麻櫟橡子單寧脫除工藝優(yōu)化及抗氧化性

薛文艷，張文輝，楊 斌，葉權(quán)平

麻櫟橡子單寧脫除工藝優(yōu)化及抗氧化性

薛文艷，張文輝*，楊 斌，葉權(quán)平

（西北農(nóng)林科技大學(xué) 陜西省林業(yè)綜合重點實驗室，陜西 楊凌 712100）

為探索高效可行的麻櫟橡子單寧脫除工藝，實現(xiàn)其綜合開發(fā)，以橋山林區(qū)麻櫟橡子為原料，采用超聲輔助乙醇法對影響單寧脫除率的因素進(jìn)行單因素試驗，選擇影響顯著的4 個因素進(jìn)行響應(yīng)面分析，并測定單寧對1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）自由基和羥自由基（·OH）的清除率，以探索麻櫟橡子單寧的抗氧化活性。結(jié)果表明，液料比、乙醇體積分?jǐn)?shù)、脫除溫度、超聲功率對單寧脫除率影響顯著，模型擬合效果顯著。最優(yōu)脫除工藝為液料比42∶1（mL/g）、乙醇體積分?jǐn)?shù)53%、脫除溫度65 ℃、超聲功率240 W，單寧脫除率為37.27%。麻櫟橡子單寧抗氧化性與其質(zhì)量濃度呈線性正相關(guān)，質(zhì)量濃度為80 mg/L時，其對DPPH自由基的清除率可達(dá)75.56%，對·OH的清除率可達(dá)62.74%，可作為新型抗氧化劑。

麻櫟橡子；單寧脫除；Box-Behnken試驗設(shè)計；響應(yīng)面分析；抗氧化活性

麻櫟（Quercus acutissima），殼斗科櫟屬，是黃土高原南部橋山地區(qū)落葉闊葉林地帶性植被的建群種，不僅維持著該地區(qū)生態(tài)平衡，同時也為當(dāng)?shù)厝罕姽┝素S富的可食用資源[1]。周元等[2]對云南櫟屬植物研究指出：橡實中淀粉及脂肪含量豐富，可用于加工粉絲、豆腐，還可用于制作葡萄糖、釀酒。楊涵貞等[3]研究指出橡實含油酸，亞油酸、棕櫚酸等7 種脂肪酸。但橡子中較高的單寧含量使其口感變差，影響人體對蛋白質(zhì)的吸收，嚴(yán)重者會出現(xiàn)頭暈、厭食等中毒癥狀[4]。這嚴(yán)重制約著橡子資源的綜合開發(fā)利用。國內(nèi)外多項研究指出，植物單寧不僅可用于木材工業(yè)[5-7]，還具有抑菌、抗衰老、抗腫瘤、抗氧化性等多種生理活性[8-9]。楊春濤等[10]對麻櫟樹皮多酚含量及抗氧化性進(jìn)行了測定，張志健等[11]對秦嶺太白地區(qū)橡子脫除技術(shù)進(jìn)行了研究。但鮮見關(guān)于麻櫟橡子單寧含量及抗氧化活性的研究報道。因此有必要探索高效可行的麻櫟橡子單寧脫除技術(shù)并對脫除的單寧進(jìn)行抗氧化活性研究，以實現(xiàn)其在橋山林區(qū)的綜合利用，促進(jìn)當(dāng)?shù)亟?jīng)濟(jì)發(fā)展。

常見的單寧脫除方法有蒸餾水提取法及溶劑提取法。由于單寧化學(xué)組分復(fù)雜，純?nèi)軇┨崛⌒Ч患?，而在有機溶劑（乙醇、丙酮、甲醇等）的水溶液中其溶解度大大提高[12-13]?？紤]到實驗成本及安全性，多選擇乙醇作為提取溶劑[14-15]。超聲波輔助提取利用了超聲波的機械粉碎作用及空化作用[16]，可有效破壞植物細(xì)胞壁，增強溶劑穿透力，加速有效成分溶出。該方法具有提取效率高、時間短、耗能少的優(yōu)點，同時還可避免高溫高壓對提取成分的破壞，在植物有效成分的提取中得到了廣泛的應(yīng)用[17-19]。

影響單寧脫除效果的因素除所用溶劑外，脫除時間、脫除溫度、粉碎粒度等都會對脫除率有所影響。因此有必要進(jìn)行實驗以確定對脫除率影響顯著的因素并進(jìn)行響應(yīng)面優(yōu)化，達(dá)到脫除率的最大化。本實驗以黃土高原南部地區(qū)橋山林區(qū)采集的麻櫟橡子為原料，對超聲輔助乙醇提取法的提取條件進(jìn)行單因素試驗，確定對單寧脫除率影響顯著的因素，通過響應(yīng)面法進(jìn)行優(yōu)化設(shè)計，得出麻櫟橡子單寧脫除最優(yōu)工藝，并測定所得單寧的抗氧化活性，以期為實現(xiàn)麻櫟橡子綜合利用提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

麻櫟橡子于2015年9月中旬采于陜西黃龍山林業(yè)局橋山，西北農(nóng)林科技大學(xué)林學(xué)院森林植物教研室鑒定為殼斗科櫟屬麻櫟（Quercus acutissima）的橡子。

單寧酸（分析純） 天津市天力化學(xué)試劑有限公司；1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）（分析純） 日本和光純藥工業(yè)株式會社；鎢酸鈉、磷鉬酸、磷酸、無水Na2CO3、無水乙醇、水楊酸、雙氧水、七水合硫酸亞鐵、VC等試劑均為分析純。

Folin-Denis顯色劑（F-D顯色劑）：50 g鎢酸鈉，10 g磷鉬酸溶于含375 mL蒸餾水的燒瓶中，再加入25 mL 85%磷酸溶液，電熱套加熱回流2 h，冷卻后定容至500 mL，于棕色瓶中保存?zhèn)溆谩?/p>

飽和Na2CO3溶液：175 g無水Na2CO3于70 ℃溶于500 mL蒸餾水，放置過夜。

1.2 儀器與設(shè)備

R-1001旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀、SHB-Ⅲ循環(huán)水式多用真空泵鄭州長城科工貿(mào)有限公司；UV-1800紫外分光光度計日本島津公司；WLD07S-05型超聲波設(shè)備 南京三樂超聲波技術(shù)發(fā)展有限公司；FW135粉碎機、HH-6數(shù)顯恒溫水浴鍋 圖華電器有限公司；TG16-W微量高速離心機 湖南湘儀實驗儀器開發(fā)有限公司。

1.3 方法

1.3.1 單寧的脫除流程

將麻櫟橡子樣品洗凈，于室內(nèi)陰干至質(zhì)量恒定。用粉碎機粉碎后過一定目數(shù)的篩子，保存于4 ℃冰箱備用。測定時取1 g粉碎后樣品于錐形瓶中，按一定料液比加入一定體積分?jǐn)?shù)的乙醇溶液，在一定超聲功率、脫除時間、脫除溫度條件下進(jìn)行單寧的脫除，抽濾后收集濾液待測。

1.3.2 單寧的測定與脫除率的計算

1.3.2.1 單寧標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作

單寧的測定采用Folin-Denis法[20]。準(zhǔn)確稱量20 mg單寧酸標(biāo)準(zhǔn)品，用蒸餾水定容至100 mL容量瓶中，即配成質(zhì)量濃度為0.2 mg/mL的單寧標(biāo)準(zhǔn)溶液。分別吸取單寧標(biāo)準(zhǔn)溶液0、0.5、1.0、1.5、2.0、3.0、4.0、5.0 mL于50 mL容量瓶中，加入2.5 mL F-D顯色劑，10 mL飽和Na2CO3溶液，加蒸餾水定容至50 mL，于50 ℃水浴5 min，冷卻后測溶液在760 nm波長處的吸光度，用加入0 mL標(biāo)準(zhǔn)液的反應(yīng)體系作對照，每個樣品重復(fù)測定3 次。以單寧質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，平均吸光度為縱坐標(biāo)繪制單寧標(biāo)準(zhǔn)曲線。通過線性回歸分析得回歸方程：y=57.997x+0.029 7，R2=0.998 3。

1.3.2.2 脫除率計算

將抽濾得到的濾液定容于100 mL容量瓶，取1 mL定容后的溶液置于50 mL容量瓶，加入2.5 mL F-D顯色劑、10 mL飽和Na2CO3溶液后加蒸餾水定容，于50 ℃水浴鍋中靜置5 min，冷卻后測體系在760 nm波長處的吸光度，用加入0 mL標(biāo)準(zhǔn)液的反應(yīng)體系作對照，每個樣品重復(fù)測定3 次。根據(jù)平均吸光度和回歸方程求得反應(yīng)液中單寧質(zhì)量濃度，依公式（1）計算單寧脫除率[21]。

式中：Y為單寧質(zhì)量濃度/（mg/mL）；V為反應(yīng)體積/mL；V0為所配溶液的體積/mL；v為取樣量/mL；M為提取物質(zhì)量/g。

1.3.3 單寧脫除工藝的單因素試驗

1.3.3.1 乙醇體積分?jǐn)?shù)對脫除效果的影響

取麻櫟橡子粉末1 g，設(shè)置反應(yīng)條件為液料比40∶1（mL/g）、脫除溫度50 ℃、脫除時間30 min、超聲功率300 W、粉碎粒度80 目，考察乙醇體積分?jǐn)?shù)20%～80%時的脫除率。實驗重復(fù)3 次。

作為對照，取麻櫟橡子粉末1 g，設(shè)置反應(yīng)條件為液料比40∶1（mL/g）、粉碎粒度80目、50 ℃水浴鍋浸提30 min，考察乙醇體積分?jǐn)?shù)20%～80%時的脫除率。實驗重復(fù)3 次。

1.3.3.2 液料比對脫除效果的影響

取麻櫟橡子粉末1 g，設(shè)置反應(yīng)條件為乙醇體積分?jǐn)?shù)50%、脫除溫度50 ℃、脫除時間30 min、超聲功率300 W、粉碎粒度80 目，考察液料比10∶1～60∶1（mL/g）時的脫除率。實驗重復(fù)3 次。

作為對照，取麻櫟橡子粉末1 g，設(shè)置反應(yīng)條件為乙醇體積分?jǐn)?shù)50%、粉碎粒度80目、50 ℃水浴鍋浸提30 min，考察液料比10∶1～60∶1（mL/g）時的脫除率。實驗重復(fù)3 次。

1.3.3.3 脫除時間對脫除效果的影響

取麻櫟橡子粉末1 g，設(shè)置反應(yīng)條件為液料比40∶1（mL/g）、乙醇體積分?jǐn)?shù)50%、脫除溫度50 ℃、超聲功率300 W、粉碎粒度80 目，考察脫除時間30～90 min時的脫除率。實驗重復(fù)3 次。

作為對照，取麻櫟橡子粉末1 g，設(shè)置反應(yīng)條件為液料比40∶1（mL/g）、乙醇體積分?jǐn)?shù)50%、脫除溫度300 W、粉碎粒度80 目，考察水浴時間30～90 min時的脫除率。實驗重復(fù)3 次。

1.3.3.4 超聲功率對脫除效果的影響

取麻櫟橡子粉末1 g，設(shè)置反應(yīng)條件為液料比40∶1（mL/g）、乙醇體積分?jǐn)?shù)50%、脫除溫度50 ℃、粉碎粒度80 目、脫除時間30 min，考察超聲功率100～400 W時的脫除率。實驗重復(fù)3 次。

1.3.3.5 脫除溫度對脫除效果的影響

取麻櫟橡子粉末1 g，設(shè)置反應(yīng)條件為液料比40∶1（mL/g）、乙醇體積分?jǐn)?shù)50%、脫除時間30 min、超聲功率300 W、粉碎粒度80 目，考察脫除溫度20～80 ℃時的脫除率。實驗重復(fù)3 次。

作為對照，取麻櫟橡子粉末1 g，設(shè)置反應(yīng)條件為液料比40∶1（mL/g）、乙醇體積分?jǐn)?shù)50%、脫除時間30 min、粉碎粒度80 目，考察水浴溫度20～80 ℃時的脫除率。實驗重復(fù)3 次。

1.3.3.6 粉碎粒度對脫除效果的影響

取麻櫟橡子粉末1 g，設(shè)置反應(yīng)條件為液料比40∶1（mL/g）、乙醇體積分?jǐn)?shù)50%、脫除溫度50 ℃、超聲功率300 W、脫除時間30 min，考察粉碎粒度20～80目時的脫除率。實驗重復(fù)3 次。

作為對照，取麻櫟橡子粉末1 g，設(shè)置反應(yīng)條件為液料比40∶1（mL/g）、乙醇體積分?jǐn)?shù)50%、50 ℃水浴鍋浸提30 min，考察粉碎粒度20～80 目時的脫除率。實驗重復(fù)3 次。

1.3.4 單寧脫除工藝的響應(yīng)面優(yōu)化設(shè)計

依單因素試驗結(jié)果，選擇對單寧脫除率影響顯著的液料比、乙醇體積分?jǐn)?shù)、脫除溫度、超聲功率4個因素，采取Box-Behnken響應(yīng)面設(shè)計法對提取工藝進(jìn)行四因素三水平的試驗設(shè)計。各因素與水平設(shè)計見表1。

表 1 Box-Behnken試驗設(shè)計因素及水平Table 1 Factors and their coded levels used in Box-Behnken experimental design

1.3.5 麻櫟橡子單寧抗氧化活性的測定

1.3.5.1 麻櫟橡子單寧對DPPH自由基的清除率[22]

配制質(zhì)量濃度為20、30、40、50、60、70、80 mg/L的單寧樣品溶液，量取不同質(zhì)量濃度的樣品溶液0.1 mL，加入3.9 mL DPPH溶液，搖勻后于室溫避光靜置30 min，并測定517 nm波長處的吸光度（A1）。分別測定0.1 mL蒸餾水與3.9 mL DPPH混合液的吸光度（A0），0.1 mL蒸餾水與3.9 mL 95%乙醇溶液混合的吸光度（A2），每組實驗重復(fù)3 次。同時測定不同質(zhì)量濃度VC溶液對DPPH自由基的清除率作為對照。DPPH自由基清除率按式（2）計算：

1.3.5.2 麻櫟橡子單寧對?OH的清除力[23]

配制質(zhì)量濃度為20、30、40、50、60、70、80 mg/L的單寧樣品溶液，量取不同質(zhì)量濃度的樣品溶液1 mL于10 mL離心管，并加入0.3 mol/L FeSO4、0.25 mL 20 mmol/L H2O2、1 mL 3 mmol/L水楊酸。將離心管于37 ℃水浴鍋中靜置30 min，冷卻后在離心管中加入蒸餾水使反應(yīng)體系總體積3 mL。之后將離心管以2 000 r/min離心10 min，于510 nm波長處測定上清液的吸光度，每組實驗重復(fù)3次。同時測定不同質(zhì)量濃度VC溶液對?OH的清除率作為對照。?OH清除率按式（3）計算：

式中：A0為空白管吸光度；A1為加入樣品后吸光度。

1.4 數(shù)據(jù)處理

在IBM SPSS 19.0中進(jìn)行單因素方差分析，進(jìn)行Duncan多重比較。在Design-Expert進(jìn)行響應(yīng)面優(yōu)化試驗設(shè)計及分析，在Excel 2013中繪制單寧酸標(biāo)準(zhǔn)曲線與抗氧化曲線。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗結(jié)果

2.1.1 乙醇體積分?jǐn)?shù)對脫除效果的影響

圖 1 乙醇體積分?jǐn)?shù)對麻櫟橡子單寧脫除率的影響Fig. 1 Effect of ethanol concentration on the removal rate of tannins

如圖1所示，超聲輔助條件下，乙醇體積分?jǐn)?shù)低于50%時，單寧脫除率隨乙醇體積分?jǐn)?shù)增大顯著提高（P＜0.05），增幅58.42%；乙醇體積分?jǐn)?shù)為50%時單寧脫除率達(dá)到最高，隨乙醇體積分?jǐn)?shù)繼續(xù)提高單寧脫除率顯著降低（P＜0.05），降幅23.21%；乙醇體積分?jǐn)?shù)由70%增加至80%，單寧脫除率降低0.16%，差異不顯著（P＞0.05），說明此時體系已達(dá)平衡狀態(tài)，不再有單寧溶出。常規(guī)水浴條件下，隨乙醇體積分?jǐn)?shù)的提高，單寧脫除率也表現(xiàn)出先升高后下降的趨勢，乙醇體積分?jǐn)?shù)低于50%，單寧脫除率隨乙醇體積分?jǐn)?shù)提高顯著提高（P＜0.05），增幅26.48%，明顯低于超聲輔助；乙醇體積分?jǐn)?shù)為50%時單寧脫除率達(dá)到最高；乙醇體積分?jǐn)?shù)高于50%，單寧脫除率隨乙醇體積分?jǐn)?shù)提高顯著降低（P＜0.05），降幅14.48%，低于超聲輔助。圖2表明，乙醇體積分?jǐn)?shù)相同時，超聲輔助條件下單寧脫除率高于常規(guī)水浴。超聲輔助條件下最高單寧脫除率較常規(guī)水浴高8.96%，平均單寧脫除率較常規(guī)水浴高4.45%。

圖 2 液料比對麻櫟橡子單寧脫除率的影響Fig. 2 Effect of liquid-to-solid ratio on the removal rate of tannins

2.1.2 液料比對脫除效果的影響如圖2所示，超聲輔助條件下，不同液料比單寧脫除率差異顯著（P＜0.05），液料比低于40∶1，單寧脫除率隨液料比增加而顯著增加（P＜0.05），增幅21.40%，這說明液料比越高，反應(yīng)越充分，越有利于單寧的溶出；液料比為40∶1（mL/g）時單寧脫除率最高，隨液料比繼續(xù)提高，單寧脫除率顯著降低（P＜0.05），降幅

18.79 %。常規(guī)水浴條件下，液料比40∶1（mL/g）時，單寧脫除率最高；液料比低于40∶1（mL/g），單寧脫除率顯著提高（P＜0.05），增幅11.15%，低于超聲輔助條件下；液料比高于40∶1（mL/g），單寧脫除率顯著降低（P＜0.05），降幅18.03%，低于超聲輔助。由圖

2可知，相同液料比超聲輔助條件下單寧脫除率高于常規(guī)水浴，超聲輔助條件下最高單寧脫除率較常規(guī)水浴高

4.49 %，平均單寧脫除率較常規(guī)水浴高3.38%。

2.1.3 脫除時間對脫除效果的影響

圖 3 脫除時間對麻櫟橡子單寧脫除率的影響Fig. 3 Effect of extraction time on the removal rate of tannins

如圖3所示，超聲輔助條件下，除30 min與50 min及80 min與50 min間單寧脫除率差異顯著（P＜0.05），其他脫除時間單寧脫除率差異不顯著（P＞0.05）；50 min時單寧脫除率達(dá)到較高水平（35.82%），最高脫除率與最低脫除率僅相差0.056%。常規(guī)水浴條件下，單寧脫除率隨脫除時間變化均不顯著（P＞0.05），70 min時單寧脫除率達(dá)到較高水平（30.75%），20～90 min內(nèi)，隨脫除時間的延長，單寧脫除率僅提高0.16%。因此在實際生產(chǎn)為節(jié)約成本，提高效率，應(yīng)將脫除時間選為20 min。由圖3可知，脫除時間相同時，超聲輔助條件下單寧脫除率高于常規(guī)水浴，超聲輔助條件下最高單寧脫除率較常規(guī)水浴條件高5.07%，平均單寧脫除率較常規(guī)水浴高5.10%。

2.1.4 超聲功率對脫除效果的影響

圖 4 超聲功率對麻櫟橡子單寧脫除率的影響Fig. 4 Effect of ultrasonic power on the removal rate of tannins

由圖4可知，隨超聲功率增強，單寧脫除率顯著提高（P＜0.05）。超聲功率300 W時單寧脫除率達(dá)到最高；當(dāng)超聲功率由300 W提高到400 W時，單寧脫除率顯著降低（P＜0.05）；超聲輔助條件下平均單寧脫除率34.20%，超聲功率低于300 W時，單寧脫除率的增幅為11.03%。

2.1.5 脫除溫度對脫除效果的影響

圖 5 脫除溫度對麻櫟橡子單寧脫除率的影響Fig. 5 Effect of extraction temperature on the removal rate of tannins

如圖5所示，超聲輔助條件下，單寧脫除率在30 ℃與40 ℃、50 ℃與60 ℃、70 ℃與80 ℃之間差異不顯著（P＞0.05），其余各溫度間差異顯著（P＜0.05）；脫除溫度低于50 ℃時，單寧脫除率隨脫除溫度的升高而提高，增幅20.74%；脫除溫度50 ℃時單寧脫除率達(dá)36.85%；隨著溫度繼續(xù)升高，單寧脫除率緩慢降低，溫度升高20 ℃，單寧脫除降低4.45%。常規(guī)水浴條件下，溫度低于50 ℃，單寧脫除率隨溫度的升高顯著提高（P＜0.05），增幅11.38%，低于超聲輔助；50 ℃時單寧脫除率最高，為30.14%；隨溫度繼續(xù)升高，單寧脫除率顯著降低（P＜0.05），降幅23.29%。由圖5可知，脫除溫度相同時，超聲輔助條件下單寧脫除率高于常規(guī)水浴，超聲輔助條件下最高單寧脫除率較常規(guī)水浴高6.71%，平均單寧脫除率較常規(guī)水浴高7.30%。

2.1.6 粉碎粒度對脫除效果的影響

如圖6所示，超聲輔助條件下，不同粉碎粒度間單寧脫除率差異均不顯著（P＞0.05）。40 目時單寧脫除率達(dá)到較高水平（35.65%），粉碎粒度由20 目提高到100 目，單寧脫除率降低0.06%，這說明粉碎粒度為20 目時，麻櫟橡子粉末已與溶劑充分接觸，脫除量已達(dá)較高水平。常規(guī)水浴條件下，單寧脫除率隨粉碎粒度變化均不顯著（P＞0.05），隨粉碎粒度變化，最高脫除率與最低脫除率僅相差0.13%，因此在實際生產(chǎn)中應(yīng)將粉碎粒度確定為20 目。由圖6可知，粉碎粒度相同時，超聲輔助條件下單寧脫除率高于常規(guī)水浴，超聲輔助條件下最高單寧脫除率較常規(guī)水浴高3.84%，平均單寧脫除率較常規(guī)水浴高3.80%。

圖 6 粉碎粒度對麻櫟橡子單寧脫除率的影響Fig. 6 Effect of raw material particle size on the removal rate of tannins

2.2 響應(yīng)面試驗結(jié)果

2.2.1 Box-Behnken試驗設(shè)計結(jié)果

表 2 Box-Behnken優(yōu)化試驗設(shè)計與結(jié)果Table 2 Box-Behnken design in terms of coded values with response variable

對液料比、乙醇體積分?jǐn)?shù)、脫除溫度、超聲功率4 個對單寧脫除率影響顯著的因素進(jìn)行Box-Behnken試驗設(shè)計，并依試驗設(shè)計方案進(jìn)行了29 次試驗得到單寧脫除率實測值。試驗設(shè)計及單寧脫除率結(jié)果見表2。

2.2.2 響應(yīng)模型方差分析

通過對表2數(shù)據(jù)進(jìn)行回歸擬合，得到麻櫟橡子單寧脫除率對乙醇體積分?jǐn)?shù)、液料比、脫除溫度、超聲功率的多元回歸方程：單寧脫除率37.16－0.12A－0.059B+ 0.28C－0.15D+0.13AB+1.23AC－0.2AD+0.48BC－0.32BD+0.21CD－1.47A2－0.39B2－0.52C2－0.52D2。

表 3 麻櫟橡子單寧脫除率多元回歸方程模型方差分析Table 3 Analysis of variance and statistical parameters of regression model

表3方差分析結(jié)果表明，本試驗擬合的回歸方程模型極顯著（P＜0.01），失擬項不顯著（P0.230 5＞0.05），R20.957 2，0.914 5，說明該模型擬合效果良好。因素C對麻櫟橡子單寧脫除率線性影響極顯著（P＜0.01），因素A、B、D線性作用不顯著；兩因素交互作用中，因素AC、BC交互影響極顯著（P＜0.01），因素BD交互作用顯著（P＜0.05），因素AB、AD、CD交互作用不顯著，A2、B2、C2、D2曲面效應(yīng)影響均極顯著（P＜0.01）。各因素對麻櫟橡子單寧脫除率影響依次為：C（脫除溫度）＞D（超聲功率）＞A（液料比）＞B（乙醇體積分?jǐn)?shù)）。

2.2.3 響應(yīng)面優(yōu)化

圖7a、d、f響應(yīng)面傾斜度小，且等高線圖近圓形，說明圖中顯示的兩因素交互作用對單寧脫除率影響不顯著。圖7b、c、e響應(yīng)面傾斜度大，且等高線圖為橢圓形，說明圖中顯示的兩因素交互作用對單寧脫除率影響顯著，符合模型方差分析的結(jié)果。

圖 7 各因素交互作用的響應(yīng)面和等高線Fig. 7 Response surface and contour plots showing the influence of various factors on the removal rate of tannins

2.2.4 最佳條件的確定和回歸模型的驗證

為進(jìn)一步確定最優(yōu)提取工藝，在設(shè)置擬合方程各因素的取值范圍后，使用快速上升法進(jìn)行方案優(yōu)化，得到的最優(yōu)方案為：液料比42.12∶1（mL/g）、乙醇體積分?jǐn)?shù)53.48%、脫除溫度65 ℃、超聲功率238.14 W。此工藝條件下單寧脫除率為37.29%。為檢驗數(shù)據(jù)的可靠性，在保證實驗可操作性前提下，將提取工藝修正為液料比42∶1（mL/g）、乙醇體積分?jǐn)?shù)53%、脫除溫度65 ℃、超聲功率240 W，依修正后工藝進(jìn)行3 次驗證實驗，所得平均單寧脫除率37.27%，與理論值相比，相對誤差僅為0.05%，說明該模型擬合效果顯著。

2.3 單寧抗氧化活性

2.3.1 麻櫟橡子單寧對DPPH自由基的清除能力

圖 8 麻櫟橡子單寧及VC對DPPH自由基的清除作用Fig. 8 DPPH free radical scavenging capacity of the tannins and VC

由圖8可知，隨麻櫟橡子單寧質(zhì)量濃度的提高，其對DPPH自由基的清除能力顯著增強（P＜0.05）。麻櫟橡子單寧對DPPH自由基清除能力與單寧質(zhì)量濃度呈良好的線性相關(guān)關(guān)系，相關(guān)系數(shù)R2為0.991 8，VC質(zhì)量濃度與其對DPPH自由基的清除能力線性相關(guān)系數(shù)R2為0.827 8。當(dāng)麻櫟橡子單寧質(zhì)量濃度為80 mg/L時，其對DPPH自由基的清除率可達(dá)75.56%。相同質(zhì)量濃度的VC對DPPH自由基的清除率為87.35%，僅相差11.79%。說明麻櫟橡子單寧對DPPH自由基有較強的清除能力。

2.3.2 麻櫟橡子單寧對·OH的清除能力

圖 9 不同質(zhì)量濃度麻櫟橡子單寧及VC對·OH的清除作用Fig. 9 Hydroxyl free radical scavenging capacity of the tannins and VC

由圖9可知，麻櫟橡子單寧對·OH的清除能力隨其質(zhì)量濃度的提高顯著增強（P＜0.05）。麻櫟橡子單寧對·OH清除能力與單寧質(zhì)量濃度線性相關(guān)，R2為0.949 6。VC質(zhì)量濃度與其對·OH的清除能力線性相關(guān)系數(shù)R2為0.939 0。當(dāng)麻櫟橡子單寧質(zhì)量濃度為80 mg/L時，其對·OH的清除率可達(dá)62.74%。相同質(zhì)量濃度的VC對·OH的清除率為95.10%。麻櫟橡子單寧對·OH有較強的清除能力。

3 討 論

超聲波提取法作為一種新型提取方法，具有方便控制、升溫快的特點，尤其適用于提取熱敏感型物質(zhì)[24]。本研究中，控制其他因素相同，超聲輔助提取麻櫟橡子單寧脫除率高于常規(guī)水浴浸提，且超聲輔助條件下麻櫟橡子單寧脫除率的增幅更高。Naima[25]、張志健[11]等研究結(jié)果均表明超聲輔助條件下單寧的提取量較常規(guī)水浴浸提顯著提高。這與超聲提取的特性有關(guān)。超聲波振動產(chǎn)生并傳遞能量，改變被提取物質(zhì)結(jié)構(gòu)；同時超聲波空化作用形成瞬時高溫高壓破壞細(xì)胞壁，有效成分直接、快速進(jìn)入溶劑。另外，超聲波熱效應(yīng)、乳化、凝聚效應(yīng)等次級效應(yīng)加速了植物有效成分的溶出[16]。

麻櫟橡子單寧脫除率隨乙醇體積分?jǐn)?shù)提高而提高，是因為單寧易溶于有機溶劑。隨乙醇體積分?jǐn)?shù)繼續(xù)提高，其極性越小，單寧溶解度減小，脫除率降低。單寧脫除率隨超聲功率的變化趨勢與超聲波的特性有關(guān)。超聲功率越大，機械、空化作用越強，擴(kuò)散速率越快。而功率過大又加速聚合單寧液化，使其降解為小分子基團(tuán)而失活。一定溫度范圍內(nèi)，單寧脫除率隨溫度升高而提高，是由于高溫可加速反應(yīng)進(jìn)程，加速單寧的擴(kuò)散、溶解。溫度過高加速聚合單寧的液化而使其失活，同時加速溶劑蒸發(fā)，降低單寧脫除率。隨液料比提高，橡子粉末與溶劑接觸面積增大，反應(yīng)更充分，單寧脫除率越高。超過一定范圍后，繼續(xù)增加液料比會降低固液濃度差增幅[26-27]，導(dǎo)致脫除率下降。脫除時間對橡子單寧脫除率影響不顯著，是因為時間延長后單寧被氧化，同時單寧被充分提取后體系達(dá)到動態(tài)平衡，脫除率變化不明顯。

研究表明，植物材料有效化學(xué)成分提取最適液料比為15∶1～25∶1（mL/g）[28-30]，本研究麻櫟橡子單寧脫除最適液料比42∶1（mL/g）。這可能是因為作為提取劑的乙醇對麻櫟橡子單寧的溶解性差。關(guān)于麻櫟橡子單寧結(jié)構(gòu)及最佳提取劑的選擇有待進(jìn)一步研究。

曹海霞等[31]采用超聲波輔助提取法對蒙古櫟橡子單寧脫除工藝進(jìn)行了研究，發(fā)現(xiàn)最優(yōu)工藝條件下蒙古櫟橡子單寧脫除率為90.54%，本研究中超聲輔助條件下麻櫟橡子單寧脫除率最高為37.27%，產(chǎn)生差異的原因是由于所選原料不同。同時，橡子的采收時間及處理方式都會影響單寧脫除率及活性。

4 結(jié) 論

麻櫟橡子單寧脫除最佳工藝條件為液料比42∶1（mL/g）、乙醇體積分?jǐn)?shù)53%、脫除溫度65 ℃、超聲功率240 W，最高單寧脫除率為37.27%，較常規(guī)水浴得到了顯著提高，可應(yīng)用于實踐。體外抗氧化活性測定表明，麻櫟橡子單寧對DPPH自由基與·OH均有較強的清除能力，且單寧質(zhì)量濃度越高，對自由基的清除能力越強，可作為新型抗氧化劑開發(fā)。

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Extraction Optimization and Antioxidant Activity of Tannins from Quercus acutissima Acorns

XUE Wenyan, ZHANG Wenhui*, YANG Bin, YE Quanping
(Key Comprehensive Laboratory of Forestry in Shaanxi Province, Northwest A&F University, Yangling 712100, China)

To explore an efficient and feasible extraction procedure for the removal of tannins in Quercus acutissima acorns for comprehensive exploitation of Quercus acutissima acorns, the factors affecting the removal rate of tannins from Quercus acutissima acorns collected from Qiaoshan Mountains by ultrasonic-assisted extraction using ethanol as extraction solvent were firstly investigated by one-factor-at-a-time method and then the significant ones were selected and further optimized by response surface methodology. Besides, the antioxidant activity of the tannins extracted was determined by testing 1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl (DPPH) radical and hydroxyl radical (?OH) scavenging capacity. Our results demonstrated that liquid-to-solid ratio, ethanol concentration, extraction temperature and ultrasonic power were found to be the factors with a significant effect on the removal efficiency of tannins. The proposed model showed good fitness. An ethanol concentration of 53%, a liquid-to-solid ratio of 42:1 (mL/g), an extraction temperature of 65 ℃ and an ultrasonic power of 240 W were found to be optimal for maximum removal rate of tannins (37.27%). The antioxidant activity of the tannins extracted was positively linearly correlated with their concentration, and the scavenging percentages for DPPH and hydroxyl radical radicals were respectively 75.56% and 62.74% at a tannin concentration of 80 mg/L. Hence, the tannins can be used a new antioxidant.

Quercus acutissima acorn; tannin extraction; Box-Behnken experimental design; response surface methodology; antioxidant activity

10.7506/spkx1002-6630-201710040

TS234.1

A

1002-6630（2017）10-0242-09

薛文艷, 張文輝, 楊斌, 等. 麻櫟橡子單寧脫除工藝優(yōu)化及抗氧化性[J]. 食品科學(xué), 2017, 38(10): 242-250. DOI:10.7506/ spkx1002-6630-201710040. http://www.spkx.net.cn

XUE Wenyan, ZHANG Wenhui, YANG Bin, et al. Extraction optimization and antioxidant activity of tannins from Quercus acutissima aorns[J]. Food Science, 2017, 38(10): 242-250. (in Chinese with English abstract)

10.7506/spkx1002-6630-201710040. http://www.spkx.net.cn

2016-06-21

國家林業(yè)局全國森林經(jīng)營基礎(chǔ)研究項目（1692016-03）

薛文艷（1994—），女，碩士研究生，研究方向為麻櫟資源的開發(fā)利用。E-mail：1078945485@qq.com

*通信作者：張文輝（1954—），男，教授，博士，研究方向為天然林保護(hù)與利用。E-mail：839951676@qq.com