作物吸收累積，影響農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全。作者前期研究發(fā)現(xiàn)，一定質(zhì)量分?jǐn)?shù)的DEHP會(huì)抑制菜心（Brassica campestris）和水稻（Oryza sativa）生長(zhǎng)，導(dǎo)致根系形態(tài)結(jié)構(gòu)和根系分泌物種類(lèi)及質(zhì)量分?jǐn)?shù)發(fā)生變化，生物量下降（Zhao et al.，2015；陳桐等，2015；陳意良等，2016）。而且，DEHP會(huì)引起水稻體內(nèi)抗氧化系統(tǒng)如過(guò)氧化物酶（POD）、多酚氧化酶（PPO）活性及丙二醛（MDA）質(zhì)量摩爾濃度發(fā)生變化（陳意良等，2016），影響植物正常的生理生化功能（如菜心葉片的光合作用）等（Zhao et al.，2016）。因此，探尋緩解土壤DEHP污染影響的方法對(duì)保障農(nóng)作物生長(zhǎng)和農(nóng)產(chǎn)品安全尤為重要。

土壤微生物是維持土壤質(zhì)量的重要組成部分。有研究發(fā)現(xiàn)，某些外源微生物可以緩解土壤污染物對(duì)植物生長(zhǎng)的脅迫。例如，在銅污染土壤中接種微生物可以增強(qiáng)海州香薷（Elsholtzia splendens）的光合作用（如光能利用率和碳同化能力）并提高有機(jī)物的積累，緩解銅脅迫對(duì)海州香薷的毒害，顯著提高植株的株數(shù)、株高、生物量等（李月靈等，2015）。在多環(huán)芳烴污染土壤上種植紫花苜蓿（Medicago sativa L.）并接種里氏木霉菌（Trichodermaressei FS10-C）、復(fù)合根瘤菌（Rhizobium meliloti）菌劑可以提高紫花苜蓿生物量（姚倫芳等，2014）。在DEHP和鄰苯二甲酸二正丁酯（DBP）污染土壤中接種AM真菌光壁無(wú)梗球囊霉菌（Acaulospora lavis）和蘇格蘭球囊霉（Glomus caledonium）能夠促進(jìn)豇豆（Vigna unguiculata）生長(zhǎng)、提高葉綠素a及葉綠素b質(zhì)量摩爾濃度和根瘤數(shù)（王曙光等，2003）。然而，目前關(guān)于接種PAEs降解菌對(duì)植物生長(zhǎng)、抗氧化酶系統(tǒng)及吸收累積有機(jī)污染物的研究鮮見(jiàn)報(bào)道。

本研究以前期篩選獲得的PAEs高效降解菌株嗜吡啶紅球菌（Rhodococcus pyridinivorans XB）為實(shí)驗(yàn)材料。前期研究發(fā)現(xiàn)，該菌株能以DEHP為唯一碳源并使其完全礦化，在無(wú)機(jī)鹽培養(yǎng)基中以DEHP為唯一碳源（質(zhì)量濃度800 mg·L-1）5 d降解率達(dá)87%、在燒杯實(shí)驗(yàn)中修復(fù)DEHP污染土壤（質(zhì)量分?jǐn)?shù)為100 mg·kg-1）10 d降解率為70%。采用DEHP污染土壤盆栽玉米（Zea mays），并接種嗜吡啶紅球菌，研究接種DEHP高效降解菌緩解DEHP脅迫對(duì)玉米生長(zhǎng)、吸收積累DEHP的影響及其抗氧化酶系統(tǒng)的響應(yīng)，以期為農(nóng)產(chǎn)品安全生產(chǎn)和污染土壤修復(fù)提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供試材料

菌株XB分離自活性污泥，經(jīng)鑒定屬于嗜吡啶紅球菌種（Rhodococcus pyridinivorans），保存于廣東省微生物菌種保藏中心（編號(hào)：60054）。從保存降解菌的試管中挑取菌株XB于液體LB培養(yǎng)基中，于培養(yǎng)箱內(nèi)振蕩培養(yǎng)24 h（30 ℃，150 r·min-1），所得菌液離心5 min（4 ℃，4500 r·min-1）后，棄去上清液，用0.9%的滅菌生理鹽水沖洗菌體，重復(fù)3次并重懸制成濃度為8.0×108cfu·mL-1的接種菌劑。

水稻土取自華南農(nóng)業(yè)大學(xué)實(shí)驗(yàn)農(nóng)場(chǎng)，采集后于室內(nèi)風(fēng)干、粉碎過(guò)1 mm和2 mm篩備用。水稻土DEHP的背景值為0.24 mg·kg-1，pH為5.59，有機(jī)質(zhì)為30.2 g·kg-1，陽(yáng)離子交換量為7.67 cmol·kg-1，全氮為1.26 g·kg-1，全磷為1.79 g·kg-1，全鉀為18.0 g·kg-1；粒徑組成中砂粒占52.0%，粉粒41.9%，粘粒6.1%。人工配制DEHP污染土壤進(jìn)行玉米盆栽試驗(yàn)。定量量取溶于丙酮（分析純）的DEHP，添加到1 mm的土壤中，攪拌混勻，置于暗處讓丙酮自然揮發(fā)3 d（中途不斷攪拌使溶劑揮發(fā)殆盡），配制獲得DEHP質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為200 mg·kg-1和1000 mg·kg-1的污染土壤。結(jié)合農(nóng)田土壤DEHP的實(shí)際質(zhì)量分?jǐn)?shù)（0.2～25.2 mg·kg-1）（He et al.，2015）和前期研究結(jié)果（高質(zhì)量分?jǐn)?shù)100 mg·kg-1處理植物仍可以正常生長(zhǎng)，但生理生化反應(yīng)嚴(yán)重受抑制）（Zhao et al.，2016；陳意良等，2016），土壤DEHP質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別設(shè)置為20 mg·kg-1和100 mg·kg-1。將上述污染土壤與未污染土壤（粒徑為2 mm）按1∶9（質(zhì)量比）攪拌混勻，污染土壤經(jīng)15 d避光自然老化，測(cè)得DEHP初始質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為18 mg·kg-1和75 mg·kg-1。

1.2 方法

1.2.1 盆栽試驗(yàn)

盆栽試驗(yàn)在暨南大學(xué)環(huán)境學(xué)院溫室進(jìn)行。將上述土壤裝盆（瓷盆的底徑30 cm、上口徑33 cm、高30 cm），每盆裝污染土壤4.5 kg，量取菌劑100 mL，以等量無(wú)菌生理鹽水為對(duì)照，與土壤充分混勻。土壤施用化肥為尿素、過(guò)磷酸鈣和氯化鉀（均為分析純），施用量分別為氮0.20 g·kg-1、磷0.15 g·kg-1和鉀0.20 g·kg-1（磷、鉀的施肥量按P2O5、K2O計(jì)）。盆栽試驗(yàn)設(shè)置空白對(duì)照（Control）、低污染水平土壤（Low，18 mg·kg-1）、高污染水平土壤（High，75 mg·kg-1）、低污染水平土壤接菌（Low-Inoculation）、高污染水平土壤接菌（High-Inoculation），每個(gè)處理設(shè)置3個(gè)重復(fù)，采用隨機(jī)排列。

采用超甜金銀粟2號(hào)種子進(jìn)行盆栽土壤試驗(yàn)。玉米種子用過(guò)氧化氫（15%）消毒10 min，滅菌高純水洗干凈后置于生化培養(yǎng)箱中催芽24 h。采用基質(zhì)育苗至4～5片葉子時(shí)選取生長(zhǎng)健康、長(zhǎng)勢(shì)基本一致的玉米幼苗移栽至上述盆中，每個(gè)盆種植4株，移栽25 d后采樣。玉米莖葉和根系用自來(lái)水和超純水清洗干凈并擦干水分稱重，取部分鮮樣進(jìn)行植物酶測(cè)定，剩余的經(jīng)冷凍干燥機(jī)（賽默飛世爾LL3000，美國(guó)）凍干后磨碎檢測(cè)DEHP質(zhì)量分?jǐn)?shù)。

1.2.2 植物抗氧化酶、多酚氧化酶及丙二醛的測(cè)定方法

玉米根系及莖葉組織勻漿液提?。簻?zhǔn)確稱取2.0 g玉米樣品，加入8 mL10 mmol·L-1磷酸鹽緩沖液（pH=7.4），冰浴條件下制備獲得20%的組織勻漿，離心10 min，取上清液待測(cè)。

植物抗氧化酶活性及丙二醛測(cè)定：根據(jù)試劑盒標(biāo)準(zhǔn)方法（嚴(yán)青云等，2016），利用試劑盒（南京建成生物科技有限公司）進(jìn)行提取，采用黃嘌呤氧化酶法（羥胺法）測(cè)定超氧化物歧化酶（SOD）活性，采用鉬酸銨比色法測(cè)定過(guò)氧化氫酶（CAT）活性，采用硫代巴比妥酸法測(cè)定丙二醛（MDA）質(zhì)量摩爾濃度。采用鄰苯二酚法（Ma et al.，2014）測(cè)定多酚氧化酶（PPO）活性，以單位質(zhì)量下單位時(shí)間內(nèi)分光光度值OD（420 nm）每增加0.01為1個(gè)單位。

1.2.3 植物體DEHP提取和質(zhì)量分?jǐn)?shù)測(cè)定

DEHP提取采用超聲提取方法（Zhao et al.，2015）并有適當(dāng)修改。稱取植物樣品1 g置于玻璃離心管中，加20 mL二氯甲烷（色譜純）超聲提取10 min（重復(fù)3次），3500 r·min-1離心5 min后取上清液合并，采用硅膠柱凈化，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（亞榮RE-52A，上海）以50 r·min-1轉(zhuǎn)速濃縮后，轉(zhuǎn)移至棕色進(jìn)樣瓶中，氮吹定容至1 mL，4 ℃保存待測(cè)。

待測(cè)液中DEHP 采用氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀（GC-MS）分析，參考USEPA 8270C方法（United States Environmental Protection Agency，1996）。GC-MS聯(lián)用儀型號(hào)為GC-MSQP2010（島津，日本），色譜柱為DB-5MS石英毛細(xì)管柱（30 m×0.25 mm×0.25 μm），載氣為高純氦氣(He)。質(zhì)譜儀采用電子轟擊源（EI）。配制梯度濃度為0.1、0.2、0.5、1.0、2.0、4.0 μg·mL-1的DEHP標(biāo)準(zhǔn)溶液并繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。DEHP空白加標(biāo)回收率為85.1%～90.4%，方法檢出限為5.2 μg·kg-1。

1.2.4 統(tǒng)計(jì)分析方法

采用Microsoft Excel 2010軟件處理數(shù)據(jù)，文中數(shù)據(jù)均為各處理的平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)偏差。采用SPSS 17.0軟件進(jìn)行單因素方差分析（One-way ANOVA），采用最小顯著差異法（LSD）進(jìn)行顯著性分析。

為了比較暴露于不同質(zhì)量分?jǐn)?shù)DEHP污染脅迫下玉米接種菌株與對(duì)照處理的響應(yīng)差異，采用生物量敏感響應(yīng)指數(shù)（Biomass Response to Stress，BRS）進(jìn)行評(píng)價(jià)。BRS又可稱為脅迫響應(yīng)生物量，指在某種脅迫存在情況下植物（或某組織、器官）生物量相對(duì)于脅迫不存在情況下的生物量增減量。BRS的計(jì)算方法參照Wang et al.（2009）文獻(xiàn)，公式如下：

式中，BRS為生物量敏感響應(yīng)指數(shù)，BH為高污染水平玉米生物量，BL為低污染水平玉米生物量。

2 結(jié)果

2.1 接種XB菌對(duì)DEHP脅迫下玉米生物量的影響

土壤DEHP脅迫影響玉米的生長(zhǎng)。與空白對(duì)照相比，低水平處理（18 mg·kg-1）的玉米生物量顯著（P＜0.05）增加（高14%），高水平處理（75 mg·kg-1）的則顯著（P＜0.05）降低（低50%）（圖1），這與多環(huán)芳烴污染對(duì)互米花草（Spartina alterniflora）的影響情況類(lèi)似（劉靜等，2015），即低水平促進(jìn)植物的生長(zhǎng)，高水平則抑制生長(zhǎng)。與不接種微生物的處理相比，接種菌株XB促進(jìn)了玉米生長(zhǎng)，生物量增加，尤其是高水平DEHP處理接種菌株XB其玉米生物量是對(duì)應(yīng)未接種處理的1.85倍，說(shuō)明高水平DEHP土壤污染接種菌株XB能有效提高植物的抗逆性。不接種微生物處理的生物量敏感響應(yīng)指數(shù)（BRS）小于接種菌株XB處理（表1），說(shuō)明沒(méi)有接種菌株的玉米受DEHP脅迫更為敏感。由此可知，高水平DEHP污染會(huì)嚴(yán)重影響植物生長(zhǎng)，在土壤中添加嗜吡啶紅球菌XB能有效消除DEHP對(duì)植物生長(zhǎng)的抑制作用。

圖1 玉米植株的生物量Fig. 1 Biomass of the maize

表1 生物量敏感性響應(yīng)指數(shù)Table 1 Index of biomass response to stress

2.2 接種XB菌對(duì)玉米體內(nèi)DEHP質(zhì)量分?jǐn)?shù)的影響

不同DEHP處理下玉米根系和莖葉（或地上部）對(duì)DEHP的積累情況如表2所示。植物根系和莖葉DEHP質(zhì)量分?jǐn)?shù)均隨土壤DEHP質(zhì)量分?jǐn)?shù)增加而增加，這與不同品種菜心對(duì)土壤中PAEs的吸收積累規(guī)律相似（Zhao et al.，2015），說(shuō)明植物可從土壤中吸收累積DEHP。與不接種菌株處理相比，接種菌株XB的根系DEHP質(zhì)量分?jǐn)?shù)顯著下降，莖葉略有下降但差異不顯著。玉米根系DEHP質(zhì)量分?jǐn)?shù)比莖葉的高，轉(zhuǎn)運(yùn)系數(shù)（莖葉DEHP質(zhì)量分?jǐn)?shù)/根系DEHP質(zhì)量分?jǐn)?shù)）低于1.0，即DEHP更多被滯留在根系。

2.3 接種XB菌對(duì)玉米體內(nèi)丙二醛質(zhì)量摩爾濃度的影響

丙二醛（MDA）是細(xì)胞膜質(zhì)的過(guò)氧化產(chǎn)物，若植物體內(nèi)丙二醛積累，則表明植物體內(nèi)質(zhì)膜過(guò)氧化作用加?。悇t友等，2012）。由圖2可知，玉米根系MDA質(zhì)量摩爾濃度隨著土壤DEHP質(zhì)量分?jǐn)?shù)的增加而顯著增加，低污染水平和高污染水平處理的MDA質(zhì)量摩爾濃度分別比空白對(duì)照高出258%和464%，表明膜質(zhì)過(guò)氧化加劇，細(xì)胞傷害加重。低水平DEHP處理玉米莖葉的MDA質(zhì)量摩爾濃度也比空白對(duì)照高出69%。但玉米莖葉MDA比對(duì)應(yīng)處理根系的低，這可能是由于根系吸收或吸附的DEHP對(duì)其產(chǎn)生了比較直接的質(zhì)膜過(guò)氧化作用。莖葉DEHP主要通過(guò)根系吸收并向上運(yùn)移，其運(yùn)移系數(shù)小于1.0（表2），即DEHP更易被滯留在根部（Cai et al.，2015；Zhao et al.，2015），故DEHP對(duì)玉米莖葉產(chǎn)生的質(zhì)膜過(guò)氧化作用相對(duì)較小，其MDA質(zhì)量摩爾濃度較根系的低。類(lèi)似地，有研究發(fā)現(xiàn)隨土壤PAEs質(zhì)量分?jǐn)?shù)增加小麥幼苗葉片MDA質(zhì)量摩爾濃度呈上升趨勢(shì)（張慧芳等，2010）。與不接種微生物處理相比，接菌處理顯著降低根系MDA質(zhì)量摩爾濃度（低、高污染水平處理分別降低了60%和56%）和低污染水平處理莖葉MDA質(zhì)量摩爾濃度（降低了31%）；但高污染水平接菌處理的莖葉MDA質(zhì)量摩爾濃度顯著增加。這可能與高污染水平DEHP處理下玉米莖葉累積更多DEHP（表2），導(dǎo)致其質(zhì)膜過(guò)氧化作用更強(qiáng)有關(guān)。類(lèi)似地，紫花苜蓿與真菌在聯(lián)合修復(fù)石油污染土壤時(shí)，其體內(nèi)MDA質(zhì)量摩爾濃度呈先下降后上升趨勢(shì)（李德生等，2011）。鎘脅迫條件下接種芽孢桿菌T3（Bacillus sp.），蔞蒿（Artemisia selengensis）體內(nèi)MDA質(zhì)量摩爾濃度顯著減少（周小梅等，2016）。

表2 玉米體內(nèi)DEHP質(zhì)量分?jǐn)?shù)及轉(zhuǎn)運(yùn)系數(shù)Table 2 DEHP concentration in the maize and translocation factor mg·kg-1

圖2 接種菌株XB對(duì)玉米體內(nèi)MDA質(zhì)量摩爾濃度的影響Fig. 2 Effect of inoculating strain XB on the content of MDA in the maize

圖3 接種菌株XB對(duì)玉米體內(nèi)SOD活性的影響Fig. 3 Effect of inoculating strain XB on the activity of SOD in the maize

2.4 接種XB菌對(duì)玉米體內(nèi)抗氧化酶活性的影響

通常，植物受污染物脅迫會(huì)引起植物代謝紊亂和活性氧水平升高。為避免由活性氧造成的氧化傷害，植物體內(nèi)的抗氧化酶如SOD、CAT、PPO等活性升高，可有效地清除過(guò)量的活性氧，保護(hù)細(xì)胞或減輕活性氧的傷害（夏民旋等，2015）。由圖3可知，與空白對(duì)照相比，低水平DEHP處理的玉米根系SOD活性顯著增加（36%），而高水平DEHP處理的根系和莖葉SOD活性顯著下降（33%），表明在低水平污染條件下，玉米能有效地清除體內(nèi)的活性氧自由基；但高水平污染下玉米細(xì)胞產(chǎn)生活性氧自由基的功能被激發(fā)，其體內(nèi)SOD活性不足以消除DEHP所引起的氧化脅迫，從而導(dǎo)致SOD活性的降低（常青等，2008）。然而，高水平DEHP處理接種菌株XB能顯著提高玉米根系和莖葉SOD活性，分別是對(duì)應(yīng)不接種微生物處理的2.54倍和1.34倍，分別比空白對(duì)照高出69%和3%?？梢?jiàn)，土壤接種XB菌能有效增強(qiáng)玉米抗氧化酶SOD活性。

隨土壤DEHP質(zhì)量分?jǐn)?shù)增加，根系CAT活性先下降（19%）后上升（5%），高分別數(shù)DEHP處理莖葉的CAT活性也顯著高于空白對(duì)照（58%）（圖4）。類(lèi)似地，劉金光等（2012）發(fā)現(xiàn)隨鎘質(zhì)量分?jǐn)?shù)增加龍葵（Solanum nigrum）幼苗CAT活性先下降后上升。與未接菌處理相比，接菌處理玉米莖葉CAT活性變化不大，但根系的CAT活性明顯增加；高污染水平接菌處理CAT活性比對(duì)應(yīng)不接菌處理的高34%，差異顯著。說(shuō)明在土壤DEHP高水平脅迫下接種菌株XB可提高玉米的抗氧化脅迫。

圖4 接種菌株XB對(duì)玉米體內(nèi)CAT活性的影響Fig. 4 Effect of inoculating strain XB on the activity of CAT in the maize

隨著土壤DEHP質(zhì)量分?jǐn)?shù)的增加，玉米根系PPO活性顯著增加（143%～223%）（圖5），高水平處理玉米莖葉PPO活性比空白對(duì)照的高63%，說(shuō)明玉米抵御DEHP脅迫能力增強(qiáng)。接種菌株XB后，玉米根系和莖葉PPO活性顯著增加，其中根系的PPO活性分別比對(duì)應(yīng)低水平和高水平未接菌處理的提高了192%和64%，莖葉的分別提高了288%和48%。這可能是由于菌株刺激玉米根系和莖葉形成應(yīng)激機(jī)制，激活玉米PPO活性。

圖5 接種菌株XB對(duì)玉米體內(nèi)PPO活性的影響Fig. 5 Effect of inoculating strain XB on the activity of PPO in the maize

3 討論

DEHP是一種典型的內(nèi)分泌干擾物，會(huì)影響植物的生長(zhǎng)和生理生化反應(yīng)（Zhao et al.，2015，2016）。抗氧化酶系統(tǒng)在植物防御污染物脅迫機(jī)制中起重要作用（An et al.，2009）。有研究表明，在PAEs污染條件下，不同植物的組織細(xì)胞活性氧損傷加劇，植物抗氧化酶系統(tǒng)產(chǎn)生應(yīng)激反應(yīng)，酶活性發(fā)生改變（Zhang et al.，2014；Ma et al.，2015；胡芹芹等，2008）。其中一些特定PPO能對(duì)植物體內(nèi)吸收累積的污染物進(jìn)行轉(zhuǎn)化及代謝（Schroder，2007），在受污染脅迫時(shí)，PPO酶活性增加（龔帥帥等，2011）。本研究中，與空白對(duì)照相比，DEHP低水平處理玉米根系和莖葉MDA質(zhì)量摩爾濃度增加，質(zhì)膜過(guò)氧化增加，相應(yīng)地，其根系和莖葉SOD和PPO活性顯著增加，減緩了DEHP脅迫，生物量顯著增加。但高水平處理玉米根系的MDA質(zhì)量摩爾濃度比空白對(duì)照的增加了3.6倍，可能造成比較嚴(yán)重的質(zhì)膜過(guò)氧化損傷，雖然CAT和PPO活性增加，但SOD活性下降，生物量亦隨之下降。

在污染土壤中接種外源微生物（如降解菌或植物促生菌）能夠緩解污染物對(duì)植物的脅迫。例如，在鎘污染條件下接種內(nèi)生真菌（Neotyphodium gansuense），可提高醉馬草（Achnatherum inebrians）體內(nèi)SOD、CAT等活性，降低鎘脅迫產(chǎn)生的活性氧損傷（MDA質(zhì)量摩爾濃度顯著降低）（Zhang et al.，2010）；甘藍(lán)型油菜（Brassica napus）接種抗鎘菌群后其生物量上升（Sheng et al.，2006）。本研究中，在DEHP污染條件下種植的玉米接種菌株XB后，根系SOD、CAT、PPO活性顯著增加，表明細(xì)菌可能與玉米根系形成協(xié)同作用，其抗氧化酶系統(tǒng)被激活，有效地去除逆境中產(chǎn)生的超氧陰離子O2-及H2O2等活性氧自由基，降低污染脅迫，提高生物量（如高污染水平接種處理玉米生物量提高了85%）。當(dāng)然，也可能是菌株XB降解了部分土壤中的DEHP，降低其脅迫作用，使得MDA質(zhì)量摩爾濃度下降，酶活性提高，生物量亦隨之提高。

另外，在污染土壤中接種微生物可以降低植物對(duì)污染物的吸收累積。例如，植入短芽孢桿菌（Brevibacillus brevis）和摩西球囊霉真菌（Glomus mosseae）都可增強(qiáng)三葉草（Trifolium）在鎳脅迫下的生長(zhǎng)能力，并降低其對(duì)鎳的吸收積累（Vivas et al.，2006）。本研究中，玉米接種XB菌顯著降低了根系對(duì)DEHP的吸收積累，這可能是由于菌株XB促進(jìn)了玉米對(duì)土壤及植物體內(nèi)DEHP的降解，也可能是由于菌株XB以土壤中的DEHP為共代謝基質(zhì)將其降解，減少了土壤中DEHP的質(zhì)量分?jǐn)?shù)，進(jìn)而導(dǎo)致玉米對(duì)DEHP的吸收積累下降。但菌株XB調(diào)節(jié)玉米植株體內(nèi)生理生化、降低植物體內(nèi)DEHP質(zhì)量分?jǐn)?shù)等機(jī)制仍有待進(jìn)一步研究。

4 結(jié)論

在土壤DEHP不同質(zhì)量分?jǐn)?shù)污染脅迫下，玉米MDA顯著增加，質(zhì)膜過(guò)氧化損傷加劇，且高污染水平處理顯著降低玉米生物量，玉米根系CAT和PPO活性顯著增加，產(chǎn)生應(yīng)激響應(yīng)。接種降解菌XB可以顯著降解MDA質(zhì)量摩爾濃度，提高玉米體內(nèi)SOD、CAT及PPO活性，緩解DEHP脅迫，降低玉米對(duì)DEHP的吸收積累，有利于保障農(nóng)產(chǎn)品安全。

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Alleviation of Phthalic Acid Ester (PAE) Stress on Maize by Inoculating PAEs-degrading Strain

CHEN Xuebin, ZHAO Haiming, MO Cehui, CAI Quanying*
School of Environment, Jinan University, Guangzhou 510632, China

Phthalic acid esters (PAEs) is a class of typical enviromnental endocrine disrupters.In China, the agricultural soil was generally contaminated by PAEs. PAEs in soil can affect plant growth and their physiological and biochemical characteristics, and also can be taken up and accumulated by crop which affects the safety of agricultural products. It is very urgent to explore the bioremediation technologies of PAEs contaminated soil and to investigate the alleviation of efficient PAE-degrading strain on PAE stress and reduction of PAE uptake and accumulation by crops. In this study, di(2-ethylhexyl) phthalate (DEHP), with higher detection frequency and concentrations among PAE compounds in soil, was selected as the target compound. Maize (Zea mays) was grown in DEHP contaminated soil with concentrations of 18 and 75 mg·kg-1(namely low and high DEHP treatment, respectively) by the pot experiment, and efficient PAE- degrading bacterium (Rhodococcus pyridinivorans XB) was inoculated in maize to investigate its alleviation of DEHP stress on maize growth and DEHP accumulation. Results show that soil DEHP significantly increased malondialdehvde (MDA) content of maize (P＜0.05), especially for the root of high DEHP treatment (by 464%). Correspondingly, the maize biomass of the high DEHP treatment decreased significantly (P＜0.05), even though the activities of superoxide dismutase and catalase of maize root significantly increased (P＜0.05), indicating serious DEHP stress occurred on maize. Compared with non-inoculated microbe treatment, inoculating strain XB could significantly improve the activities of superoxide dismutase (by 10%～154%), catalase (by 11%～34%), polyphenol oxidase (by 48%～288%) and increase maize biomass (by 5%～85%), while reduced malondialdehvde content (by 30%～60%) and DEHP accumulation of maize (by 4%～60%). This suggests that the strain XB could alleviate the stress of DEHP on maize growth, reduce accumulation of DEHP in maize, which is helpful for ensuring the safety of agricultural products.

Di(2-ethylhexyl) phthalate; Rhodococcus pyridinivorans; maize; antioxidant enzyme system; accumulation

10.16258/j.cnki.1674-5906.2017.03.019

X172

A

1674-5906（2017）03-0493-07

陳學(xué)斌, 趙海明, 莫測(cè)輝, 蔡全英. 2017. 接種鄰苯二甲酸酯（PAEs）降解菌緩解PAEs對(duì)玉米脅迫效應(yīng)和機(jī)制研究[J]. 生態(tài)環(huán)境學(xué)報(bào), 26(3): 493-499.

CHEN Xuebin, ZHAO Haiming, MO Cehui, CAI Quanying. 2017. Alleviation of phthalic acid ester (PAE) stress on maize by inoculating PAEs-degrading strain [J]. Ecology and Environmental Sciences, 26(3): 493-499.

國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目（41573087；U1501233）；廣東省自然科學(xué)基金研究團(tuán)隊(duì)項(xiàng)目（1614060000034）；廣東省應(yīng)用型科技研發(fā)專項(xiàng)項(xiàng)目（2016B020242005）

陳學(xué)斌（1991年生），男，碩士研究生，研究方向?yàn)橛袡C(jī)污染土壤修復(fù)。E-mail: 340197081@qq.com *通信作者。蔡全英，E-mail: yingqy@126.com

2017-03-01