乙烯對(duì)α-淀粉酶活力、動(dòng)力學(xué)和微環(huán)境的影響

胡藝偉，加亞玲，張光先，張鳳秀,*

乙烯對(duì)α-淀粉酶活力、動(dòng)力學(xué)和微環(huán)境的影響

胡藝偉1，加亞玲1，張光先2,*，張鳳秀1,*

（1.西南大學(xué)化學(xué)化工學(xué)院，生物有機(jī)與藥物化學(xué)研究所，重慶 400715；2.西南大學(xué)紡織服裝學(xué)院，重慶 400715）

用乙烯利釋放出乙烯，研究其對(duì)α-淀粉酶活力、動(dòng)力學(xué)及微環(huán)境的影響。結(jié)果表明：與對(duì)照組比較，低濃度乙烯提高α-淀粉酶活力，而高濃度乙烯抑制α-淀粉酶活力；乙烯對(duì)α-淀粉酶的最適pH值（pH 6.0）幾乎沒(méi)有影響，但對(duì)其最適溫度改變，向高溫方向偏移5 ℃。用高濃度和低濃度的乙烯處理α-淀粉酶，探討乙烯對(duì)α-淀粉酶的反應(yīng)機(jī)理，其水解動(dòng)力學(xué)符合一級(jí)動(dòng)力學(xué)方程（Michaelis-Menten），其對(duì)應(yīng)的雙倒數(shù)曲線（Lineweaver-Burk）擬合度較好。紫外、熒光光譜分析表明：隨著乙烯濃度增加，α-淀粉酶紫外吸光度和熒光發(fā)射強(qiáng)度明顯增強(qiáng)。與對(duì)照組相比，紫外吸收光譜在波長(zhǎng)229 nm紅移1 nm。α-淀粉酶溶液的黏度隨著乙烯濃度的增加而下降，導(dǎo)致酶的微環(huán)境改變。目前，乙烯利已廣泛應(yīng)用于各種蔬菜、水果，本研究對(duì)乙烯的食品安全有非常重要的意義。

乙烯；影響；α-淀粉酶；活力；微環(huán)境；動(dòng)力學(xué)

α-淀粉酶（EC3.2.1.1）全稱為1,4-α-D-葡聚糖-4-葡聚糖水解酶[1]，廣泛存在于植物、動(dòng)物和微生物中[2]，如發(fā)芽的水稻、大麥和小麥等[3]。在人和動(dòng)物的唾液、胰腺中α-淀粉酶含量非常高。α-淀粉酶能切開(kāi)淀粉分子內(nèi)部的α-1,4-糖苷鍵，生成糊精和還原糖[4]。目前，工業(yè)生產(chǎn)上用微生物發(fā)酵法大規(guī)模生產(chǎn)α-淀粉酶[5]，它廣泛被應(yīng)用于紡織工業(yè)、制藥工業(yè)和食品工業(yè)，如食品加工、釀造、發(fā)酵工業(yè)等[6-7]。已有較多研究報(bào)道酶活性受到多種因素的影響，如pH值、溫度、金屬離子、溶劑、二氧化碳、甲醇、硫化氫等[8-12]。

乙烯利作為催熟劑被廣泛用于噴水果和蔬菜中，它所釋放的乙烯對(duì)作物催熟。在日本和中國(guó)，乙烯利對(duì)玉米最大殘留量被設(shè)定為0.5 mg/kg；在英格蘭和歐洲聯(lián)盟為0.05 mg/kg[13]。然而，中國(guó)在1～180 d的存儲(chǔ)中，乙烯殘留量在新鮮和干玉米中分別為0.43～0.657 mg/kg和0.657～0.609 mg/kg，這超出了乙烯利殘留量的最大限度[14]。此外，多余的乙烯利將破壞環(huán)境（土壤、水和空氣）和傷害非目標(biāo)生物（植物和動(dòng)物原料）[15]，例如急性毒性、慢性中毒和突變等[16]。

乙烯是最簡(jiǎn)單的烯烴，也是一種植物激素[17]。在植物的生長(zhǎng)和發(fā)育中起著非常重要的作用，如種子萌發(fā)、葉子衰老與脫落、木材形成、應(yīng)對(duì)環(huán)境壓力[18-20]等。目前，較多文獻(xiàn)報(bào)道乙烯在植物體內(nèi)合成并影響植物的生理和生化反應(yīng)[21]，這些研究表明乙烯參與植物一系列的生理生化反應(yīng)，如通過(guò)乙烯受體途徑調(diào)節(jié)植物的基因表達(dá)[22]，這是乙烯和乙烯受體的結(jié)合產(chǎn)生乙烯受體反應(yīng)從而提高或抑制植物體內(nèi)各種酶的活力[23]。因此，乙烯在植物體內(nèi)的生理生化調(diào)控機(jī)理已清晰，但對(duì)人體和動(dòng)物體內(nèi)各種酶的活力是否有影響還不清楚?；谶^(guò)量乙烯利在水果、蔬菜甚至作物的廣泛使用，過(guò)量乙烯利釋放出的乙烯對(duì)動(dòng)物和人類是否存在食品安全隱患的研究報(bào)道極少。筆者已報(bào)道乙烯對(duì)體外脂肪酶的水解活力的影響和機(jī)理[24]，但乙烯對(duì)體外其他酶活力的影響目前還鮮有相關(guān)報(bào)道。因此，本實(shí)驗(yàn)以廣泛存在的米曲霉α-淀粉酶為例，進(jìn)一步研究乙烯對(duì)體外α-淀粉酶活力、動(dòng)力學(xué)和微環(huán)境的影響，以期得到更多的實(shí)驗(yàn)證據(jù)。這對(duì)乙烯的食品安全有非常重要的意義。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

α-淀粉酶（來(lái)自于米曲霉，粉末，活力≥150 000 U/g）美國(guó)Sigma-Aldrich公司；乙烯利水劑（純度40%） 四川省精細(xì)化工研究設(shè)計(jì)院；可溶性淀粉（來(lái)自于土豆，分析純，相對(duì)分子質(zhì)量342.294 8）、碘化鉀（純度≥98.5%）、碘（純度≥99.8%） 成都市科龍化工試劑廠；檸檬酸（純度≥99.5%）、磷酸氫二鈉（Na2HPO4·12H2O，純度≥99.0%） 重慶東方試劑廠；鹽酸（純度36%～38%，1.18 g/mL） 重慶川東化工有限公司化學(xué)試劑廠。

1.2 儀器與設(shè)備

TU-1810-PC紫外分光光度計(jì) 北京浦西通用儀器有限公司；F-4600-FL熒光分光光度計(jì) 日本日立公司；烏氏黏度計(jì) 北京天創(chuàng)尚邦儀器設(shè)備有限公司；6890氣相色譜儀 美國(guó)安捷倫科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1 乙烯的制備和濃度的計(jì)算

稱取5.0 g氫氧化鈉轉(zhuǎn)入盛有5 mL蒸餾水的250 mL三頸燒瓶中。加入10 mL的乙烯利于恒壓滴液漏斗中，以30 drop/min的速率滴加到三頸燒瓶中。用排水吸氣法收集乙烯，在－20 ℃條件下冷凍干燥[23]。

精確移取5 mL蒸餾水到盛有2 mL磷酸緩沖溶液（pH 6.0）的60 mL玻璃瓶中，用橡膠塞密封。用常量或微量注射器注入適當(dāng)體積的乙烯，恒溫水浴振蕩加熱一定時(shí)間以達(dá)氣-液平衡，冷卻至室溫。用氣相色譜測(cè)定乙烯濃度。色譜條件：氫離子火焰檢測(cè)器，cyclodex-β毛細(xì)管柱（30 m×0.25 mm，0.25 μm），載氣為N2（純度99.999%），進(jìn)樣口溫度150 ℃，柱溫10～80 ℃，檢測(cè)器溫度200 ℃。擬合乙烯體積計(jì)算公式（1）如下：

y=25.865x+3.457 （1）

式中：x為注射乙烯的體積/mL；y為溶液中乙烯濃度/（μmol/L）。

1.3.2 α-淀粉酶活力計(jì)算

按照文獻(xiàn)[6,25]方法測(cè)定α-淀粉酶活力。量取5 mL一定濃度的可溶性淀粉溶液和2 mL一定pH值磷酸鹽緩沖溶液到60 mL的帶橡膠塞玻璃瓶中，混合均勻。在恒溫水浴鍋中加熱5 min后，精確移取0.5 mL的一定質(zhì)量濃度的α-淀粉酶，用橡膠塞密封。然后將適當(dāng)濃度的乙烯氣體注入到玻璃瓶中，對(duì)照組不加乙烯，搖勻后放入恒溫水浴鍋中反應(yīng)5 min。反應(yīng)結(jié)束后，移取1 mL混合溶液于盛有5 mL 88 mg/L的碘和0.5 mL 0.1 g/L的稀鹽酸溶液的試管中終止酶反應(yīng)，搖勻。立即在660 nm波長(zhǎng)處測(cè)定該溶液的吸光度，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3 次。酶活力定義：α-淀粉酶1 min水解1 mg淀粉的量為1 U。α-淀粉酶活力按公式（2）計(jì)算：

式中：M0為初始的淀粉質(zhì)量/mg；M1為殘留淀粉質(zhì)量/mg；M2為酶質(zhì)量/g；t為反應(yīng)時(shí)間/min。

1.3.3 α-淀粉酶溶液的黏度、紫外和熒光光譜測(cè)定

精確移取10 mL質(zhì)量濃度1 mg/mL、pH 6.0的α-淀粉酶溶液，放入60 mL帶橡膠塞的玻璃中。然后加入不同濃度的乙烯，用橡膠塞塞住。對(duì)照組不加乙烯。用手不停地?fù)u動(dòng)，讓乙烯充分溶解到α-淀粉酶溶液中。在40 ℃恒溫水浴中加熱30 min，冷卻到室溫（24 ℃）以達(dá)到氣-液平衡。在24 ℃測(cè)定其紫外、熒光光譜和黏度，在190～400 nm的波長(zhǎng)范圍內(nèi)測(cè)定紫外光譜。熒光光譜在激發(fā)波長(zhǎng)279 nm和發(fā)射波長(zhǎng)270～400 nm條件下測(cè)定，激發(fā)和發(fā)射寬度為5 nm。實(shí)驗(yàn)均重復(fù)3 次。

以去離子水作為對(duì)照，用烏氏黏度計(jì)來(lái)測(cè)量黏度。α-淀粉酶黏度的計(jì)算如公式（3）所示[26]：

式中：t1和t2分別為對(duì)照組和乙烯處理組液體流經(jīng)時(shí)間/s；η為去離子水在24 ℃條件下的黏度系數(shù)，0.914 2 mPa·s；ρ1為去離子水的密度/（g/cm3）；ρ2為酶溶液的密度/（g/cm3）。

2 結(jié)果與分析

2.1 乙烯濃度對(duì)α-淀粉酶活力的影響

在磷酸緩沖溶液pH 6.0、淀粉濃度58.429 mmol/L、α-淀粉酶質(zhì)量濃度0.2 mg/mL和55 ℃條件下，實(shí)驗(yàn)組加入不同體積乙烯，對(duì)照組不加乙烯。測(cè)定不同濃度乙烯對(duì)α-淀粉酶催化水解活力的影響，結(jié)果見(jiàn)圖1。

圖 1 乙烯濃度對(duì)α-淀粉酶活力的影響Fig. 1 Effects of different ethylene concentrations on α-amylase activity

由圖1可見(jiàn)，與對(duì)照組相比，乙烯濃度在6.04～29.32 μmol/L的范圍內(nèi)，α-淀粉酶活力隨乙烯濃度的增加而增加，然后隨著乙烯濃度的增加而降低。當(dāng)乙烯濃度為29.32 μmol/L，α-淀粉酶活力達(dá)到最大值，該結(jié)果與乙烯在植物體中的生理效應(yīng)一致[13]，即較低乙烯濃度促進(jìn)α-淀粉酶活力，而較高濃度抑制α-淀粉酶活力。這可能是在反應(yīng)條件下，酶分子熱運(yùn)動(dòng)導(dǎo)致其構(gòu)象發(fā)生漲落[27]，結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單的疏水乙烯小分子容易滲入疏水性的α-淀粉酶內(nèi)部，直接影響α-淀粉酶分子的微觀結(jié)構(gòu)，因而調(diào)控α-淀粉酶活力。

2.2 不同反應(yīng)時(shí)間的α-淀粉酶活力

在淀粉濃度58.429 mmol/L、α-淀粉酶質(zhì)量濃度0.2 mg/mL、pH 6.0和55 ℃條件下，探討反應(yīng)時(shí)間對(duì)乙烯濃度為29.32 μmol/L的實(shí)驗(yàn)組和未加乙烯對(duì)照組的α-淀粉酶活力的影響，結(jié)果見(jiàn)圖2。

由圖2可以看出，實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組α-淀粉酶活力均隨著反應(yīng)時(shí)間的升高而下降，并在反應(yīng)時(shí)間超過(guò)25 min以后逐漸達(dá)到平衡。但對(duì)于同一反應(yīng)時(shí)間，實(shí)驗(yàn)組的α-淀粉酶活力比對(duì)照組高。結(jié)果表明，乙烯提高了α-淀粉酶活力?？赡艿脑蚴?，乙烯溶解到反應(yīng)溶液中，改變了酶的微環(huán)境，進(jìn)一步改變了酶的空間構(gòu)象[24,27]。

胰島素瘤:是發(fā)生在胰腺的最常見(jiàn)的功能性腫瘤,因胰島β細(xì)胞瘤或β細(xì)胞增生造成胰島素分泌過(guò)多,引起低血糖癥,常有典型的Whipple三聯(lián)征表現(xiàn),即低血糖癥狀、昏迷及精神神經(jīng)癥狀。和甲狀旁腺腺瘤一樣,一經(jīng)確診,需手術(shù)治療。

圖 2 乙烯對(duì)不同反應(yīng)時(shí)間α-淀粉酶活力的影響Fig. 2 Effects of ethylene on α-amylase reaction rate

2.3 乙烯對(duì)α-淀粉酶最適pH值的影響

在不同pH值的磷酸緩沖液中，實(shí)驗(yàn)組加入乙烯濃度為29.32 μmol/L，對(duì)照組不加乙烯。在淀粉濃度58.429 mmol/L、α-淀粉酶質(zhì)量濃度0.2 mg/mL和55 ℃恒溫水浴中條件下，測(cè)定不同pH值條件下α-淀粉酶催化水解淀粉的活力，結(jié)果見(jiàn)圖3。

圖 3 乙烯對(duì)α-淀粉酶最適pH值的影響Fig. 3 Effects of ethylene on optimum pH for α-amylase

如圖3所示，實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組在pH 3～9的范圍內(nèi)，α-淀粉酶活力的變化呈“鐘形”，且最適pH值均為6。但對(duì)于對(duì)照組，當(dāng)pH值小于4或大于7，則α-淀粉酶活力改變更為明顯。對(duì)于實(shí)驗(yàn)組，在pH 3～6范圍內(nèi)α-淀粉酶活力逐漸增加，而在pH 7～9范圍內(nèi)其活性逐漸降低。在同一pH值條件下，實(shí)驗(yàn)組的活性總是高于對(duì)照組，尤其是在pH 3，實(shí)驗(yàn)組α-淀粉酶活力比對(duì)照組提高了約5 倍。在pH 3～7范圍內(nèi)實(shí)驗(yàn)組均保持了較高的活性，這表明乙烯沒(méi)有改變酶的最佳pH值，意味著乙烯沒(méi)有影響α-淀粉酶的二級(jí)或三級(jí)結(jié)構(gòu)，而是使酶的四級(jí)結(jié)構(gòu)有一定程度的變化。在乙烯作用下α-淀粉酶的熱穩(wěn)定性增加，且保留或增加了α-淀粉酶的反應(yīng)活性位點(diǎn)[27]。

2.4 乙烯對(duì)α-淀粉酶最適溫度的影響

在磷酸緩沖液pH 6.0、淀粉濃度58.429 mmol/L、α-淀粉酶質(zhì)量濃度0.2 mg/mL和不同溫度條件下，實(shí)驗(yàn)組加入濃度為29.32 μmol/L乙烯，對(duì)照組無(wú)乙烯，酶催化活力隨溫度變化的影響規(guī)律見(jiàn)圖4。

圖 4 乙烯對(duì)α-淀粉酶最適溫度的影響Fig. 4 Effects of ethylene on optimum temperature for α-amylase

如圖4所示，在相同溫度條件下實(shí)驗(yàn)組的α-淀粉酶活力比對(duì)照組高。在25～40 ℃，實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組α-淀粉酶活力隨溫度的升高而逐漸增加。當(dāng)實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組的最適溫度分別為60 ℃和55 ℃時(shí)，α-淀粉酶活力最高。與對(duì)照組相比，實(shí)驗(yàn)組最適溫度向高溫方向偏移了5 ℃。其可能原因是乙烯溶解在酶溶液中明顯改變了酶溶液的黏度和α-淀粉酶大分子的構(gòu)象。隨著溫度繼續(xù)升高，兩組的α-淀粉酶活力都降低，但是實(shí)驗(yàn)組下降幅度比對(duì)照組慢。這一結(jié)果進(jìn)一步證實(shí)乙烯有助于增強(qiáng)α-淀粉酶大分子的熱穩(wěn)定性，使其在高溫條件下有較好的活性。

2.5 乙烯對(duì)α-淀粉酶催化可溶性淀粉溶液水解動(dòng)力學(xué)的影響

圖 5 反應(yīng)速率與底物濃度的Miehaelis-Menten曲線（A）及Lineweaver-Burk雙倒數(shù)擬合曲線（B）Fig. 5 Michaelis-Menten curves reaction velocity against substrate concentration (A) and Lineweaver-Burk double-reciprocal curves (B)

表 1 米氏方程和動(dòng)力學(xué)參數(shù)Table 1 Michaelis-Menten equations and kinetics parameters

從表1可看出，與對(duì)照組相比，用乙烯濃度為2 9.32 μmol/L處理的實(shí)驗(yàn)組vmax和Km值均大于比對(duì)照組，并且也高于262.11 μmol/L乙烯濃度處理的實(shí)驗(yàn)組，但262.11 μmol/L乙烯濃度處理的vmax和Km值低于對(duì)照組，這說(shuō)明高濃度的乙烯對(duì)α-淀粉酶活力有抑制作用，低濃度的乙烯對(duì)酶活力有促進(jìn)作用，所有的R2值擬合很好，分別為0.999 6、0.999 8和0.999 4。此外，在底物濃度和反應(yīng)速率的對(duì)應(yīng)雙倒數(shù)曲線，如圖5B所示。其擬合方程如下：

從圖5B和擬合方程（4）、（6）可以看出，對(duì)照組和262.11 μmol/L乙烯處理的實(shí)驗(yàn)組Lineweaver-Burk雙倒數(shù)擬合曲線的斜率相近，但它們的截距不同，因此262.11 μmol/L乙烯處理的實(shí)驗(yàn)組酶反應(yīng)機(jī)理屬于反競(jìng)爭(zhēng)性抑制[28]。而方程（4）和（5）中，對(duì)照組和乙烯濃度為29.32 μmol/L的實(shí)驗(yàn)組Lineweaver-Burk雙倒數(shù)擬合曲線的斜率和截距均相差較大，因此乙烯濃度為29.32 μmol/L處理的酶反應(yīng)機(jī)理屬于簡(jiǎn)單的線性非競(jìng)爭(zhēng)性抑制[28]。表1中Km值等于反應(yīng)初速率達(dá)到最大反應(yīng)速率一半時(shí)的底物濃度，即酶活性部位數(shù)的一半為底物占據(jù)時(shí)所需的底物濃度[27]。表1的Km數(shù)據(jù)表明：低濃度乙烯處理的實(shí)驗(yàn)組酶的活性位點(diǎn)數(shù)比對(duì)照組多；而高濃度乙烯處理的實(shí)驗(yàn)組活性位點(diǎn)數(shù)低于對(duì)照組。這表明低濃度的乙烯分子被吸附到酶大分子的表面和疏水內(nèi)部，使酶分子的柔性增加，導(dǎo)致活性位點(diǎn)數(shù)大于對(duì)照，因此有激活作用。而高濃度的乙烯分子占據(jù)了較多的酶活性位點(diǎn)，導(dǎo)致較大程度的破壞了酶原有的構(gòu)象，因此起抑制作用[27-28]。這兩種不同的水解動(dòng)力學(xué)機(jī)制表明乙烯在反應(yīng)體系中可能有兩種途徑如圖6所示。一種途徑是乙烯先與α-淀粉酶結(jié)合形成反應(yīng)性中間體，然后該中間體與底物結(jié)合發(fā)生水解反應(yīng)。另一種途徑是，α-淀粉酶和底物的結(jié)合形成一種中間體，乙烯再與這種中間體結(jié)合成復(fù)合中間體水解淀粉。在水解反應(yīng)中這兩個(gè)途徑可能同時(shí)存在[27]。

圖 6 乙烯酶催化反應(yīng)機(jī)理Fig. 6 Reaction mechanism of α-amylase hydrolysis in the presence of ethylene

2.6 乙烯對(duì)α-淀粉酶黏度的影響

為了證實(shí)乙烯對(duì)α-淀粉酶微環(huán)境的影響，在24 ℃（室溫）測(cè)定不同乙烯濃度條件下的α-淀粉酶溶液黏度，結(jié)果如圖7所示。

圖 7 不同濃度乙烯對(duì)α-淀粉酶溶液黏度的影響Fig. 7 Effects of ethylene concentration on viscosity of α-amylase solution

由圖7可見(jiàn)，經(jīng)乙烯處理后的α-淀粉酶溶液的黏度低于對(duì)照組，并且隨著乙烯的濃度的增加而降低，然后逐漸達(dá)到一個(gè)平衡。這個(gè)結(jié)果表明，乙烯濃度對(duì)α-淀粉酶的微環(huán)境有顯著影響，可能是由于乙烯部分地溶解在酶溶液中，提高了α-淀粉酶微環(huán)境的疏水性和酶溶液的流動(dòng)性，從而導(dǎo)致α-淀粉酶分子的伸展性和柔韌性增加[27]。

2.7 乙烯對(duì)α-淀粉酶溶液紫外吸收光譜的影響

在α-淀粉酶質(zhì)量濃度1.0 mg/mL、24 ℃和磷酸緩沖溶液pH 6.0條件下，不同濃度乙烯對(duì)紫外線吸收的影響結(jié)果如圖8所示。

從圖8可知，實(shí)驗(yàn)組的峰強(qiáng)度隨著乙烯濃度的增加而增加，并且高于對(duì)照組。對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組均在約229 nm和276 nm波長(zhǎng)處有兩個(gè)明顯的吸收峰。但對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組強(qiáng)的吸收峰分別出現(xiàn)在229 nm和230 nm，實(shí)驗(yàn)組吸收波長(zhǎng)紅移了1 nm，這可能是CO肽鍵的n→P3電子躍遷所致。此外，在276 nm波長(zhǎng)處出現(xiàn)了弱吸收峰，這主要?dú)w功于α-淀粉酶中的色氨酸和酪氨酸芳環(huán)雜原子的n→P3電子躍遷[29]。可能原因是乙烯增加了酶溶液的疏水性，使α-淀粉酶內(nèi)部的色氨酸和酪氨酸基團(tuán)被暴露在酶分子表面上。

圖 8 乙烯對(duì)α-淀粉酶溶液紫外光譜的影響Fig. 8 Effects of ethylene concentration on the UV absorption spectrum of α-amylase

2.8 乙烯對(duì)α-淀粉酶溶液熒光光譜的影響

圖 9 乙烯對(duì)α-淀粉酶溶液熒光光譜的影響Fig. 9 Effect of ethylene concentrations on the fluorescence spectrum of α-amylase solution

如圖9所示，在283 nm和342 nm波長(zhǎng)處α-淀粉酶溶液的峰強(qiáng)度隨著乙烯濃度的增加而增加，且均高于對(duì)照組。在342 nm波長(zhǎng)處強(qiáng)發(fā)射峰是色氨酸殘基引發(fā)所致[30]。這表明乙烯改變了酶的微環(huán)境，使α-淀粉酶的構(gòu)象從緊湊狀態(tài)向松弛狀態(tài)改變，導(dǎo)致α-淀粉酶分子內(nèi)的芳香族氨基酸殘基很容易暴露到的表面上，增加了酶分子的柔韌性，從而增強(qiáng)了其熒光強(qiáng)度。

3 結(jié) 論

乙烯可以直接在體外影響α-淀粉酶活力，低濃度乙烯提高α-淀粉酶催化活力，高濃度乙烯降低α-淀粉酶催化活力。當(dāng)乙烯濃度為29.32 μmol/L時(shí)，α-淀粉酶活力達(dá)到最大值。相比對(duì)照組，乙烯對(duì)α-淀粉酶的最適pH值（pH 6.0）無(wú)影響，而α-淀粉酶的最適溫度上升5℃。隨著α-淀粉酶質(zhì)量濃度的增加，反應(yīng)速率增加；且實(shí)驗(yàn)組的反應(yīng)速率比對(duì)照組快。有、無(wú)乙烯存在條件下，α-淀粉酶水解動(dòng)力學(xué)均符合一級(jí)米氏動(dòng)力學(xué)方程；并且其雙倒數(shù)曲線很好擬合。29.32 μmol/L乙烯處理的實(shí)驗(yàn)組酶反應(yīng)機(jī)理屬于簡(jiǎn)單的線性非競(jìng)爭(zhēng)性抑制，262.11 μmol/L乙烯處理的實(shí)驗(yàn)組酶反應(yīng)機(jī)理屬于反競(jìng)爭(zhēng)性抑制。加入乙烯后，α-淀粉酶溶液的黏度明顯下降，α-淀粉酶溶液的紫外吸收光譜和熒光發(fā)射光譜增強(qiáng)，表明α-淀粉酶的微環(huán)境和構(gòu)象受到乙烯的直接影響。

[1] ROMAN B, ULRIKE W, VOLKER H, et al. Stability and catalytic activity of α-amylase from Barley Malt at different pressuretemperature conditions[J]. Biotechnology and Bioengineering, 2007, 97(1): 1-11. DOI:10.1002/bit.

[2] 羅志剛, 楊景峰, 羅發(fā)興. α-淀粉酶的性質(zhì)及應(yīng)用[J].食品研究與開(kāi)發(fā), 2007, 28(8): 163-166. DOI:10.3969/ j.issn.1005-6521.2007.08.053.

[3] 李珊. 啤酒大麥制麥過(guò)程中淀粉酶系及其酶活力的研究[D]. 青島:中國(guó)海洋大學(xué), 2009. DOI:10.7666/d.y1502804.

[4] 徐穎. 高產(chǎn)α-淀粉酶生產(chǎn)菌的篩選鑒定及其酶學(xué)性質(zhì)研究[D].成都: 四川大學(xué), 2007. DOI:10.7666/d.y1212120.

[5] 張永帥, 孫俊良, 梁新紅, 等. 測(cè)定枯草芽孢桿菌生產(chǎn)中溫α-淀粉酶方法的研究[J]. 農(nóng)產(chǎn)品加工, 2014(8): 1671-9646. DOI:10.3969/ jissn.1671-9646(X).2014.08.001.

[6] GUPTA R, GIGRAS P, MOHAPATRO H, et al. Microbial α-amylases: a biotechnological perspective[J]. Process Bioch emistry, 2003, 38(11): 1599-1616. DOI:10.1016/S0032-9592(03)00053-0.

[7] LILI K. α-Amylases of medical and industrial importance[J]. Journal of Molecular Structure: THEOCHEM, 2003, 666/667: 487-498. DOI:10.1016/j.theochem.2003.08.073.

[8] CHI Z X, LIU R T, ZHANG H. Noncovalent interaction of oxytetracycline with the enzyme Trypsin[J]. Biomacromolecules, 2010, 11(9): 2454-2459. DOI:10.1021/bm100633h.

[9] BUTR C I, SFORZA S, WIERENGA P A, et al. Determination of the influence of the pH of hydrolysis on enzyme selectivity of Bacillus licheniformis protease towards whey protein isolate[J]. International Dairy Journal, 2015, 44: 44-53. DOI:10.1016/j.idairyj.2014.12.007.

[10] ZHAI Z H, YANG T, ZHANG B Y, et al. Effects of metal ions on the catalytic degradation of dicofol by cellulose[J]. Journal of Environmental Science, 2015, 33: 163-168. DOI:10.1016/ j.jes.2014.12.023.

[11] HASHEM M Y, ISMAIL I I, LUTFALLAH A F, et al. Effects of carbon dioxide on Sitotroga cerealella (Olivier) larvae and their enzyme activity[J]. Journal of Stored Products Research, 2014, 59: 17-23. DOI:10.1016/j.jspr.2014.04.002.

[12] POOR N Z, BANIASADI L, OMIDI M, et al. An inhibitory enzym e electrode for hydrogen sulfide detection[J]. Enzyme and Microbial Technology, 2014, 63: 7-12. DOI:10.1016/j.enzmictec.2014.04.016.

[13] 楊治峰. 乙烯利對(duì)雄性小鼠生殖毒性和免疫毒性作用的研究[D].濟(jì)南: 濟(jì)南大學(xué), 2014.

[14] DONG J N, MA Y Q, LIU F M, et al. Dissipation and residue of ethephon in maize field[J]. Journal of Integrative Agriculture, 2015, 14(1): 106-113. DOI:10.1016/S2095-3119(14)60768-1.

[15] ROYER A, LAPORTE F, BOUCHONNET S, et al. Determination of ethephon residues in water by gas chromatography with cubic mass spectrometry after ion-exchange purification and derivatisationwith N-(tert-butyldimethylsilyl)-N-methyltrifluoroacetamide[J]. Journal of Chr omatography A, 2006, 1108: 129-135. DOI:10.1016/ j.chroma.2005.12.078.

[16] 于文輝, 高永泉, 趙文, 等. 乙烯利體內(nèi)致突變性研究[J]. 農(nóng)藥學(xué)學(xué)報(bào), 2006, 8(2): 184-186. DOI:10.3321/j.issn:1008-7303.2006.02.019.

[17] ALBUNIA A R, MINUCCI T, GUERRA G. Ethylene removal by sorption from polymeric crystalline frameworks[J]. Journal of Mater Chemistry, 2008, 18: 1046-1050. DOI:10.1039/b715144f.

[18] GERGOFF G, CHAVES A, BARTOLI C G. Ethylene regulates ascorbic acid content during dark-induced leaf senescence[J]. Plant Science, 2010, 178: 207-212. DOI:10.1016/j.plantsci.2009.12.003.

[19] ZHANG Q, HUANG J Q, ZHAO M Q, et al. Radial growth of vertically aligned carbon nanotube arrays from ethylene on ceramic spheres[J]. Carbon, 2008, 46: 1152-1158. DOI:10.1016/ j.carbon.2008.04.017.

[20] GHANTAS, DATTA R, BHATTACHARYYA D, et al. Multistep involvement of glutathione with salicylic acid and ethylene to combat environmental stress[J]. Journal of Plant Physiological, 2014, 171: 940-950. DOI:10.1016/j.jplph.2014.03.002.

[21] ARCHAMBAULT D J, LI X M, FOSTER K R, et al. A screening test for the determination of ethylene sensitivity[J]. Environmental Monitoring and Assessment, 2006, 115: 509-530. DOI:10.1007/ s10661-006-7227-z.

[22] JOO S, KIM W T. A gaseous plant hormone ethylene: the signaling pathway[J]. Journal of Plant Biological, 2007, 50(2): 109-116. DOI:10.1007/BF03030618.

[23] ZAREMBINSKI T I, THEOLOGIS A. Ethylene biosynthesis and action: a case of conservation[J]. Plant Molecular Biological, 1994, 26: 1579-1597. DOI:10.1007/BF00016491.

[24] 張鳳秀, 張光先, 魏世強(qiáng). 乙烯對(duì)脂肪酶活力的直接作用及其機(jī)理初探[J]. 化學(xué)學(xué)報(bào), 2008, 66(6): 639-646. D OI:10.3321/ j.issn:0567-7351.2008.06.009.

[25] 史永昶, 姜涌明, 樊飚, 等. 蛋白酶對(duì)解淀粉芽抱桿菌α-淀粉酶活力的影響[J]. 微生物學(xué)通報(bào), 1995, 22(1): 23-24.

[26] 陳德萬(wàn), 李光林. 普通物理學(xué)實(shí)驗(yàn)[M]. 北京: 中國(guó)農(nóng)業(yè)出版社, 2004: 33.

[27] 鄒承魯, 周筠梅, 周海夢(mèng). 酶活性部位的柔性[M]. 濟(jì)南: 山東科技出版社, 2004: 32-85.

[28] 袁勤生. 應(yīng)用酶學(xué)[M]. 上海: 華東理工大學(xué)出版社, 1994: 109-110.

[29] 周向軍, 高義霞, 鄭曉惠, 等. 高烏甲素對(duì)α-淀粉酶及其光譜性質(zhì)的影響[J]. 時(shí)珍國(guó)醫(yī)國(guó)藥, 2013, 24(3): 550-551. DOI:10.3969/ j.issn.1008-0805.2013.03.015.

Effect of Ethylene on the Activity, Kinetics and Microenvironment of α-Amylase in Vitro

HU Yiwei1, JIA Yaling1, ZHANG Guangxian2,*, ZHANG Fengxiu1,*
(1. Institute ofBioorganic and Medicinal Chemistry, College of Chemistry and Chemical Engineering, Southwest University, Chongqing 400715, China; 2. College of Textiles and Garments, Southwest University, Chongqing 400715, China)

The effects of ethylene on α-a mylase activity, kinetics and micr oenvironment were investigated. Compared with the controlgroup, α-amylase activity was enhanced by ethylene at low concentration but inhibited at high concentration. However, ethylene hardly affected the optimum pH (6.0) for α-amylase, whereas it resulted in an increase in the optimum temperature by 5 ℃. The hydrolysis kinetics of α-amylase in the presence of low and high concentrations of ethylene followed a first-order kinetic equation (Michaelis-Menten), and the Lineweaver-Burk double-reciprocal curves were well fitted. The mechanism of action of ethylene in this respect was investigated. The ultraviolet (UV) absorption and fluorescence emission intensity of α-amylase were obviously enhanced with increasing ethylene concentration, and the absorption peak of α-amylase at 229 nm showed a red shift by 1 nm. After ethylene was added, the viscos ity of α-amylase solution declined obviously compared with the control group, leading to a change in the microenvironment of α-amylase. This research is of great significance for supporting the safe application of ethylene in fruits and vegetables.

ethylene; effect; α-amylase; activity; microenvironment; kinetics

楊娟. 胰α-淀粉酶的部分性質(zhì)研究[D]. 成都: 四川大學(xué), 2007.

10.7666/d.y1212651.

DOI:10.7506/spkx1002-6630-201710024

Q5-33

A

1002-6630（2017）10-0143-06

胡藝偉, 加亞玲, 張光先, 等. 乙烯對(duì)α-淀粉酶活力、動(dòng)力學(xué)和微環(huán)境的影響[J]. 食品科學(xué), 2017, 38(10): 143-148.

DOI:10.7506/spkx1002-6630-201710024. http://www.spkx.net.cn

HU Yiwei, JIA Yaling, ZHANG Guangxian, et al. Effect of ethylene on the activity, kinetics and microenvironment of α-amylase in vitro[J]. Food Science, 2017, 38(10): 143-148. (in Chinese with English abstract) DOI:10.7506/spkx1002-6630-201710024. http://www.spkx.net.cn

2016-05-27

胡藝偉（1988—），女，碩士研究生，研究方向?yàn)樯镉袡C(jī)化學(xué)。E-mail：805756023@qq.com

*通信作者：張光先（1965—），男，教授，博士，研究方向?yàn)閼?yīng)用化學(xué)。E-mail：zgxzfx@swu.com.cn

張鳳秀（1965—），女，副教授，博士，研究方向?yàn)樯镉袡C(jī)催化。E-mail：zhangfx656472@sina.com.cn