納豆芽孢桿菌固態(tài)發(fā)酵小米糠產(chǎn)抗氧化肽工藝優(yōu)化

韋 濤，周啟靜，陸兆新，呂鳳霞，別小妹，張 充，趙海珍

納豆芽孢桿菌固態(tài)發(fā)酵小米糠產(chǎn)抗氧化肽工藝優(yōu)化

韋 濤，周啟靜，陸兆新，呂鳳霞，別小妹，張 充，趙海珍*

（南京農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科技學(xué)院，江蘇 南京 210095）

為提高小米糠蛋白資源的利用率，為小 米糠的深加工提供參考，采用納豆芽孢桿菌對(duì)小米糠進(jìn)行固態(tài)發(fā)酵以獲得小米糠抗氧化肽。在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上以小米糠發(fā)酵后水提液的總抗氧化能力（total antioxidant capacity，T-AOC）為指標(biāo)，使用Plackett-Burman試驗(yàn)對(duì)發(fā)酵條件進(jìn)行篩選，然后使用響應(yīng)面法對(duì)發(fā)酵條件進(jìn)行優(yōu)化，并測定優(yōu)化后小米糠水提液的多肽含量和1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）自由基清除能力。結(jié)果顯示最適發(fā)酵條件為：小米糠平均粒徑0.22 mm（60～80 目）、菌液接種量0.4 mL（約108CFU/mL）、初始pH 6.7、發(fā)酵時(shí)間26 h、發(fā)酵溫度35 ℃。此條件下小米糠固態(tài)發(fā)酵后提取液的T-AOC實(shí)際值為（344.51±8.02）U/g小米糠，多肽提取量為（68.37±0.92）mg/g小米糠，清除DPPH自由基IC50為0.12 mg/mL。該研究表明，小米糠固態(tài)發(fā)酵條件經(jīng)過優(yōu)化后能夠獲得具有較高抗氧化能力的生物活性肽。

小米糠是小米加工過程中的副產(chǎn)物，由谷殼、種皮、糊粉層和胚芽組成。我國有豐富的小米糠資源，據(jù)農(nóng)業(yè)部統(tǒng)計(jì)，2012年全國小米的種植面積約140萬 hm2，小米糠年產(chǎn)量約為40萬 t。小米糠中蛋白質(zhì)含量為13%左右，且小米糠蛋白質(zhì)具有低過敏性和必需氨基酸種類多等特點(diǎn)，是一種營養(yǎng)價(jià)值較高的蛋白質(zhì)[1]。

近年來，對(duì)大米糠的研究逐漸增多，但對(duì)小米糠的基礎(chǔ)研究還處于起步階段，主要集中在小米糠油脂[2-3]、膳食纖維[4]、植酸[5]、蛋白[6-7]和多肽[8-9]等方面，其中小米糠多肽的制備大多為酶法制備，對(duì)于固態(tài)發(fā)酵法制備小米糠多肽還十分罕見。固態(tài)發(fā)酵法是指利用自然底物做碳源及能源，在沒有或基本沒有游離水的固態(tài)基質(zhì)上的發(fā)酵方式。此法具有占用空間小、用水量少、能耗低和不易染雜菌等優(yōu)點(diǎn)[10]。目前，固態(tài)發(fā)酵法已成為生物活性肽制備的常用方法，如Coda[11]、He Rong[12]、彭惠惠[13]、Amadou[14]、Wu Wanxing[15]等分別通過固態(tài)發(fā)酵谷物粉、菜籽粕、芝麻粕、小米粉和核桃粕等得到了具有抗氧化能力的多肽。大量文獻(xiàn)[16-19]報(bào)道，大米糠生物活性肽具有較佳的抗氧化能力，主要表現(xiàn)在還原能力和自由基清除能力等方面。根據(jù)郭利娜等[8]研究發(fā)現(xiàn)，小米糠生物活性肽也具有較佳的抗氧化能力。鑒于固態(tài)發(fā)酵法的優(yōu)點(diǎn)，將固態(tài)發(fā)酵法應(yīng)用于小米糠抗氧化肽的制備，對(duì)提高小米糠蛋白資源的利用率十分有意義。

固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基中添加一定的營養(yǎng)物質(zhì)可以給菌體提供一個(gè)合適的生長環(huán)境，促進(jìn)次級(jí)代謝產(chǎn)物的合成[10]。周建新等[20]研究了培養(yǎng)基組成對(duì)黑曲霉固態(tài)發(fā)酵陳化秈稻谷生產(chǎn)檸檬酸過程的影響，發(fā)現(xiàn)在培養(yǎng)基中添加適量麩皮、碳酸鈣和硝酸銨有助于檸檬酸的產(chǎn)生。本實(shí)驗(yàn)所用固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基中的組成成分均為預(yù)實(shí)驗(yàn)所得最佳添加量，有利于提高小米糠提取液的抗氧化能力。除培養(yǎng)基組成外，在固態(tài)發(fā)酵過程中，還存在很多其他影響因素，其中pH值和發(fā)酵時(shí)間對(duì)發(fā)酵過程中微生物的生長和酶的活力具有顯著影響[21]。Schmidt等[22]研究了米糠平均粒徑和硫酸銨添加量對(duì)米糠固態(tài)發(fā)酵的影響，米糠平均粒徑為0.18 mm，鹽溶液中硫酸銨質(zhì)量濃度為8 g/L時(shí)，與沒有發(fā)酵的米糠相比，蛋白和酚類物質(zhì)的含量分別提高了53%和65%。Wu Wanxing等[15]研究發(fā)現(xiàn)發(fā)酵時(shí)間和接種量對(duì)核桃粕的固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)抗氧化肽具有顯著影響，且兩因素之間交互作用非常顯著（P＜0.01）。

本研究擬以納豆芽孢桿菌NattoD-3為發(fā)酵菌株，利用廉價(jià)且營養(yǎng)豐富的小米糠作為基本基質(zhì)進(jìn)行固態(tài)發(fā)酵，重點(diǎn)考察菌液接種量、發(fā)酵時(shí)間、發(fā)酵溫度、初始pH值和發(fā)酵基質(zhì)粒徑5 個(gè)因素對(duì)發(fā)酵后小米糠水提液的總抗氧化能力的影響規(guī)律。在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，以總抗氧化能力（total antioxidant capacity，T-AOC）為評(píng)價(jià)指標(biāo)，設(shè)計(jì)了Plackett-Burman試驗(yàn)和響應(yīng)面試驗(yàn)對(duì)固態(tài)發(fā)酵條件進(jìn)行優(yōu)化，并測定優(yōu)化后多肽提取量和1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）自由基清除能力。提高小米糠蛋白資源的利用率，為小米糠深加工、保健食品或天然抗氧化劑的開發(fā)提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

納豆芽孢桿菌NattoD-3，由南京農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科技學(xué)院酶工程實(shí)驗(yàn)室保存；新鮮米糠購于山西省，正己烷脫脂處理，－18 ℃保存；DPPH 美國Sigma公司；T-AOC測定試劑盒 南京建成生物技術(shù)公司；福林-酚試劑和培養(yǎng)基均為分析純由國藥集團(tuán)提供。

1.2 儀器與設(shè)備

AY120電子天平、UV-2450紫外-可見分光光度計(jì)日本Shimadzu公司；SX-700高壓滅菌鍋 日本Tomy公司；SW-CJ-1FD型單人單面凈化工作臺(tái) 蘇州凈化設(shè)備有限公司；DRP-9162型電熱恒溫培養(yǎng)箱 上海森信實(shí)驗(yàn)儀器有限公司；GZX-9240MBE電熱鼓風(fēng)干燥箱上海博訊實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠；SB-5200DT超聲波清洗機(jī) 寧波新芝生物科技股份有限公司；5804R冷凍離心機(jī) 德國Eppendorf公司。

1.3 方法

1.3.1 培養(yǎng)基、菌種活化和抗氧化肽粗提液的制備

NA培養(yǎng)基：牛肉浸膏3.00 g/L、魚粉蛋白胨10.00 g/L、NaCl 5.00 g/L，pH 7.0，121 ℃滅菌20 min。

固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基：脫脂小米糠5.0 0 g、NH2CONH20.10 g、K2HPO4·3H2O 0.02 g、蒸餾水6.00 mL，自然pH值。115 ℃滅菌30 min。

將安瓿管中菌種接入裝有100 mL NA培養(yǎng) 基的錐形瓶中，八層紗布封口，置于空氣搖床中擴(kuò)大培養(yǎng)，37 ℃、180 r/min培養(yǎng)20 h，使菌種活化。將在NA培養(yǎng)基中活化好的菌懸液接入已滅菌固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基中，混合均勻，放入37 ℃電熱恒溫培養(yǎng)箱，每 隔12 h搖晃錐形瓶通氣，培養(yǎng)24 h后，將小米糠轉(zhuǎn)移至培養(yǎng)皿，放入60 ℃電熱鼓風(fēng)干燥箱烘干至質(zhì)量恒定，冷卻至室溫，精確稱取烘干后小米糠1.000 g置于25 mL試管中，加入10 mL蒸餾水，于30 ℃超聲波清洗儀中超聲提取30 min，然后轉(zhuǎn)移上清液至離心管中10 000×g離心10 min，取上清液，通過0.45 μm濾膜，即得到抗氧化肽粗提液，待測，各實(shí)驗(yàn)重復(fù)3 次。

1.3.2 小米糠固態(tài)發(fā)酵條件的單因素試驗(yàn)

分別研究接種量（0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL）（約108CFU/mL）、初始pH值（5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0）、發(fā)酵溫度（25、28、30、34、37、40 ℃）、發(fā)酵時(shí)間（0、12、24、36、48、60、72 h）、平均粒徑（0.17、0.22、0.34、0.64、1.43 mm）對(duì)小米糠固態(tài)發(fā)酵的影響。根據(jù)小米糠抗氧化肽粗提液的T-AOC確定較佳的發(fā)酵條件。各實(shí)驗(yàn)重復(fù)3 次，取平均值。

1.3.3 Plackett-Burman試驗(yàn)設(shè)計(jì)

使用Design-Expert v8.0.6軟件設(shè)計(jì)N12的Plackett-Burman試驗(yàn)。以T-AOC為評(píng)價(jià)指標(biāo)，對(duì)影響發(fā)酵的5 個(gè)因素進(jìn)行篩選，即接種量（X1）、初始pH值（X3）、發(fā)酵溫度（X5）、發(fā)酵時(shí)間（X7）、平均粒徑（X9），另外添加6 個(gè)虛擬因素（X2、X4、X6、X8、X10、X11），每個(gè)因素分別設(shè)有高水平和低水平兩個(gè)水平，分別用1、－1表示，高水平為單因素試驗(yàn)的最佳值，且高水平約為低水平的1.33 倍。試驗(yàn)設(shè)計(jì)因素與水平見表1。

表 1 Plackett-Burman試驗(yàn)設(shè)計(jì)因素與水平Table 1 Coded and actural values of independent variables used in Plackett-Burman design

1.3.4 響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)設(shè)計(jì)

根據(jù)Box-Behnken設(shè)計(jì)原理，綜合單因素試驗(yàn)和Plackett-Burman試驗(yàn)的結(jié)果，以T-AOC為響應(yīng)值，選取對(duì)固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)抗氧化物影響較為顯著的初始pH值、發(fā)酵溫度和發(fā)酵時(shí)間3 個(gè)因素設(shè)計(jì)三因素三水平的Box-Behnken響應(yīng)面試驗(yàn)，分別以1、0、－1代表自變量的高、中、低3 個(gè)水平，對(duì)自變量進(jìn)行編碼。響應(yīng)面分析試驗(yàn)共17 個(gè)試驗(yàn)點(diǎn)，其中析因部分試驗(yàn)次數(shù)為12 次，中心點(diǎn)重復(fù)試驗(yàn)5 次。固定其他條件：培養(yǎng)基中小米糠5.00 g（平均粒徑0.22 mm）、NH2CONH20.10 g、K2HPO4·3H2O 0.02 g、蒸餾水6.00 mL、菌液接種量0.4 mL。

1.3.5 多肽含量測定

取3 mL樣品溶液，加入3 mL 10 g/100 mL三氯乙酸（trichloroacetic acid，TCA）溶液，混合均勻，室溫靜置30 min，10 000×g離心10 min，取上清液備用。根據(jù)池寧娟等[23]報(bào)道的福林-酚法測定，取上清液1 mL，加入1 mL堿性銅溶液和4 mL福林-酚試劑，混合均勻后，于55 ℃水浴5 min，取出冷水浴10 min，然后測定650 nm波長處吸光度。各實(shí)驗(yàn)重復(fù)3 次，取平均值。

精確配制0、0.1、0.2、0.3、0.4 mg/mL和0.5 mg/mL的牛血清白蛋白標(biāo)準(zhǔn)品溶液，按照福林-酚法測定反應(yīng)后的吸光度。以牛血清白蛋白標(biāo)準(zhǔn)品的質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，650 nm波長處的吸光度為縱坐標(biāo)，以0 mg/mL樣品反應(yīng)液調(diào)零，制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，獲得回歸方程y=0.620 6x－0.003 9（R2=0.994 8）。

1.3.6 抗氧化活力測定

1.3.6.1 T-AOC測定

根據(jù)T-AOC試劑盒的方法測定?？寡趸镔|(zhì)能將Fe3+還原為Fe2+，而Fe2+能與菲啉類物質(zhì)形成穩(wěn)固的絡(luò)合物，在520 nm波長處通過比色測出其抗氧化能力的高低。定義37 ℃為每分鐘每毫升抗氧化物質(zhì)使反應(yīng)體系的吸光度（A）每增加0.01時(shí)，為一個(gè)總抗氧化活性單位（U）。各實(shí)驗(yàn)重復(fù)3 次，取平均值。計(jì)算公式（1）如下：

式中：A1為樣品吸光度；A0為對(duì)照吸光度；V1為反應(yīng)液總體積，3.7 mL；V0為取樣量，0.1 mL；m為稀釋倍數(shù)，本實(shí)驗(yàn)中為10，表示每克小米糠加入10 mL蒸餾水提取。

1.3.6.2 DPPH自由基清除能力的測定

根據(jù)Torres-Fuentes等[24]的方法稍作修改測定，取樣品溶液2 mL，加入2 mL 0.1 mmol/L DPPH的95%乙醇溶液，混合搖勻，室溫避光反應(yīng)30 min。用紫外分光光度計(jì)在517 nm波長處測定吸光度。各實(shí)驗(yàn)重復(fù)3 次，取平均值。樣品對(duì)DPPH自由基清除能力計(jì)算公式（2）如下：

式中：Aa為樣品吸光度；Ab為空白組（用等量的95%乙醇溶液代替DPPH溶液）吸光度；Ac為對(duì)照組（用等量的95%乙醇溶液代替樣品）吸光度。

IC50表示DPPH自由基清除率為50%時(shí)抗氧化肽的質(zhì)量濃度（mg/mL）。調(diào)整發(fā)酵液中小米糠多肽為0、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5 mg/mL和0.6 mg/mL，分別測定其DPPH自由基清除率，通過Microsoft Excel 2007軟件擬合得到小米糠抗氧化肽質(zhì)量濃度和DPPH清除率關(guān)系的多項(xiàng)式，即可求得IC50值。

1.4 數(shù)據(jù)處理

全部數(shù)據(jù)采用Microsoft Excel 2007軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，計(jì)算平均值和標(biāo)準(zhǔn)差，單因素試驗(yàn)中Duncans多重差異顯著性分析使用SPSS Statistics 17.0軟件，作圖使用OriginPro 8.5軟件，Plackett-Burman試驗(yàn)設(shè)計(jì)和響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)設(shè)計(jì)、分析及作圖使用Design-Expert v8.0.6軟件。

2 結(jié)果與分析

2.1 小米糠固態(tài)發(fā)酵條件的單因素試驗(yàn)結(jié)果

2.1.1 接種量對(duì)T-AOC的影響

圖 1 接種量對(duì)T-AOC的影響Fig. 1 Effect of inoculum size on T-AOC

自然pH值、發(fā)酵溫度37 ℃、發(fā)酵時(shí)間24 h條件下測定接種量的影響，從圖1可知，發(fā)酵后的小米糠提取液T-AOC顯著高于未發(fā)酵（接種量為0 mL）的小米糠提取液（P＜0.05）。隨著接種量的增加，T-AOC呈現(xiàn)出先增加，后降低的趨勢，接種量為0.4 mL時(shí)，T-AOC最大為（227.90±11.30）U/g小米糠。接種量的大小對(duì)發(fā)酵產(chǎn)物的生產(chǎn)效率具有顯著影響，接種量過大會(huì)導(dǎo)致供氧不足，影響產(chǎn)物合成；過小會(huì)延長培養(yǎng)時(shí)間，降低發(fā)酵的生產(chǎn)率。本研究中由于發(fā)酵時(shí)間較短，接種量小于

0.4 mL時(shí)，菌體數(shù)量較少，分泌的蛋白酶不足，對(duì)小米糠基質(zhì)中蛋白質(zhì)的分解不充分，產(chǎn)生的抗氧化肽較少，接種量大于0.4 mL時(shí)，隨著接種量的增加，抗氧化能力逐漸降低，可能是因?yàn)榫鷿舛冗^大，供氧不足，產(chǎn)酶量減少，故在本研究發(fā)酵時(shí)間較短的條件下，選擇接種量為0.4 mL比較合理。武萬興等[25]研究接種量對(duì)核桃粕固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)抗氧化肽的影響時(shí)，發(fā)現(xiàn)隨著接種量的增高，多肽提取量先增加后降低，接種量為5.5%時(shí)有最大值，與本研究變化趨勢一致。

2.1.2 初始pH值對(duì)T-AOC的影響

圖 2 初始pH值對(duì)T-AOC的影響Fig. 2 Effect of initial pH on T-AOC

pH值主要通過影響菌體膜滲透性以及物質(zhì)離子化程度，以至 于影響納豆芽孢桿菌對(duì)養(yǎng)分的吸收和蛋白酶的產(chǎn)生[26]。調(diào)節(jié)菌液接種量0.4 mL，其他條件同2.1.1節(jié)，發(fā)酵后測定T-AOC。從圖2可知，隨著鹽溶液pH值的逐漸升高，T-AOC呈現(xiàn)出先增加后降低的趨勢，pH 7.0時(shí)最大，此時(shí)，T-AOC為（230.37±20.5）U/g小米糠。發(fā)酵培養(yǎng)基的自然pH值約為9左右，而納豆芽孢桿菌的最適生長pH值為7.0左右，強(qiáng)酸強(qiáng)堿條件都不利于菌體的生長和代謝，影響酶的合成，從而影 響產(chǎn)物的抗氧化能力。本研究結(jié)果與祁紅兵等[26]以用納豆芽孢桿菌固態(tài)發(fā)酵麩皮產(chǎn)抗氧化物類似，最適初始pH值均為7.0。

2.1.3 發(fā)酵溫度對(duì)T-AOC的影響

圖 3 發(fā)酵溫度對(duì)T-AOC的影響Fig. 3 Effect of fermentation temperature on T-AOC

溫度對(duì)納豆芽孢桿菌的生長代謝產(chǎn)生顯著影響，在適宜的發(fā)酵溫度條件下，微生物生長代謝活躍，產(chǎn)酶量高，從而有利于抗氧化肽的產(chǎn)生。調(diào)節(jié)初始pH 7.0，其他條件同2.1.2節(jié)，發(fā)酵后測定T-AOC。從圖3可知，隨著發(fā)酵溫度的逐漸升高，T-AOC呈先增加后下降的趨勢，34 ℃時(shí)最高，此時(shí)T-AOC為（228.58±16.79）U/g小米糠，34 ℃為較佳發(fā)酵溫度。根據(jù)納豆芽孢桿菌的生長特性可知，納豆芽孢桿菌的最適生長溫度為37 ℃左右。但有研究顯示菌體的最適生長溫度與最適發(fā)酵溫度不一定相同[10]。例如，Mahanama等[27]通過響應(yīng)面法優(yōu)化納豆芽孢桿菌固態(tài)發(fā)酵大豆粉后得到的最佳發(fā)酵溫度為35 ℃。溫度過低時(shí)，納豆芽孢桿菌生長和代謝均比較緩慢，短時(shí)間內(nèi)分泌的蛋白酶少，導(dǎo)致抗氧化肽含量少，抗氧化能力低。隨著溫度的升高，菌體的生長代謝均逐漸增加，分泌的蛋白酶也逐漸增加，抗氧化肽含量也隨之增多，抗氧化能力上升。但溫度過高時(shí)，并不利于菌體的生長代謝，反而導(dǎo)致菌體衰老快，發(fā)酵產(chǎn)物抗氧化能力降低。本研究發(fā)酵時(shí)間較短，34 ℃表現(xiàn)為納豆芽孢桿菌在短時(shí)間內(nèi)生長與發(fā)酵產(chǎn)生抗氧化肽的最適溫度，與吳永沛等[28]報(bào)道的枯草芽孢桿菌固態(tài)發(fā)酵大豆粕產(chǎn)抗氧化肽的最適溫度33.7 ℃相似。

2.1.4 發(fā)酵時(shí)間對(duì)T-AOC的影響

圖 4 發(fā)酵時(shí)間對(duì)T-AOC的影響Fig. 4 Effect of fermentation time on T-AOC

發(fā)酵時(shí)間的長短對(duì)納豆芽孢桿菌的數(shù)量影響十分顯著，進(jìn)而影響小米糠蛋白的分解。設(shè)置發(fā)酵溫度為34 ℃，其他條件同2.1.3節(jié)，發(fā)酵后測定T-AOC。從圖4可知，隨著發(fā)酵時(shí)間的延長，T-AOC呈現(xiàn)先增加后降低的趨勢，發(fā)酵24 h時(shí)T-AOC最大為（239.68±9.25）U/g小米糠。發(fā)酵開始時(shí)，隨著發(fā)酵時(shí)間的延長，菌體數(shù)量逐漸增多，分泌的蛋白酶也逐漸增多，小米糠蛋白被分解為抗氧化肽，故抗氧化能力逐漸增強(qiáng)，發(fā)酵時(shí)間超過24 h后，抗氧化能力出現(xiàn)降低的趨勢，可能是由于菌體數(shù)量過多，產(chǎn)生的蛋白酶也逐漸增多，抗氧化肽被進(jìn)一步的分解為更小的肽或氨基酸[8]。其變化趨勢與武萬興等[25]研究核桃粕固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)抗氧化肽類似，但最佳發(fā)酵時(shí)間24 h比核桃粕發(fā)酵所用時(shí)間短，這可能是由于小米糠中蛋白質(zhì)含量比核桃粕低導(dǎo)致。

2.1.5 平均粒徑對(duì)T-AOC的影響

固態(tài)發(fā)酵基質(zhì)的粒徑對(duì)菌體發(fā)酵有顯著影響，用于固態(tài)發(fā)酵的小米糠粒徑需要控制在一個(gè)合適的范圍。為了優(yōu)化固態(tài)發(fā)酵所使用小米糠的平均粒徑，通過使用10、20、40、60、80、100 目的篩網(wǎng)分別篩分出平均粒徑為0.17、0.22、0.34、0.64、1.43 mm的小米糠用于發(fā)酵，篩網(wǎng)的孔徑和小米糠的平均粒徑如表2所示。固態(tài)發(fā)酵的時(shí)間為24 h，其他條件同2.1.4節(jié)，發(fā)酵后測定T-AOC。

表 2 篩網(wǎng)的孔徑和小米糠的平均粒徑Table 2 Mesh size and corresponding average particle size of millet bran

圖 5 平均粒徑對(duì)T-AOC的影響Fig. 5 Effect of average particle diameter on T-AOC

從圖5可以看出，隨著平均粒徑的逐漸增加，T-AOC先增加后降低，平均粒徑為0.22 mm時(shí)最大，T-AOC為（313.68±11.45） U/g小米糠，即60～80 目篩網(wǎng)之間的顆粒度最適宜。小的粒徑可以提供一個(gè)相對(duì)大的表面積，有助于發(fā)酵過程中熱量傳遞與氣體的流通，也有利于菌體對(duì)小米糠中營養(yǎng)物質(zhì)的充分利用，但粒徑過小，容易導(dǎo)致小米糠結(jié)團(tuán)，不利于發(fā)酵過程中熱量傳遞與氣體的流通；粒徑過大，導(dǎo)致相對(duì)表面積偏小，不利于納豆芽孢桿菌對(duì)小米糠中營養(yǎng)物質(zhì)的充分利用[10]。國外學(xué)者Asadi等[29]闡述了影響霉菌固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)單細(xì)胞油脂中脂肪酸組成的因素，包括培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件兩個(gè)方面，其中發(fā)酵基質(zhì)粒徑就是影響因素之一。Schmidt等[22]的研究報(bào)道，米糠粒徑的大小對(duì)菌體的生長有顯著影響，發(fā)現(xiàn)平均粒徑為0.28 mm的米糠用于發(fā)酵時(shí)，得到的生物量較大。

2.2 Plackett-Burman試驗(yàn)結(jié)果及方差分析

表 3 Plackett-Burman試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Table 3 Plackett-Burman design with experimental results

表 4 Plackett-Burman設(shè)計(jì)試驗(yàn)結(jié)果方差分析Table 4 Analysis of variance of the experiment results from Plackett-Burman design

Plackett-Burman試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果見表3，方差分析見表4，方差分析表明模型極顯著（P＜0.01），發(fā)酵溫度、發(fā)酵時(shí)間、初始pH值和平均粒徑在95%水平對(duì)T-AOC影響顯著（P＜0.05），接種量不顯著（P＞0.05）。各因素對(duì)響應(yīng)值影響的重要性依次為：發(fā)酵溫度＞發(fā)酵時(shí)間＞平均粒徑＞初始pH值＞接種量。結(jié)合實(shí)際生產(chǎn)，由于受篩網(wǎng)規(guī)格的限制，平均粒徑難以做到精確控制，故而選擇發(fā)酵溫度、發(fā)酵時(shí)間和初始pH值作為建立響應(yīng)面模型考察的因素，小米糠的平均粒徑仍然控制為0.22 mm（60～80 目）。

2.3 響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果

2.3.1 響應(yīng)面試驗(yàn)優(yōu)化結(jié)果及回歸方程方差分析

Box-Behnken試驗(yàn)結(jié)果見表5，采用Design-Expertv8.0.6軟件對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行響應(yīng)面分析，回歸方程的方差分析結(jié)果如表6所示。

表 5 響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)Box-Behnken設(shè)計(jì)及結(jié)果Table 5 Box-Behnken design with experimental and predicted T-AOC values

表 6 回歸方程各項(xiàng)方差分析Table 6 Analysis of variance for the response surface quadratic model

將所有數(shù)據(jù)進(jìn)行多元回歸擬合，得到X1（初始pH值）、X2（發(fā)酵溫度）、X3（發(fā)酵時(shí)間）與T-AOC之間二次多項(xiàng)式模型方程為：

由表3可知，擬合的二次多項(xiàng)模型極顯著（P=0.000 1），失擬項(xiàng)不顯著（P=0.085 2＞0.05），復(fù)相關(guān)系數(shù)R20.973 6，表明預(yù)測值和實(shí)測值之間具有很高的相關(guān)性；調(diào)整性決定系數(shù)0.939 6，表明有93.96%的總抗氧化能力變化能由此模型進(jìn)行解釋，軟件建立的模型能較好反映發(fā)酵條件對(duì)發(fā)酵提取液總抗氧化能力的影響。并且可以看出，X、X、X、XX、和

12313對(duì)小米糠固態(tài)發(fā)酵后提取液的總抗氧化能力有極顯著的影響，有顯著影響。

2.3.2 響應(yīng)面分析

圖 6 各因素對(duì)T-AOC影響的響應(yīng)面圖Fig. 6 Response surface plots showing the effect of the independent variables on T-AOC

圖6 a為發(fā)酵時(shí)間處于零水平時(shí)，發(fā)酵溫度與初始pH值之間的交互作用圖，當(dāng)初始pH值為較低水平時(shí)，隨著發(fā)酵溫度的升高，T-AOC先增加后降低，當(dāng)發(fā)酵溫度處于較低水平時(shí)，隨著pH值的增高，T-AOC先增加后降低，初始pH 6.5～7.5、發(fā)酵溫度34～37 ℃時(shí)，T-AOC有最大值。圖6b為發(fā)酵溫度處于零水平時(shí)，發(fā)酵時(shí)間與初始pH值之間的交互作用圖，可以看出隨著發(fā)酵時(shí)間和初始pH值水平的增加，T-AOC都是先增加后降低，與單因素試驗(yàn)結(jié)果一致。由等高線圖呈橢圓形可看出發(fā)酵時(shí)間與初始pH值之間的交互作用極顯著。發(fā)酵時(shí)間18～30 h、初始pH 6.5～7.5時(shí)，T-AOC有最大值。圖6c為初始pH值處于零水平時(shí)，發(fā)酵時(shí)間與發(fā)酵溫度之間的交互作用圖，發(fā)酵時(shí)間處于較低水平時(shí)，隨著發(fā)酵溫度的升高，T-AOC先增加后趨于平緩，發(fā)酵溫度處于較低水平時(shí)，隨著發(fā)酵時(shí)間的延長，T-AOC先增加后降低，發(fā)酵溫度34～37 ℃、發(fā)酵時(shí)間24～36 h時(shí)，T-AOC有最大值。

響應(yīng)面優(yōu)化后通過Design-Expert v8.0.6軟件計(jì)算得到的最適條件為初始pH 6.71、發(fā)酵時(shí)間26.04 h、發(fā)酵溫度35.2 ℃，在此條件下，小米糠固態(tài)發(fā)酵后提取液的T-AOC預(yù)測值為354.995 U/g小米糠。為了檢驗(yàn)響應(yīng)面設(shè)計(jì)試驗(yàn)的可靠性，根據(jù)實(shí)際的操作條件對(duì)小米糠固態(tài)發(fā)酵工藝的條件進(jìn)行調(diào)整結(jié)果為初始pH 6.7、發(fā)酵時(shí)間26 h、發(fā)酵溫度35 ℃。在此條件下，小米糠固態(tài)發(fā)酵后提取液的T-AOC實(shí)際值為（344.51±8.02）U/g小米糠，與預(yù)測值相比，相對(duì)誤差約為2.95%，比未發(fā)酵小米糠提取液的T-AOC（（108.12±3.10）U/g小米糠）提高了約2.18 倍，此時(shí)多肽提取量為（68.37±0.92）mg/g小米糠。郭利娜等[8]通過納豆芽孢桿菌液態(tài)發(fā)酵小米糠，多肽提取量為71.33 mg/g小米糠，與本研究固態(tài)發(fā)酵法的結(jié)果基本一致。

2.3.3 多肽對(duì)DPPH自由基的清除能力

圖 7 生物活性肽的DPPH自由基清除率Fig. 7 DPPH radical scavenging capacity of the bioactive peptides

從圖7可以看出，隨著小米糠多肽質(zhì)量濃度的增加，DPPH自由基的清除能力逐漸增強(qiáng)，當(dāng)多肽濃度為0.2 mg/mL時(shí)，DPPH自由基清除率達(dá)到了69.26%，隨后清除能力變化減緩。小米糠多肽質(zhì)量濃度與DPPH自由基清除能力之間呈多項(xiàng)式關(guān)系（y=922.22x3－1268.7x2+ 563.24x+0.250 2，R2=0.999 8），通過擬合方程計(jì)算得到DPPH自由基IC50為0.12 mg/mL。He Rong等[12]利用枯草芽孢桿菌固態(tài)發(fā)酵菜籽粕制備了菜籽肽，肽含量為165 μg/mL時(shí)即可清除50%的DPPH自由基；武萬興等[25]通過固態(tài)發(fā)酵核桃粕制備了抗氧化肽，其DPPH自由基IC50為0.15 mg/mL；Jin Duxin等[30]采用復(fù)合酶水解玉米蛋白后分離到一種新的抗氧化肽，其氨基酸序列為Cys-Ser-Gln-Ala-Pro-Leu-Ala，DPPH自由基IC50為0.116 mg/mL。本實(shí)驗(yàn)所得小米糠抗氧化肽的DPPH自由基IC50值略低于菜籽肽和核桃肽，與玉米肽相似，說明小米糠生物活性肽具有較高的研究價(jià)值。

3 結(jié) 論

以納豆芽孢桿菌為發(fā)酵菌株，采用固態(tài)發(fā)酵的方法，制備了小米糠抗氧化肽粗提物。對(duì)影響納豆芽孢桿菌固態(tài)發(fā)酵小米糠產(chǎn)抗氧化肽的菌液接種量、發(fā)酵時(shí)間、發(fā)酵溫度、初始pH值和發(fā)酵基質(zhì)平均粒徑5 個(gè)因素進(jìn)行了單因素試驗(yàn)，在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上設(shè)計(jì)了Plackett-Burman試驗(yàn)，篩選出初始pH值、發(fā)酵時(shí)間和發(fā)酵溫度3 個(gè)影響顯著的因素進(jìn)行響應(yīng)面法優(yōu)化，得到了最適的固態(tài)發(fā)酵條件。此條件下小米糠發(fā)酵后獲得的提取液總抗氧化能力比未發(fā)酵提取液提高了2.18 倍，且具有較高的多肽提取量和DPPH自由基清除能力。小米糠抗氧化肽是一種天然抗氧化劑，安全無毒副作用，有待于進(jìn)一步分離純化，并對(duì)其抗氧化性質(zhì)進(jìn)行研究。

[1] 杜亞軍. 小米糠深加工研究進(jìn)展[J]. 糧食與飼料工業(yè), 2016(3): 31-39. DOI:10.7633/j.issn.1003-6202.2016.03.009.

[2] PANG Min, HE Shujian, CAO Lili, et al. Optimization and evaluation of foxtail millet (Setaria italica) bran oil by supercritical carbon dioxide extraction[J]. Grasas y Aceites, 2015, 66(4): 107-110. DOI:10.3989/gya.0239151.

[3] DEVITTORI C, GUMY D, KUSY A, et al. Supercriticaluid extraction of oil from millet bran[J]. Journal of the American Oil Chemists Society, 2000, 77(6): 573-579. DOI:10.1007/s11746-000-0092-7.

[4] 朱玉, 郭利娜, 楚佳希, 等. 酶法改性對(duì)小米糠膳食纖維體外膽固醇吸附活性的影響[J]. 食品科學(xué), 2015, 36(19): 211-216. DOI:10.7506/ spkx1002-6630-201519038.

[5] 陳蓓穎, 沈群. 小米麩皮植酸的提取及植酸含量初步分析[J].食品工業(yè)科技, 2013, 34(9): 202-205. DOI:10.13386/ j.issn1002-0306.2013.09.072.

[6] 顧鎳. 小米糠蛋白的酶法提取及性質(zhì)研究[D]. 南京: 南京農(nóng)業(yè)大學(xué), 2013: 1-10.

[7] SHAN Shuhua, LI Zongwei, NEWTON I P, et al. A novel protein extracted from foxtail millet bran displays anti-carcinogenic effects in human colon cancer cells[J]. Toxicology Letters, 2014, 227(2): 129-138. DOI:10.1016/j.toxlet.2014.03.008.

[8] 郭利娜, 朱玉, 刁明明, 等. 枯草芽孢桿菌發(fā)酵小米糠對(duì)其抗氧化肽含量與抗氧化活性的影響[J]. 食品科學(xué), 2015, 36(13): 196-201. DOI:10.7506/spkx1002-6630-201513036.

[9] 于書佳, 王常青, 原敏, 等. 小米谷糠多肽對(duì)肝損傷及癌前病變的抑制作用[J]. 食品科學(xué), 2014, 35(5): 213-217. DOI:10.7506/spkx1002-6630-201405042.

[10] NIGAM P S N, PANDEY A. Biotechnology for agro-industrial residues utilisation[M]. Springer Netherlands, 2009: 197-221. DOI:10.1007/978-1-4020-9942-7_10.

[11] CODA R, RIZZELLO C G, PINTO D, et al. Selected lactic acid bacteria synthesize antioxidant peptides during sourdough fermentation of cereal flours[J]. Applied and Environmental Microbiology, 2012, 78(4): 1087-1096. DOI:10.1128/AEM.06837-11.

[12] HE Rong, JU Xingrong, YUAN Jian, et al. Antioxidant activities of rapeseed peptides produced by solid state fermentation[J]. Food Research International, 2012, 49(1): 432-438. DOI:10.1016/ j.foodres.2012.08.023.

[13] 彭惠惠, 李呂木, 錢坤, 等. 發(fā)酵芝麻粕中芝麻小肽的分離純化及其體外抗氧化活性[J]. 食品科學(xué), 2013, 34(9): 66-69. DOI:10.7506/ spkx1002-6630-201309015.

[14] AMADOU I, LE Guowei, SHI Yonghui. Evaluation of antimicrobial, antioxidant activities, and nutritional values of fermented foxtail millet extracts by Lactobacillus paracasei FN032[J]. International Journal of Food Properties, 2013, 16(6): 1179-1190. DOI:10.1080/10942912.201 1.579673.

[15] WU Wanxing, ZHAO Shenglan, CHEN Chaoyin, et al. Optimization of production conditions for antioxidant peptides from walnut protein meal using solid-state fermentation[J]. Food Science and Biotechnology, 2014, 23(6): 1941-1949. DOI:10.1007/s10068-014-0265-3.

[16] 張強(qiáng), 周正義, 王松華. 從米糠中制備抗氧化肽的研究[J]. 食品工業(yè)科技, 2007, 28(7): 145-147. DOI:10.13386/j.issn1002-0306.2007.07.040.

[17] CHANPUT W, THEERAKULKAIT C, NAKAI S. Antioxidative properties of partially purified barley hordein, rice bran protein fractions and their hydrolysates[J]. Journal of Cereal Science, 2009, 49(3): 422-428. DOI:10.1016/j.jcs.2009.02.001.

[18] 樊金娟, 羅霞, 董智. 米糠抗氧化肽的提取和純化工藝研究[J]. 食品科技, 2008, 33(12): 169-173. DOI:10.13684/j.cnki.spkj.2008.12.056.

[19] W A T T A N A S I R I T H A M L, T H E E R A K U L K A I T C, WICKRAMASEKARA S, et al. Isolation and identification of antioxidant peptides from enzymatically hydrolyzed rice bran protein[J]. Food Chemistry, 2016, 192: 156-162. DOI:10.1016/ j.foodchem.2015.06.057.

[20] 周建新, 吳定, 姚明蘭, 等. 陳化秈稻谷固態(tài)發(fā)酵法生產(chǎn)檸檬酸的培養(yǎng)基優(yōu)化[J]. 食品科學(xué), 2006, 27(12): 283-286. DOI:10.3321/ j.issn:1002-6630.2006.12.065.

[21] HUR S J, LEE S Y, KIM Y C, et al. Effect of fermentation on the antioxidant activity in plant-based foods[J]. Food Chemistry, 2014, 160: 346-356. DOI:10.1016/j.foodchem.2014.03.112.

[22] SCHMIDT C G, FURLONG E B. Effect of particle size and ammonium sulfate concentration on rice bran fermentation with the fungus Rhizopus oryzae[J]. Bioresource Technology, 2012, 123: 36-41. DOI:10.1016/j.biortech.2012.07.081.

[23] 池寧娟, 周虹, 高蘇莉, 等. 福林酚比色法測定轉(zhuǎn)移因子膠囊中多肽的含量[J]. 中國藥房, 2014, 25(17): 1617-1618. DOI:10.6039/ j.issn.1001-0408.2014.17.26.

[24] TORRES-FUENTES C, MAR CONTRERAS M, RECIO I, et al. Identification and characterization of antioxidant peptides from chickpea protein hydrolysates[J]. Food Chemistry, 2015, 180: 194-202. DOI:10.1016/j.foodchem.2015.02.046.

[25] 武萬興, 陳朝銀, 趙聲蘭, 等. 固態(tài)發(fā)酵核桃粕制備活性肽及其抗氧化活性的研究[J]. 食品工業(yè)科技, 2013, 34(16): 266-271. DOI:10.13386/j.issn1002-0306.2013.16.044.

[26] 祁紅兵, 宋軍霞, 張衛(wèi). 納豆芽孢桿菌固體發(fā)酵麩皮的抗氧化功能研究[J]. 糧食與飼料工業(yè), 2014(5): 51-53. DOI:10.7633/ j.issn.1003-6202.2014.05.013.

[27] MAHANAMA R, BERENJIAN A, VALTCHEV P, et al. Enhanced production of menaquinone 7 via solid substrate fermentation from Bacillus subtilis[J]. International Journal of Food Engineering, 2011, 7(5): 1-2. DOI:10.2202/1556-3758.2314.

[28] 吳永沛, 劉明, 倪輝. 大豆抗氧化活性肽固態(tài)發(fā)酵工藝優(yōu)化[J]. 中國食品學(xué)報(bào), 2007, 7(6): 52-57. DOI:10.3969/ j.issn.1009-7848.2007.06.009.

[29] ASADI S Z, KHOSRAVI-DARANI K, NIKOOPOUR H, et al. Evaluation of the effect of process variables on the fatty acid profile of single cell oil produced by Mortierella using solid-state fermentation[J]. Critical Reviews in Biotechnology, 2015, 35(1): 94-102. DOI:10.3109/07388551.2013.804805.

[30] JIN Duxin, LIU Xiaolan, ZHENG Xiqun, et al. Preparation of antioxidative corn protein hydrolysates, purification and evaluation of three novel corn antioxidant peptides[J]. Food Chemistry, 2016, 204: 427-436. DOI:10.1016/j.foodchem.2016.02.119.

Optimization of Solid State Fermentation Conditions for Production of Antioxidant Peptides from Millet Bran by Bacillus natto

WEI Tao, ZHOU Qijing, LU Zhaoxin, L? Fengxia, BIE Xiaomei, ZHANG Chong, ZHAO Haizhen*
(College of Food Science and Technology, Nanjing Agricultural University, Nanjing 210095, China)

In order to improve the utilization rate of millet bran as a protein source and to provide references for the intensive processing of millet bran, solid state fermentation of millet bran by Bacillus natto was optimized for increased production of antioxidant peptides. Firstly, one-factor-at-a-time experiments were carried out. Secondly, the fermentation conditions with a signi cant effect on the total antioxidant capacity (T-AOC) of aqueous extracts from fermented millet bran were selected using Plackett-Burman design for further optimization using response surface methodology (RSM). The polypeptide content and 1,1-diphenyl-2-trinitrobenzene hydrazine (DPPH) radical scavenging ability of the aqueous extract from millet bran fermented under optimized conditions were determined. Results showed that the optimum fermentation conditions were as follows: average particle diameter of millet bran, 0.22 mm (between 60 and 80 mesh); inoculum size, 0.4 mL; initial pH, 6.7; fermentation time, 26 h; and fermentation temperature, 35 ℃. Experiments conducted under these conditions yielded an extract with a T-AOC of (344.51 ± 8.02) U/g, and a polypeptide yield of (68.37 ± 0.92) mg/g millet bran. The results also showed that the bioactive peptides had strong DPPH free radical scavenging activity with an IC50value of 0.12 mg/mL. Therefore, this study proves that bioactive peptides obtained from fermented millet bran have a high antioxidant capacity.

millet bran; Bacillus natto; solid state fermentation; r esponse surface methodology; antioxidant peptides

10.7506/spkx1002-6630-201710012

TS209

A

1002-6630（2017）10-0066-08

韋濤, 周啟靜, 陸兆新, 等. 納豆芽孢桿菌固態(tài)發(fā)酵小米糠產(chǎn)抗氧化肽工藝優(yōu)化[J]. 食品科學(xué), 2017, 38(10): 66-73.

DOI:10.7506/spkx1002-6630-201710012. http://www.spkx.net.cn

WEI Tao, ZHOU Qijing, LU Zhaoxin, et al. Optimization of solid state fermentation conditions for production of antioxidant peptides from millet bran by Bacillus natto[J]. Food Science, 2017, 38(10): 66-73. (in Chinese with English abstract)

DOI:10.7506/spkx1002-6630-201710012. http://www.spkx.net.cn

2016-06-19

中央高?；究蒲袠I(yè)務(wù)費(fèi)重點(diǎn)項(xiàng)目（kyz201118）

韋濤（1990—），男，碩士研究生，主要從事食品生物技術(shù)研究。E-mail：2014108076@njau.edu.cn

*通信作者：趙海珍（1975—），女，教授，博士，主要從事食品生物技術(shù)研究。E-mail：zhaohz@njau.edu.cn

小米糠；納豆芽孢桿菌；固態(tài)發(fā)酵；響應(yīng)面法；抗氧化肽