殼聚糖-埃洛石納米管微球的制備及 其對(duì)木瓜蛋白酶的固定化

丁利君，瞿葉輝，劉 丹

（廣東工業(yè)大學(xué)輕工化工學(xué)院，廣東 廣州 510006）

殼聚糖-埃洛石納米管微球的制備及 其對(duì)木瓜蛋白酶的固定化

丁利君，瞿葉輝，劉 丹

（廣東工業(yè)大學(xué)輕工化工學(xué)院，廣東 廣州 510006）

運(yùn)用交聯(lián)-吸附法制備殼聚糖-埃洛石納米管（chitosan-halloysites nanotube，CTS-HNTs）復(fù)合微球固定木瓜蛋白酶，并通過(guò)傅里葉紅外光譜、掃描電子顯微鏡、熒光標(biāo)記等方法進(jìn)行表征。2% CTS+1% HNTs制備的微球?qū)δ竟系鞍酌傅墓潭孔罡摺９潭ɑ瘲l件為木瓜蛋白酶質(zhì)量濃度1 mg/mL、固定化時(shí)間10 h。固定化木瓜蛋白酶最適pH 6.8（游離酶pH 7.2）、最適溫度60 ℃（游離酶50 ℃），保存30 d該酶相對(duì)活性為62%（游離酶27%），使用4 次后，木瓜蛋白酶的相對(duì)活性仍然保留26. 26%。 CTS-HNTs微球固定化木瓜蛋白酶耐貯存，操作穩(wěn)定性強(qiáng)，可以提高酶的利用率，降低酶解的成本，提高生產(chǎn)效率。

殼聚糖-埃洛石；微球；固定化；木瓜蛋白酶

酶的固定化是用固體材料將酶束縛或限制于一定區(qū)域內(nèi)，仍具有特定的催化反應(yīng)、并可回收及重復(fù)使用的一類技術(shù)[1]，易于與底物、產(chǎn)物分離，便于后續(xù)的分離和純化，增加產(chǎn)物的產(chǎn)率，節(jié)約成本，適于產(chǎn)業(yè)化、連續(xù)化、自動(dòng)化生產(chǎn)[2]。酶的固定化方法有物理方法（主要包括包埋法[3-4]、吸附法[5-7]）、化學(xué)方法（主要有交聯(lián)法[8-9]和共價(jià)鍵法[10-13]）。固定化載體的選擇是酶固定化技術(shù)的關(guān)鍵因素之一，要求載體不溶于水，有大的比表面積和多孔結(jié)構(gòu)，帶有與酶發(fā)生反應(yīng)的官能團(tuán)，機(jī)械剛性和穩(wěn)定性好。天然高分子載體最大的特點(diǎn)是無(wú)毒性，傳質(zhì)性能好，近年研究比較熱門(mén)的天然高分子載體如殼聚糖（chitosan，CTS）、海藻酸鈉和纖維等，在厭氧條件下易被微生物所分解，使用壽命較短，在一定程度上限制其應(yīng)用[14]；常用的合成高分子載體為聚丙烯、聚丙烯酰胺、聚丙烯腈等[14]雖能經(jīng)受微生物的作用，但耐熱性較差；無(wú)機(jī)材料有較好的剛性和穩(wěn)定性，而酶與無(wú)機(jī)載體之間的離子相互作用對(duì)酶活的影響比較大[15]。將有機(jī)材料和無(wú)機(jī)材料組成新的復(fù)合載體是近年固定化酶載體研究的熱點(diǎn)之一[16-17]。CTS和埃洛石納米管（halloysite nanotube，HNTs）由于各自材料的優(yōu)越性，引起了越來(lái)越多的關(guān)注與研究。

CTS即聚葡萄糖胺（1-4）-2-氨基-β-D葡萄糖，只溶于稀鹽酸、硝酸等無(wú)機(jī)酸和部分有機(jī)酸，具有良好的相容性、安全性和微生物降解性[18]。HNTs是天然存在的1∶1二八面體高嶺土系礦物，是近年來(lái)材料相關(guān)領(lǐng)域研究的熱點(diǎn)[19]，HNTs具有納米中空管狀結(jié)構(gòu)，比表面積、吸附性高，易負(fù)載各種微粒包括酶[20-23]。CTS-HNTs微球是通過(guò)CTS包埋HNTs而形成，具有較多孔狀及球狀結(jié)構(gòu)的微球，增加負(fù)載酶的量，提高酶 活的保存性。Zhai Rui等[24]以CTS和HNTs為原料制備混合納米管固定辣 根過(guò)氧化 物酶，有效提高去除廢水中苯酚的效率。

木瓜蛋白酶活性高、熱穩(wěn)定性強(qiáng)，被廣泛應(yīng)用于食品、日化等多個(gè)行業(yè)。但游離的木瓜蛋白酶重復(fù)使用受限，熱穩(wěn)定性、酸堿穩(wěn)定性和貯存穩(wěn)定性較差。有研究表明，與游離酶相比，通過(guò) 不同載體固定的木瓜蛋白酶的最適反應(yīng)pH值、最適溫度、酸堿穩(wěn)定性、熱穩(wěn)定性和貯存穩(wěn)定性等方面都得到很大的改善。何平等[25]用海藻酸鈉和CTS固定化木瓜蛋白酶，并用于催化合成Trp-Phe-NH2，產(chǎn)率達(dá)27.8%。本研究通過(guò)對(duì)CTS和HNTs的改性，以包埋的方式，采用中和沉淀法，制備CTS-HNTs微球；以戊二醛為交聯(lián)劑，通過(guò)交聯(lián)-吸附，固定木瓜 蛋白酶，并對(duì)其進(jìn)行表征分析，以提高木瓜蛋白酶的利用率。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

CTS 浙江金殼生物化學(xué)有限公司；HNTs 遠(yuǎn)鑫納米科技公司；L-酪氨酸 阿拉丁試劑公司；木瓜蛋白酶（800 U/mg） 廣州市華琪生物科技有限公司；酪蛋白、L-半胱氨酸 美國(guó)Sigma公司；磷酸二氫鈉、乙二胺四乙酸（ethylenediaminetetraacetic acid，EDTA）等均為國(guó)產(chǎn)分析純。

激活劑溶液為半胱氨酸20 mmol/L、EDTA 1 mmol/L的混合液，用0.1 mol/L磷酸緩沖液配制（pH 7.2）。

1.2 儀器與設(shè)備

JY92-IIDN超聲波細(xì)胞粉碎機(jī) 寧波新芝生物科技股份有限公司；UV-1200型紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)上海美普達(dá)儀器有限公司；Nicolet 6700型傅里葉紅外光譜儀 美國(guó)賽默飛世爾科技公司；S-3400N型掃描電子顯微鏡 日本日立公司；STA 409 PC型熱 綜合分析儀德國(guó)Netzsch公司。

1.3 方法

1.3.1 CTS-HNTs微球的制備

稱取一定量HNTs溶于蒸餾水中，超聲處理（功率300 W，空占比1∶1）15 min，制備均勻懸浮液；稱取一定量的CTS，加入2%的醋酸溶液，磁力攪拌4 h，除氣泡，制備透明CTS溶液。二者分別以不同比例用量（1% CTS+1% HNTs、2% CTS+2% HNTs、1% CTS+ 2% HNTs、2% CTS+1% HNTs、2% CTS、1% CTS）制備CTS-HNTs微球。將HNTs溶液邊攪拌邊緩慢加入相等體積的CTS溶液中，持續(xù)攪拌4 h后，用裝有5號(hào)針頭的注射器將CTS-HNTs溶液逐滴滴到凝結(jié)液（2 mol/L NaOH溶液）中，制備CTS-HNTs微球，然后用蒸餾水浸泡，室溫放置12 h，換水清洗至中性，4 ℃保存。

1.3.2 木瓜蛋白酶的CTS-HNTs微球固定

稱取1 g CTS-HNTs微球（濕球），加入10 mL 5%戊二醛溶液，室溫恒溫振蕩3 h，進(jìn)行交聯(lián)，然后用蒸餾水清洗，再用0.1 mol/L磷酸鈉緩沖溶液（pH 7.2）清洗，直至洗液中無(wú)戊二醛。加入2 mL 1 mg/mL的木瓜蛋白酶溶液，4 ℃固定化12 h，用0.1 mol/L磷酸鈉緩沖溶液（pH 7.2）清洗，至溶液中無(wú)游離木瓜蛋白酶，4 ℃冷藏待用。比較不同比例的CTS、HNTs制備的微球的固定化效果，研究酶質(zhì)量濃度、固定時(shí)間、pH值等因素對(duì)木瓜蛋白酶固定量的影響，分析CTS-HNTs微球固定木瓜蛋白酶的最適pH值、最適溫度、pH值穩(wěn)定性、熱穩(wěn)定性。

1.3.3 固定量及酶活性測(cè)定

木瓜蛋白酶固定量測(cè)定：當(dāng)固定化過(guò)程結(jié)束后，將上清液與微球顆粒分離，清洗顆粒至洗液中不含游離木瓜蛋白酶，將上清液與洗液合并，于280 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度，固定量計(jì)算如式（1）所示：

式中：P為木瓜蛋白酶固定量/（mg/g）；Ca為加入木瓜蛋白酶溶液質(zhì)量濃度/（mg/mL）；Va為加入木瓜蛋白酶溶液的體積/mL；Vb為固定后上清液與洗液的體積/mL；Cb為未被固定的酶，即上清液與洗液中木瓜蛋白酶質(zhì)量濃度/（mg/mL）；m為微球載體質(zhì)量/g。

游離木瓜蛋白酶活性測(cè)定：按照GB/T 23527—2009《蛋白酶制劑》的方法配制酪氨酸溶液并繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，參考易喻等[26]的方法并作改進(jìn)，測(cè)定木瓜蛋白酶的活性。移取0.1 mL的木瓜蛋白酶溶液，并加入0.9 mL激活劑，置于37 ℃水浴10 min，再加入1 mL底物酪蛋白，混勻，37 ℃反應(yīng)10 min后，立即加入3 mL 5%的三氯乙酸溶液劇烈振蕩，終止反應(yīng)。靜置30 min后，于4 000 r/min離心10 min，取上清液測(cè)定275 nm波長(zhǎng)處的吸光度。空白試樣在加入底物酪蛋白之前，先加入三氯乙酸終止反應(yīng)。酶活性的計(jì)算如式（2）所示：

式中：A為試樣品酶解溶液的吸光度；A0為對(duì)照樣品酶解溶液的吸光度；K為酪氨酸標(biāo)準(zhǔn)曲線斜率；V為酶解溶液的體積/mL；t為反應(yīng)時(shí)間/h；n為稀釋倍數(shù)；m為酶量/（mg/mL）。

固定化木瓜蛋白酶的活性測(cè)定：取待用的固定化木瓜蛋白酶的CTS-HNTs微球，加入1 mL激活劑，其他步驟同游離酶活性的測(cè)定。

1.3.4 CT S-HNTs微球固定化木瓜蛋白酶的表征

紅外光譜分析：采用傅里葉變換紅外光譜儀，分別對(duì)CTS、CTS-HNTs復(fù)合微球及固定化木瓜蛋白酶的化學(xué)結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析。將樣品干燥后磨成粉狀，進(jìn)行壓片，再放置于紅外光譜儀中進(jìn)行掃描分析。

微觀結(jié)構(gòu)分析：采用掃描電子顯微鏡對(duì)CTS-HNTs微球固定化 木瓜蛋白酶表面形態(tài)及內(nèi)部結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析。將CTS-HNTs微球樣品表面鍍金60 s后，在15 kV的測(cè)試電壓條件下，觀測(cè)CTS-HNTs微球物理形態(tài)的變化。

熱重分析：將CTS-HNTs微球自然風(fēng)干后，與CTS、HNTs粉末進(jìn)行熱重分析。分析條件：溫度范圍：室溫到600 ℃，升溫速率：10 ℃/min，氣氛：N2，研究熱降解行為。

2 結(jié)果與分析

2.1 CTS-HNTs微球的制備及其對(duì)木瓜蛋白酶固定化效果

分別以不同比 例的CTS和HNTs制備微球，觀察各種微球的破損度、飽滿度。由圖1a可知，復(fù)合微球中，1%的CTS由于質(zhì)量分?jǐn)?shù)太小，不足以包埋同質(zhì)量分?jǐn)?shù)的HNTs，無(wú)法形成規(guī)則飽滿的微球；2% CTS+1% HNTs制備的微球，球形較飽滿，破損少，微球成型規(guī)則，制球效果好。將二者充分?jǐn)嚢杌靹蛑苽鋺腋∫?，CTS溶液將HNTs包埋，然后將懸浮液中和沉淀，制備CTS-HNTs微球（圖1b）。通過(guò)吸附-交聯(lián)方法，CTS-HNTs微球與戊二醛發(fā)生交聯(lián)反應(yīng)，生成席夫堿；交聯(lián)后CTS-HNTs微球上的另一端醛基與酶上的氨基發(fā)生美拉德反應(yīng)，生成席夫堿，使得木瓜蛋白酶交聯(lián)在CTS-HNTs微球上[27]，由于CTS-HNTs微球內(nèi)部孔隙較多，木瓜蛋白酶可通過(guò)吸附作用進(jìn)入微球內(nèi)部。

圖 1 CTS-HNTs微球的制 備及其對(duì)木瓜蛋白酶的固定化Fig. 1 Preparation of CTS-HNTs microspheres and immobilization of papain onto them

圖 2 不同CTS和HNTs比例制成微球的酶固定量Fig. 2 Effect of different CTS/HNTs ratios on the enzyme immobilization capacity of microspheres

由圖2可知，2% CTS+1% HNTs時(shí)，微球飽滿度好，對(duì)木瓜蛋白酶的固定量最高。2.2 CTS-HNTs微球?qū)δ竟系鞍酌腹潭ɑ谋碚鞣治?/p>

2.2.1 傅里葉紅外光譜分析

將樣品干燥后磨成粉狀，再進(jìn)行壓片，再放置于紅外光譜儀中進(jìn)行掃描分析。圖3E是HNTs的紅外光譜圖，在3 695 cm－1和3 621.6 cm－1處是HNTs表面的O—H振動(dòng)，在1 630.2 cm－1處是O—H變形振動(dòng)，Si—O的面內(nèi)伸縮振動(dòng)位于1 031.8 cm－1，910 cm－1處為Si—O的垂直伸縮振動(dòng)；圖3D是CTS的紅外光譜圖，3 425.9 cm－1附近為—OH和—N—H的伸縮振動(dòng)峰，聚合物骨架的—CH伸縮振動(dòng)峰位于2 878.9 cm－1附近，1 659.7 cm－1與1 087 cm－1處為C＝O和C—O—C的伸縮振動(dòng)，—NH的變形振動(dòng)位于1 380 cm－1處；圖3A是CTS與HNTs按2% CTS+ 1% HNTs比例制成球后的紅外光譜圖，圖譜特征綜合了兩者的特征；圖3B是CTS-HNTs復(fù)合微球經(jīng)戊二醛交聯(lián)后的紅外光譜圖，戊二醛的醛基與CTS上的氨基通過(guò)聚合作用生成席夫堿，而圖譜上1 564.4 cm－1處的峰為—C＝N—的伸縮振動(dòng)，恰好驗(yàn)證了席夫堿的生成，使得復(fù)合微球的化學(xué)結(jié)構(gòu)更加穩(wěn)定；圖3C是CTSHNTs復(fù)合小球經(jīng)戊二醛交聯(lián)后，再加入木瓜蛋白酶進(jìn)行固定化得到的紅外光譜圖，木瓜蛋白酶上的—NH與戊二醛的醛基交聯(lián)生成席夫堿，從圖譜中可看出1 564.6 cm－1處有—C＝N—的伸縮振動(dòng)，并且相比于經(jīng)戊二醛交聯(lián)后的CTS-HNTs微球而言，有稍微增強(qiáng)的趨勢(shì)，但是由于木瓜蛋白酶結(jié)合量較少，增強(qiáng)的強(qiáng)度不明顯。紅外結(jié)果表明，木瓜蛋白酶已經(jīng)由化學(xué)交聯(lián)結(jié)合到CTS-HNTs復(fù)合微球上。

圖 3 紅外光譜分析Fig. 3 Infrared spectra of microsphere samples

2.2.2 掃描電子顯微鏡分析

將樣品表面鍍金60 s后，在15 kV的測(cè)試電壓下，通過(guò)掃描電子顯微鏡觀測(cè)表面及橫切面的形態(tài)變化。圖4結(jié)果表明，交聯(lián)后的CTS-HNTs微球表面孔隙增加，球形更緊密，結(jié)構(gòu)更穩(wěn)定，更有利于蛋白酶的固定及包埋。微球固定木瓜蛋白酶后，其表面及橫切面明顯增加了細(xì)小的點(diǎn)狀物，結(jié)構(gòu)更緊密（圖4b、4c）。這是由于微球表面和橫切面的木瓜蛋白酶分子，既與戊二醛交聯(lián)，也與CTS上的氨基交聯(lián)，生成兩個(gè)席夫堿，使其結(jié)構(gòu)更加緊密，這與紅外光譜圖的結(jié)果一致。

圖 4 樣品掃描電子顯微鏡圖Fig. 4 SEM images of microsphere samples

2.2.3 熱重分析

圖 5 微球樣品熱重分析Fig. 5 TG analysis of microsphere samples

從圖5可看出，HNTs的熱穩(wěn)定性最高，質(zhì)量損失較少。在270 ℃時(shí)CTS分解加速，可能是CTS鏈發(fā)生了降解，CTS-HNTs微球的質(zhì)量損失顯低于CTS。CTS質(zhì)量損失5%時(shí)溫度是57 ℃，CTS-HNTs微球質(zhì)量損失5%時(shí)溫度為146 ℃；270 ℃時(shí)，CTS質(zhì)量損失20%，而CTS-HNTs

微球在溫度290 ℃左右質(zhì)量損失20%，所以HNTS可以增強(qiáng)CTS微球的熱穩(wěn)定性；一方面在產(chǎn)生揮發(fā)物時(shí)形成的炭可以作為屏障阻礙揮發(fā)損失的擴(kuò)散[27]，CTS-HNTs微球的炭殘余含量高于純CTS，因此，CTS-HNTs微球有更好的熱穩(wěn)定性；另一方面，CTS和HNTs之間有氫鍵和靜電相互作用[28]。所以，CTS和HNTs是相容的，且HNTs可以改善CTS的熱穩(wěn)定性。

2.3 固定化條件對(duì)固定化效果的影響

圖 6 酶質(zhì)量濃度（a）、固定時(shí)間（b）、pH值（c）對(duì)固定化酶相對(duì)活性的影響Fig. 6 Influence of enzyme concentration, immobilization time and pH on relative activity of immobilized enzyme

在pH 7.2、4 ℃條件下，分別將CTS-HNTs微球置于不同質(zhì)量濃度木瓜蛋白酶溶液中固定12 h，研究酶質(zhì)量濃度對(duì)酶固定化活性的影響。由圖6a可知，木瓜蛋白酶質(zhì)量濃度為1 mg/mL時(shí)，CTS-HNTs微球固定的木瓜蛋白酶量和相對(duì)活性最大，可能是1 mg/mL木瓜蛋白酶在CTS-HNTs微球上固定量達(dá)到飽和狀態(tài)，若質(zhì)量濃度再增加，已固定在CTS-HNTs微球上的木瓜蛋白酶會(huì)產(chǎn)生位阻效應(yīng)，從而影響固 定化酶的相對(duì)活性[29]。

在pH 7.2、4 ℃條件下，分別將CTS-HNTs微球置于1 mg/mL木瓜蛋白酶溶液中，研究固定時(shí)間對(duì)酶固定化酶活性的影響。圖6b表明，在0～10 h內(nèi)，隨著固定化時(shí)間的延長(zhǎng)，CTS-HNTs微球固定化木瓜蛋白酶的相對(duì)活性逐漸增大，在10 h后，趨于平衡，可能是因?yàn)槟竟系鞍酌概cCTS-HNTs微球載體上的羰基全部反應(yīng)生成席夫堿，達(dá)到吸附飽和。

分別將CTS-HNTs微球置于不同pH值的木瓜蛋白酶溶液（1 mg/mL）中12 h（4 ℃），研究pH值對(duì)酶固定化活性的影響。從圖6c可看出，pH值為7.2時(shí)，CTS-HNTs微球固定化木瓜蛋白酶的酶相對(duì)活性達(dá)到最高。

2.4 CTS-HNTs微球固定化木瓜蛋白酶的性能分析

2.4.1 固定化木瓜蛋白酶的最適pH值和最適溫度

圖 7 固定化酶的最適pH值（a）和最適溫度（b）Fig. 7 Optimum pH and temperature for the immobilized papain

從圖7a可知，在pH 6.8時(shí)，固定化木瓜蛋白酶的相對(duì)活性最大，而游離酶的最適pH 7.2，與游離酶比較，固定化酶的最適反應(yīng)pH值向酸性方向偏移。圖7b可看出，固定化酶的最適溫度為60 ℃，比游離酶的最適溫度（50 ℃）升高10 ℃，固定化酶和微球載體的結(jié)合后，對(duì)催化反應(yīng)溫度敏感性降低[30]，固定化木瓜蛋白酶比游離酶更穩(wěn)定。

2.4.2 固定化木瓜蛋白酶的pH值穩(wěn)定性

圖 8 固定化酶的性能Fig. 8 Stability analysis of the immobilized papain

將游離木瓜蛋白酶與固定化木瓜蛋白酶分別置于不同pH值的磷酸溶液中，在室溫放置24 h后，分別測(cè)定其酶活性，比較游離木瓜蛋白酶與固定化木瓜蛋白酶的pH值穩(wěn)定性（酶相對(duì)活性最高為100%）。由圖8a可看出，在酸性條件下，pH值對(duì)固定化酶和游離酶相對(duì)活性的影響趨勢(shì)相同，但在堿性時(shí)，隨pH值的升高，固定化酶的相對(duì)活性受pH值影響相對(duì)較小，這是由于固定化木瓜蛋白酶，微球上的羥基一定程度上改變了溶液的微環(huán)境，提高固定化木瓜蛋白酶的耐堿性。

2.4.3 固定化木瓜蛋白酶的熱穩(wěn)定性

將游離木瓜蛋白酶及固定化木瓜蛋白酶置于不同溫度中保存2 h后冷卻至室溫，測(cè)定其酶活性，比較其熱穩(wěn)定性。圖8b表明，溫度為30 ℃時(shí)，游離酶的相對(duì)活性高于固定化酶，但游離酶的相對(duì)活性隨著溫度的升高而降低；固定化木瓜蛋白酶在40 ℃時(shí)活性較高，且高于游離酶；固定化酶的相對(duì)活性也隨著溫度的升高而降低，但都高于游離酶的活性。可能因?yàn)?0 ℃時(shí)，游離酶的活性催化基團(tuán)比較容易擴(kuò)展，隨著溫度的升高，酶的活性催化中心改變空間構(gòu)象，逐漸失去活性；而固定化木瓜蛋白酶30 ℃時(shí)由于微球載體的束縛而無(wú)法顯出較好的催化活性；但隨著溫度的升高，固定化酶的部分活性基團(tuán)被吸附于CTS-HNTs微球復(fù)合載體表面及內(nèi)部，其活性空間構(gòu)象得到保護(hù)，減少了熱振動(dòng)對(duì)酶分子的影響，固定化酶熱穩(wěn)定性增強(qiáng)。

2.4.4 固定化木瓜蛋白酶的貯存穩(wěn)定性

將游離木瓜蛋白酶與固定化木瓜蛋白酶保存在4 ℃冰箱中，隔一定時(shí)間取出并分別測(cè)定其酶活性，分析其貯存穩(wěn)定性。由圖8c可看出，固定化酶和游離酶的相對(duì)活性都隨著保存時(shí)間的延長(zhǎng)而降低。與游離酶相比，固定化酶的相對(duì)活性下降速度比較緩慢，在4 ℃貯存30 d，固定化木瓜蛋白酶的相對(duì)活性仍保持在62%，游離酶的相對(duì)活性降到27%?？梢?jiàn)，固定化酶相比游離酶，擁有更好的貯存性能，該性能對(duì)酶的利用有十分重要的意義。

2.4.5 固定化木瓜蛋白酶的操作穩(wěn)定性

將CTS-HNTs微球固定化木瓜蛋白酶反復(fù)使用后，用磷酸溶液清洗CTS-HNTs微球至無(wú)酪蛋白析出，研究固定化酶的操作穩(wěn)定性。由圖8d可知，固定化木瓜蛋白酶的相對(duì)活性隨著使用次數(shù)的增加而逐漸降低，使用4 次后，固定化酶的相對(duì)活性保留26.26%。

3 結(jié) 論

以2% CTS+1% HNTs制備CTS-HNTs微球，采用交聯(lián)-吸附的方法可以固定木瓜蛋白酶。固定化木瓜蛋白酶的最適溫度為60 ℃，最適pH值為6.8，而游離木瓜蛋白酶的最適溫度為50 ℃，最適pH值為7.2。與游離酶比，固定化木瓜蛋白酶有良好的貯存穩(wěn)定性和操作穩(wěn)定性。采用CTS-HNTs微球固定化木瓜蛋白酶，降低了成本，提高了木瓜蛋白酶的利用價(jià)值。

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Preparation of Chitosan-Halloysites Nanotube Microspheres and Their Application in Immobilization of Papain

DING Lijun, QU Yehui, LIU Dan
(School of Chem ical Engineering and Light Industry, Guangdong University of Technology, Guangzhou 510006, China)

Chitosan-halloysites nanotube (CTS-HNTs) composite microspheres were successfully prepared by crosslinkingadsorption method, and used to immobilize papain. The successful immobilization of papain on CTS-HNTs composite microspheres was confirmed through infrared spectroscopy, scanning electron m icroscopy, and fluorescent labeling. The microspheres prepared with 2% CTS and 1% HNTs displayed the highest immobilization ef ciency for papain. The optimal immobilization conditions were determined as 1 mg/mL and 10 h for papain concentration and immobilization time, respectively. The optimal pH and temperature for the immobilized enzyme were 6.8 and 60 ℃, respectively, while those for the free enzyme were 7.2 and 50 ℃, respectively. After 30 days of storage, the relative activity of the immobilized and free papain was 62% and 27%, respectively. The immobilized enzyme retained 26.26% of the initial activity after fourth repeated use. Th e immobilized papain had good storage stability and operational stability, enhancing the utility efficiency of the enzyme, cutting down the cost of enzymatic hydrolysis and enhancing the production ef ciency.

chitosan-halloysites; composite microspheres; immobilized enzyme; papain

10.7506/spkx1002-66 30-201 710021

Q814

A

1002-6630（2017）10-0123-07

丁利君, 瞿葉輝, 劉丹. 殼聚糖-埃洛石納米管微球的制備及其對(duì)木瓜蛋白酶的固定化[J]. 食品科學(xué), 2017, 38(10): 123-129. DOI:10.7506/spkx1002-6630-201710021. http://www.spkx.net.cn

DING Li jun, QU Yehui, LIU Dan. Preparation of chitosan-halloysites nanotube microspheres and their application in immobilization of papain[J]. Food Science, 2017, 38(10): 123-129. (in Chinese with English abstract)

10.7506/ spkx1002-6630-201710021. http://www.spkx.net.cn

2016-07-12

廣東省教育部產(chǎn)學(xué)研合作重大專項(xiàng)（2013A090100009）

丁利君（1965—），女，教授，碩士，研究方向?yàn)樘烊划a(chǎn)物化學(xué)與功能性。E-mail：ddddlj@foxmail.com