NaClO脅迫下單核細(xì)胞增生李斯特菌WaX12及其sigB基因缺失突變株抗氧化脅迫相關(guān)功能基因表達(dá)比較

周 密，唐毓祎，王 旭，張煒佳，潘迎捷，趙 勇

（上海海洋大學(xué)食品學(xué)院，農(nóng)業(yè)部水產(chǎn)品貯藏保鮮質(zhì)量安全風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估實(shí)驗(yàn)室，水產(chǎn)品加工及貯藏工程技術(shù)研究中心，上海 201306）

NaClO脅迫下單核細(xì)胞增生李斯特菌WaX12及其sigB基因缺失突變株抗氧化脅迫相關(guān)功能基因表達(dá)比較

周 密，唐毓祎，王 旭，張煒佳，潘迎捷，趙 勇*

（上海海洋大學(xué)食品學(xué)院，農(nóng)業(yè)部水產(chǎn)品貯藏保鮮質(zhì)量安全風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估實(shí)驗(yàn)室，水產(chǎn)品加工及貯藏工程技術(shù)研究中心，上海 201306）

目的：探究單核細(xì)胞增生李斯特菌sigB基因?qū)Υ温人徕c（NaClO）脅迫的調(diào)控作用。方法：在半致死濃度NaClO（3 mmol/L）脅迫下，比較該菌野生株WaX12與sigB基因敲除突變株的耐受程度及菌內(nèi)的活性氧水平，并通過(guò)實(shí)時(shí)定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)技術(shù)（real-time quantitative polymerase chain reaction，RT-PCR）進(jìn)一步觀察lmo1433、lmo0906、lmo2344、ohrR、lmo2770基因隨脅迫時(shí)間的轉(zhuǎn)錄水平變化。結(jié)果：野生株和sigB突變株的表型測(cè)定結(jié)果顯示，野生株比缺失株更耐NaClO脅迫，而且此現(xiàn)象在穩(wěn)定期更加明顯；當(dāng)脅迫時(shí)間達(dá)到30 min時(shí)，突變株內(nèi)的活性氧水平增長(zhǎng)率比野生株高出19.97%，進(jìn)一步說(shuō)明sigB基因?qū)aClO脅迫有一定的調(diào)控作用。RT-PCR結(jié)果表明，基因lmo1433、lmo2344和ohrR在野生株的表達(dá)水平顯著高于突變株（P＜0.01），而基因lmo0906、lmo2770的表達(dá)水平在野生株和缺失株中的差異并不明顯。結(jié)論：研究表明，單核細(xì)胞增生李斯特菌sigB基因?qū)aClO脅迫有一定的影響作用，且部分作用可能由激活部分調(diào)節(jié)機(jī)體氧化還原平衡的基因得以實(shí)現(xiàn)。

Key words: Listeria monocytogenes; sigB; sodium hypochlorite; oxidative stress; RT-PCR

次氯酸鈉（NaClO）是一種高效廣譜的含氯消毒劑，它具有極強(qiáng)的氧化活性，能夠有效的消滅細(xì)菌、真菌及病毒等微生物[1-2]。NaClO不僅能夠破壞機(jī)體中的DNA、脂質(zhì)和蛋白質(zhì)等生物分子，還能與細(xì)胞質(zhì)中的Fe2＋發(fā)生芬頓反應(yīng)，生成具有細(xì)胞毒素的活性氧類(lèi)（reactive oxygen species，ROS）自由基[3-4]，從而造成細(xì)胞結(jié)構(gòu)破壞甚至細(xì)胞凋亡。此外，次氯酸也是機(jī)體的有效先天性防御成分 之一。具有防御功能的中性粒白細(xì)胞在捕獲到入侵的細(xì)菌后，髓過(guò)氧化物酶以氯和過(guò)氧化氫為底物，催化產(chǎn)生次氯酸并迅速引發(fā)細(xì)菌的中毒反應(yīng)[5]。

單核增細(xì)胞李斯特菌（Listeria monocytogenes）（以下簡(jiǎn)稱(chēng)單增李斯特菌）是一種人畜共患食源性致病菌。它廣泛存在于自然界，對(duì)不良環(huán)境有極強(qiáng)的耐受能力[6]。免疫力低下的人群易受單增李斯特菌感染，感染后會(huì)引發(fā)腦膜炎、敗血癥、流產(chǎn)等癥狀[7]。食物貯藏和加工環(huán)節(jié)中的消毒不徹底會(huì)造成單增李斯特菌食物污染事件甚至引起爆發(fā)流行[8]。σB（sigB）因子是普遍存在于革蘭氏陽(yáng)性菌中的環(huán)境調(diào)節(jié)因子。細(xì)胞通過(guò)調(diào)節(jié)級(jí)聯(lián)感應(yīng)外界脅迫并傳遞信號(hào)以激活sigB因子，進(jìn)而激活由sigB基因調(diào)控的基因組轉(zhuǎn)錄，隨后編碼蛋白執(zhí)行特定功能以保護(hù)細(xì)胞抵御外界脅迫[9-10]。sigB基因 在單增李斯特菌抵御酸、低溫、超高壓及氧化等脅迫中扮演了重要的角色[11-14]。

在單增李斯特菌中，受sigB調(diào)控的基因有150多個(gè)，但其中大部分基因編碼的蛋白質(zhì)功能仍不清楚[9]。同時(shí)，細(xì)菌抵御氧化脅迫是一個(gè)復(fù)雜的過(guò)程[15]，細(xì)胞中除一些可以直接分解氧化劑的酶如有機(jī)氫過(guò)氧化物酶（organic hydroperoxide resistance，Oh rR）外，細(xì)胞質(zhì)中大量存在的低密度巰基蛋白不但可以中和入侵的ROS，還可以通過(guò)酰胺化修飾激活抗氧化脅迫蛋白表達(dá)[16-18]。此外，具有修復(fù)功能的蛋白質(zhì)如硫氧還原蛋白、谷氧還原蛋白等能夠通過(guò)修復(fù)受損的核酸和蛋白質(zhì)來(lái)維持氧化脅迫下細(xì)菌體內(nèi)的代謝和蛋白質(zhì)平衡[19-20]。ClO－對(duì)巰基的選擇性攻擊會(huì)加劇細(xì)菌內(nèi)部的抗氧化脅迫蛋白聚合[21-22]。目前sigB基因?qū)ρ趸{迫的作用還沒(méi)有一致定論，一些研究表明sigB基因敲除菌株對(duì)氧化脅迫更加敏感[10,17]，而另一些研究則認(rèn)為sigB基因敲除菌株對(duì)氧化脅迫有更強(qiáng)的耐受能力[23]。

因此，本研究利用從豬肉中分離的單增李斯特菌Lm-WaX12菌株及構(gòu)建的sigB基因缺失菌株WaX12-ΔsigB，選取抗氧化脅迫相關(guān)基因：谷胱甘肽（glutathione，GSH）合成酶基因lmo2770、GSH還原酶基因lmo1433、lmo0906、lmo2344以及OhrR基因ohrR，通過(guò)比較2 株菌的表型及基因表達(dá)差異來(lái)探尋單增李斯特菌sigB基因?qū)aClO脅迫的氧化調(diào)控作用。

1 材料與方法

1.1 菌株與試劑

菌株WaX12為上海市蘆潮港菜市場(chǎng)購(gòu)買(mǎi)的生豬肉中分離的野生致病菌，經(jīng)過(guò)形態(tài)學(xué)分析、生化特性以及分子生物學(xué)鑒定，由上海海洋大學(xué)農(nóng)業(yè)部水產(chǎn)品貯藏保鮮質(zhì)量安全風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估實(shí)驗(yàn)室保藏；WaX12-ΔsigB由王旭構(gòu)建并提供[24]。

PrimeScriptt RT reagent反轉(zhuǎn)錄試劑盒 寶生物工程（大連）有限公司；RNA提取試劑盒 上海捷瑞生物工程公司；熒光定量SYBR Green Master 瑞士Roche公司；腦心浸液（brian heart infusion，BHI）培養(yǎng)基、PALCAM培養(yǎng)基 北京陸橋技術(shù)股份有限公司；NaClO、氮藍(lán)四唑（nitro-blue tetrazolium，NBT） 美國(guó)Sigma公司；甘油、丙酮、甲醇、無(wú)水乙醇、冰乙酸等均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

7500fast熒光定量?jī)x 美國(guó)ABI公司；多功能酶標(biāo)儀美國(guó)BioTek公司。

1.3 方法

1.3.1 培養(yǎng)條件

將單增李斯特菌WaX12及WaX12-ΔsigB接種至BHI液體培養(yǎng)基，37 ℃搖床培養(yǎng)過(guò)夜，按1∶100（V/V）接種于5 mL BHI液體培養(yǎng)基，37 ℃搖床培養(yǎng)備用。

1.3.2 生長(zhǎng)曲線(xiàn)的測(cè)定

分別將制備好的單增李斯特菌液進(jìn)行10 倍梯度稀釋?zhuān)俳臃N于10 mL BHI試管中，使初始接種量為104～105CFU/mL。將接種后的BHI試管放入37 ℃培養(yǎng)箱，每2 h取樣涂布于PALCAM平板，計(jì)數(shù)測(cè)定WaX12及WaX12-ΔsigB的生長(zhǎng)曲線(xiàn)。

1.3.3 NaClO半致死濃度確定

按照Primm等[25]的方法確定NaClO對(duì)單增李斯特菌WaX12及WaX12-ΔsigB的半致死濃度。將菌液接種到BHI液體培養(yǎng)基中，放入培養(yǎng)箱180 r/min、37 ℃培養(yǎng)16 h后離心，用生理鹽水漂洗并調(diào)OD600nm至0.630±0.025。用BHI稀釋菌液至OD600nm為0.025±0.005備用。在96 孔板內(nèi)每孔加入100 μL BHI液體培養(yǎng)基，取100 μL的0.96 mol/L NaClO加入第1排孔板中并依次對(duì)NaClO進(jìn)行2 倍稀釋。將10 μL稀釋好的菌液分別加入孔中，37 ℃過(guò)夜培養(yǎng)，測(cè)定菌體OD600nm，確定細(xì)菌的半致死濃度。

1.3.4 NaClO脅迫實(shí)驗(yàn)

將菌體接種至BHI液體培養(yǎng)基，在培養(yǎng)箱中37 ℃條件下，180 r/min好氧培養(yǎng)5 h或12 h，得到處于對(duì)數(shù)期及穩(wěn)定期的菌液，分別用生理鹽水漂洗并調(diào)整菌液濃度至OD600nm為0.63±0.02，取5 mL菌懸液，用半致死濃度的NaClO溶液按照不同的時(shí)間梯度（0、20、40、60、80、100 min）分別脅迫2 株菌，最后加入1 mL的0.5%的NaS2O3溶液作為猝滅劑終止反應(yīng)。反應(yīng)結(jié)束后，4 ℃、10 000×g離心1 min，將沉淀物用生理鹽水洗滌2 次，以去除殘余的NaClO。隨后，將細(xì)胞重懸于1 mL生理鹽水中，取10 μL菌液以不同的稀釋度點(diǎn)種于BHI培養(yǎng)基平板上測(cè)定單位體積菌落數(shù)。將平板放置在37 ℃條件下培養(yǎng)48 h，對(duì)平板上的菌落進(jìn)行計(jì)數(shù)。設(shè)2 個(gè)平行樣。用Excel軟件計(jì)算平均值和標(biāo)準(zhǔn)偏差。

1.3.5 細(xì)菌內(nèi)部的ROS水平測(cè)定

取0.1 mL的細(xì)菌懸浮液（OD600nm為1.0）于pH 7.5磷酸緩沖鹽溶液（phosphate buffer saline，PBS）中，與0.5 mL的NBT（1 mg/mL）混合，在37 ℃條件下培養(yǎng)30 min。加入0.1 mL HCl（0.1 mol/L）溶液，1 500×g離心10 min取沉淀，加入0.6 mL的二甲基亞砜以提取還原態(tài)的NBT，再加入0.8 mL PBS充分混勻，測(cè)定混合液的

1.3.6 引物設(shè)計(jì)及驗(yàn)證

根據(jù)NCBI中已經(jīng)公布的L. monocytogenes EGD-e全基因組序列，采用primer 5.0軟件設(shè)計(jì)ohrR、lmo1433、lmo0906、lmo2344、lmo2770基因的上游和下游序列的特異性引物，通過(guò)實(shí)時(shí)定量熒光PCR絕對(duì)定量的方法篩選出相關(guān)系數(shù)R2不小于0.95，且擴(kuò)增效率在95%～120%范圍內(nèi)的引物，所有引物均由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。

1.3.7 總RNA的提取及cDNA的合成

分別提取經(jīng)3 mmol/L NaClO脅迫不同時(shí)間（0、10、20、30 min）后的野生及突變株的菌體總RNA，RNA純化后用于cDNA的合成。將RNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA（2 μL RNA/20 μL體系），逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)按照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒的說(shuō)明書(shū)進(jìn)行，整個(gè)過(guò)程在冰上操作。

1.3.8 抗氧化脅迫功能蛋白基因的RT-PCR分析

表 1 RT-PCR引物Table 1 Primer sequences for RT-PCR amplification

引物見(jiàn)表1，實(shí)驗(yàn)采用gap為內(nèi)標(biāo)基因[24]，內(nèi)標(biāo)基因與目的基因各設(shè)3 個(gè)平行反應(yīng)管。實(shí)時(shí)定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（real-time quantitative polymerase chain reaction，RT-PCR）體系（20 μL）為：10 μL SYBR Solution、上下游引物各1 μL、cDNA 2 μL、無(wú)菌ddH2O 5 μL。反應(yīng)條件：95 ℃ 15 s；95 ℃ 15 s，60 ℃ 34 s，循環(huán)40 次；95℃ 15 s，60 ℃ 1 min讀取熒光值，同時(shí)進(jìn)行ROX值校正，最后進(jìn)行熒光PCR產(chǎn)物溶解曲 線(xiàn)分析。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

實(shí)驗(yàn)結(jié)果為3 次重復(fù)的平均值，采用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的統(tǒng)計(jì)與分析。檢驗(yàn)水準(zhǔn)為0.05，運(yùn)用最小顯著性差異（least signi cant difference，LSD）法比較，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果與分析

2.1 NaClO脅迫下的不同生長(zhǎng)期的單增李斯特菌WaX12及WaX12-ΔsigB的生長(zhǎng)差異

圖 1 野生株WaX12及WaX12-ΔsigB的生長(zhǎng)曲線(xiàn)Fig. 1 Growth curves of the wild-type strain (WaX12) and the mutant (WaX12-ΔsigB)

將WaX12及WaX12-Δ sigB接種至BHI液體培養(yǎng)基中，初始接菌量為104～105CFU/mL，每2 h取樣涂布于PALCAM平板，計(jì)數(shù)測(cè)定WaX12及WaX12-Δ sigB的生長(zhǎng)曲線(xiàn)。如圖1所示，WaX12-Δ sigB與WaX12生長(zhǎng)情況相似，表明sigB基因并不影響WaX12-Δ sigB菌株正常生長(zhǎng)。

圖 2 不同濃度NaClO脅迫下野生株WaX12及WaX12-ΔsigB OD600nm的變化情況Fig. 2 OD600nmof the wild-type (WaX12) and the mutant (WaX12-ΔsigB) at different concentrations of NaClO stress

由圖2可知，單增李斯特菌WaX12對(duì)NaClO的抵御能力略高于WaX12-Δ sigB，但兩者的半致死濃度（3 mm ol/L）并無(wú)明顯差異。

圖 3 野生株和突變株在對(duì)數(shù)期（A）和穩(wěn)定期（B）不同NaClO脅迫時(shí)間下的菌體濃度Fig. 3 Cell density of the wild-type and mutant strains at the log (A) and stationary (B) growth phases as a function of 0.03 mol/L NaClO stress time

由圖3A可知，脅迫60 min時(shí)，在對(duì)數(shù)時(shí)期的野生株的菌體濃度降低至（8.51±0.06）（lg（CFU/mL）），同一時(shí)期突變株的菌體濃度為（6.4 7±0.0 7）（lg（CFU/mL））。而在圖3B中，脅迫40 min時(shí)，穩(wěn)定期的野生株和突變株的菌體濃度分別為（8.68±0.06）（lg（CFU/mL））、（6.16±0.23）（lg（CFU/mL））。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明突變株對(duì)NaClO脅迫更加敏感，這一現(xiàn)象在穩(wěn)定期更加明顯。

2.2 NaClO脅迫下的單增李斯特菌WaX12及WaX12-ΔsigB體內(nèi)的ROS水平比較

圖4為穩(wěn)定期野生株和突變株在不同脅迫時(shí)間下細(xì)菌內(nèi)部的ROS水平增長(zhǎng)率變化。脅迫時(shí)間為10 min時(shí)，兩菌胞內(nèi)的ROS水平增長(zhǎng)率無(wú)明顯差異。當(dāng)脅迫時(shí)間為20、30 min以及40 min時(shí)，突變株胞內(nèi)的ROS增長(zhǎng)水平較野生株呈現(xiàn)明顯差異（P＜0.01）。其中在脅迫時(shí)間達(dá)到30 min時(shí)，兩者之間的ROS水平增長(zhǎng)率差異達(dá)到最大，突變株內(nèi)的ROS增長(zhǎng)水平比野生株高出（19.97±3.14）%。

圖 4 野生株和突變株在不同NaClO脅迫時(shí)間下的ROS水平增長(zhǎng)率變化Fig. 4 Percent increase in ROS levels in the wild-type and mutant strains as a function of NaClO stress time

2.3 NaClO脅迫下的單增李斯特菌WaX12及WaX12-ΔsigB與抗氧化脅迫相關(guān)基因表達(dá)水平比較

表 2 引物的擴(kuò)增效率及擬合優(yōu)度Table 2 Amplification efficiency values and fitness for target genes

在提取野生株和突變株在不同脅迫時(shí)間下（10、20、30 min）的總RNA后，以未經(jīng)脅迫的細(xì)菌為參照，通過(guò)RT-PCR相對(duì)定量法觀察sigB、lmo1433、lmo0906、lmo2344、ohrR和lmo2770隨脅迫時(shí)間的轉(zhuǎn)錄水平變化。根據(jù)NCBI中已經(jīng)公布的L. monocytogenes EGD-e全基因組序列，采用primer 5.0軟件設(shè)計(jì)ohrR、lmo1433、lmo0906、lmo2344、lmo2770基因的上游和下游序列的特異性引物，通過(guò)RT-PCR絕對(duì)定量的方法篩選出擬合優(yōu)度R2不小于0.95，且擴(kuò)增效率在95%～120%范圍內(nèi)的引物（表2）。

圖 5 野生株和突變株在不同時(shí)間的NaClO脅迫下基因sigB（A）、lmo1433（B）、lmo0906（C）、lmo2344（D）、lmo2770（E）、ohrR（F）的相對(duì)表達(dá)水平Fig. 5 Relative expression levels of sigB (A), lmo1433 (B), lmo0906 (C), lmo2344 (D), lmo2770 (E), and ohrR (F) during different sodium hypochlorite stress in the wild-type and mutant strains

圖5 A為野生株sigB基因的表達(dá)情況，sigB基因的表達(dá)量在菌體受到脅迫后明顯增加，在脅迫30 min時(shí)相對(duì)表達(dá)量達(dá)到3.56±0.96。用0.03 mol/L NaClO分別脅迫野生株和突變株，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，野生株的lmo1433基因表達(dá)量顯著高于突變株，差異在脅迫30 min時(shí)達(dá)到最大（圖5B）。而GSH還原酶基因lmo0906在野生株和突變株中的表達(dá)量差異并不明顯（圖5C）。圖5D中，NaClO脅迫下野生株的lmo2344基因的表達(dá)水平在脅迫20、30 min時(shí)均顯著高于突變株。GSH合成酶lmo2770基因在NaClO脅迫后兩株菌的表達(dá)量均較低且差異不明顯（圖5E）。此外，基因ohrR在WaX12野生株受到NaClO脅迫中有較高的表達(dá)量，NaClO脅迫30 min突變株的表達(dá)量（18.86±2.93）顯著高于缺失株的表達(dá)量（1.61±0.09）（P＜0.01）（圖5F）。

3 討 論

NaClO具有極強(qiáng)的氧化性，能夠迅速對(duì)微生物造成氧化損傷[1]。單增李斯特菌對(duì)外界的氧化脅迫有良好的適應(yīng)性，其重要壓力調(diào)控基因sigB在菌體抵御不良環(huán)境的脅迫中扮演了重要的角色。然而，sigB基因?qū)ρ趸{迫，尤其對(duì)NaClO的脅迫的調(diào)控機(jī)理尚不明確。為了探究sigB基因在機(jī)體抵御NaClO的脅迫中的調(diào)控作用，比較了單增李斯特菌野生株WaX12與突變株在受到NaClO脅迫的表型及重要抗氧化脅迫基因的差異表達(dá)。

本研究發(fā)現(xiàn)，相同濃度NaClO（3 mmol/L）脅迫下，野生株的菌體濃度明顯高于突變株，這種差異在穩(wěn)定期更加顯著。說(shuō)明sigB基因在穩(wěn)定期對(duì)NaClO脅迫有更強(qiáng)的耐受能力（圖3），同樣的現(xiàn)象也出現(xiàn)在單增李斯特菌面對(duì)酸、高滲透壓脅迫中[11,27]。在進(jìn)一步的研究中，比較了野生株和突變株在NaClO脅迫下的胞內(nèi)ROS水平增長(zhǎng)率差異，發(fā)現(xiàn)NaClO脅迫下的野生株體內(nèi)的ROS水平 增長(zhǎng)率較突變株更低（圖4）。這一現(xiàn)象說(shuō)明缺失株在NaClO脅迫下產(chǎn)生了更多的ROS。NaClO脅迫會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)部ROS水平增加，從而對(duì)細(xì)菌造成傷害，而細(xì)菌體內(nèi)的防御機(jī)制能夠在一定程度上降低胞內(nèi)ROS水平[19-20]。結(jié)果表明sigB基因?qū)aClO的部分調(diào)控作用可能通過(guò)激活調(diào)節(jié)機(jī)體氧化還原平衡基因來(lái)實(shí)現(xiàn)。

進(jìn)一步研究了sigB基因?qū)ρ趸{迫的調(diào)控作用，提取了穩(wěn)定期細(xì)菌在半致死濃度NaClO不同脅迫時(shí)間下的總RNA，運(yùn)用熒光定量PCR的方法觀察野生株和突變株在NaClO脅迫下基因輪廓的變化。結(jié)果顯示，野生株的sigB基因在NaClO脅迫下的表達(dá)活躍（圖5A），說(shuō)明sigB基因在NaClO脅迫中扮演了重要的角色。此外，GSH還原酶基因lmo1433lmo2344及OhrR基因ohrR在NaClO脅迫下的野生株中有較高的表達(dá)量，且表達(dá)量顯著高于突變株（P＜0.01）。而GSH還原酶基因lmo0906及GSH合成酶基因lmo2770表達(dá)量在野生株和突變株中均較低，且沒(méi)有顯著差異（圖5）。在單增李斯特菌中，GSH、OhrR、lmo2344是重要的抗氧化脅迫蛋白。GSH是一種低密度巰基蛋白，它不但能夠中和入侵的ROS，還可以通過(guò)谷氨酰胺化修飾激活抗氧化相關(guān)蛋白表達(dá)[16-18]。GSH合成需要GSH合成酶（lmo2770）的參與[28]，NaClO脅迫能夠?qū)SH氧化成氧化型谷胱甘肽（glutathione disulfide，GSSG），但這一反應(yīng)是可逆的，GSSG在GSH還原酶（lmo1433、lmo0906）的作用下能重新生成GSH[17]。OhrR是一種重要的抗氧化脅迫蛋白，在枯草芽孢桿菌中，ohrR基因在NaClO脅迫后的表達(dá)量高達(dá)220 倍[17]。此外lmo2344是重要的抗氧化還原蛋白，能夠還原部分重要蛋白在氧化脅迫過(guò)程產(chǎn)生的二硫鍵以維持機(jī)體氧化還原水平平衡[29]。本研究發(fā)現(xiàn)，sigB基因雖對(duì)lmo0906和lmo2344轉(zhuǎn)錄無(wú)影響，但對(duì)ohrR、lmo2344及l(fā)mo1433有正向調(diào)控作用。因此推測(cè)，sigB對(duì)GSH合成沒(méi)有直接影響，而通過(guò)調(diào)控基因lmo1433而不是lmo0906還原NaClO脅迫造成的GSH氧化傷害。sigB基因除了本身參與抗NaClO脅迫外，在單增李斯特菌抗氧化體系中發(fā)揮了重要的作用。

4 結(jié) 論

本研究通過(guò)比較單增李斯特菌WaX12-sigB缺失株和野生株在抵御NaClO脅迫過(guò)程中基因表達(dá)輪廓差異，從基因角度初步闡釋了單增李斯特菌sigB基因?qū)Φ恼{(diào)控作用。并發(fā)現(xiàn)sigB基因?qū)SH系統(tǒng)中谷氧還原蛋白和GSH還原酶基因lmo1433及重要的抗氧化基因ohrR有顯著的影響作用。不足的是，有研究表明sigB基因?qū)?xì)菌遭遇NaClO氧化脅迫的調(diào)控作用也可能受NaClO脅迫下產(chǎn)生的非氧化損傷影響[7]，而本研究只觀察了sigB因子對(duì)氧化脅迫基因的調(diào)控作用。后續(xù)將進(jìn)一步從NaClO脅迫產(chǎn)生的非氧化損傷的角度完善單增李斯特菌sigB基因?qū)aClO脅迫的調(diào)控機(jī)制研究。

[1] GOMES B P F A, MARTINHO F C, VIANNA M E. Comparison of 2.5% sodium hypochlorite and 2% chlorhexidine gel on oral bacterial lipopolysaccharide reduction from primarily infected root canals[J]. Journal of Endodontics, 2009, 35(10): 1350-1353. DOI:10.1016/ j.joen.2009.06.011.

[2] 姜曉杰, 王文杰, 祁美榮, 等. 一種含氯消毒液殺菌效果觀察[J].中國(guó)消毒學(xué)雜志, 2013(2): 112-113.

[3] ROSEN H, KLEBANOFF S J, WANG Y, et al. Methionine oxidation contributes to bacterial killing by the myeloperoxidase system of neutrophils[J]. PNAS, 2009, 106(44): 18686-18691. DOI:10.1073/ pnas.0909464106.

[4] LEICHERT L I, GEHRKE F, GUDISEVA H V, et al. Quantifying changes in the thiol redox proteome upon oxidative stress in vivo[J]. PNAS, 2008, 105(24): 8197-8202. DOI:10.1073/pnas.0707723105.

[5] GREEN J N, KETTLE A J, WINTERBOURN C C. Protein chlorination in neutrophil phagosomes and correlation with bacterial killing[J]. Free Radical Biology and Medicine, 2014, 77: 49-56. DOI:10.1016/j.freeradbiomed.2014.08.013.

[6] SONI KA, NANNAPANENI R, TASARA T. The contribution of transcriptomic and proteomic analysis in elucidating stress adaptation responses of Listeria monocytogenes[J]. Foodborne Pathogens and Disease, 2011, 8(8): 843-852. DOI:10.1089/fpd.2010.0746.

[7] 吳淑燕, 張超, 陳國(guó)薇, 等. 單增李斯特菌入侵宿主分子機(jī)理研究進(jìn)展[J]. 食品科學(xué), 2014, 35(19): 290-294. DOI:10.7506/spkx1002-6630-201419058.

[8] WELCH D F, SWORD C P, BREHM S, et al. Relationship between superoxide dismutase and pathogenic mechanisms of Listeria monocytogenes[J]. Infection and Immunity, 1979, 23(3): 863-872.

[9] van SCHAIK W, ABEE T. The role of sigmab in the stress response of Gram-positive bacteria-targets for food preservation and safety[J]. Current Opinion in Biotechnology, 2005,16(2): 218-224. DOI:10.1016/ j.copbio.2005.01.008.

[10] FERREIRA A, OBYRNE C P, BOOR K J. Role of σBin heat, ethanol, acid, and oxidative stress resistance and during carbon starvation in Listeria monocytogenes[J]. Applied and Environmental Microbiology, 2001, 67(10): 4454-4457. DOI:10.1128/aem.67.10.4454-4457.2001.

[11] HUANG Y N, ELLS T C, HANSEN L T. Role of sigB and osmolytes in desiccation survival of Listeria monocytogenes in simulated food soils on the surface of food grade stainless steel[J]. Food Microbiology, 2015, 46: 443-451. DOI:10.1016/j.fm.2014.09.007.

[12] 王莉, 馮飛飛, 張強(qiáng), 等. Sigma B對(duì)單核細(xì)胞增生李斯特菌耐受抗生素作用的影響[J]. 微生物學(xué)雜志, 2011, 31(2): 1-6. DOI:10.3969/ j.issn.1005-7021.2011.02.001.

[13] 莘似韻, 孫曉紅, 萬(wàn)群, 等. 超高壓對(duì)單增李斯特菌sigB基因缺失菌株及其生物被膜形成能力的影響[J/OL]. 山東農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版), (2016-05-30)[2016-08-01]. http://kns.cnki.net/kcms/ detail/37.1132.S.20160530.1547.004.html.

[14] 付嬌嬌, 王旭, 劉海泉, 等. 不同培養(yǎng)條件下sigB對(duì)單增李斯特菌生物被膜形成的影響[J]. 上海海洋大學(xué)學(xué)報(bào), 2016, 25(4): 634-640. DOI:10.12024/jsou.20151201610.

[15] HENNINGHAM A, DOHRMANN S, NIZET V, et al. Mechanisms of group a Streptococcus resistance to reactive oxygen species[J]. FEMS Microbiology Reviews, 2015, 39(4): 488-508. DOI:10.1093/femsre/ fuu009.

[16] CHI B K, BUSCHE T, van LAER K, et al. Protein S-mycothiolation functions as redox-switch and thiol protection mechanism in Corynebacterium glutamicum under hypochlorite stress[J]. Antioxid Redox Signal, 2014, 20(4): 589-605. DOI:10.1089/ars.2013.5423.

[17] CHI B K, GRONAU K, MADER U, et al. S-bacillithiolation protects against hypochlorite stress in Bacillus subtilis as revealed by transcriptomics and redox proteomics[J]. Molecular and Cellular Proteomics, 2011, 10(11): M111. DOI:10.1074/mcp.M111.009506.

[18] MASIP L, VEERAVALLI K, GEORGIOU G. The many faces of glutathione in bacteria[J]. Antioxid Redox Signal, 2006, 8(5/6): 753-762. DOI:10.1089/ars.2006.8.753.

[19] SUO Y J, HUANG Y Y, LIU Y H, et al. The expression of superoxide dismutase (SOD) and a putative abc transporter permease is inversely correlated during biofilm formation in Listeria monocytogenes 4b G[J]. PLoS ONE, 2012, 7(10): e48467. DOI:10.1371/journal.pone.0048467.

[20] DAHL J U, GRAY M J, JAKOB U. Protein quality control under oxidative stress conditions[J]. Journal of Molecular Biology, 2015, 427(7): 1549-1563. DOI:10.1016/j.jmb.2015.02.014.

[21] DAVIES M J. The oxidative environment and protein damage[J]. Biochimica et Biophysica Acta-Proteins and Proteomics, 2005, 1703(2): 93-109. DOI:10.1016/j.bbapap.2004.08.007.

[22] IMLAY J A. Pathways of oxidative damage[J]. Annual Review of Microbiology, 2003, 57: 395-418. DOI:10.1146/annurev. micro.57.030502.090938.

[23] MOORHEAD S M, DYKES G A. The role of the sigB gene in the general stress response of Listeria monocytogenes varies between a strain of serotype 1/2a and a strain of serotype 4c[J]. Current Microbiology, 2003, 46(6): 461-466. DOI:10.1007/s00284-002-3867-6.

[24] 王旭, 孫曉紅, 潘迎捷, 等. 單增李斯特菌Wax12及其sigB缺失突變株在不同pH下生長(zhǎng)動(dòng)力學(xué)的比較[J]. 食品與生物技術(shù)學(xué)報(bào), 2016, 35(5): 477-484. DOI:10.3969/j.issn.1673-1689.2016.05.005.

[25] PRIMM T P, FRANZBLAU S G. Recent advances in methodologies for the discovery of antimycobacterial drugs[J]. Current Bioactive Compounds, 2007, 3(3): 201-208. DOI:10.2174/157340707781695550.

[26] P?EZ P L, BECERRA M C, ALBESA I. Effect of the association of reduced glutathione and ciprofloxacin on the antimicrobial activity in Staphylococcus aureus[J]. FEMS Microbiology Letters, 2010, 303(1): 101-105. DOI:10.1111/j.1574-6968.2009.01867.x.

[27] ABRAM F, STARR E, KARATZAS K A, et al. Identification of components of the Sigma B regulon in Listeria monocytogenes that contribute to acid and salt tolerance[J]. Applied and Environmental Microbiology, 2008, 74(22): 6848-6858. DOI:10.1128/AEM.00442-08.

[28] van LOI V, ROSSIUS M, ANTELMANN H. Redox regulation by reversible protein S-thiolation in bacteria[J]. Frontiers in Microbiology, 2015, 6: 187. DOI:10.3389/fmicb.2015.00187.

[29] GLEASON F K, ARNE H. Thioredoxin and related proteins in procaryotes[J]. FEMS Microbiology Letters, 1988, 54(4): 271-297. DOI:10.1016/0378-1097(88)90247-9.

Comparative Analysis of the Expression of Antioxidation Related Genes in Listeria monocytogenes WaX12 and Its sigB Gene Deletion Mutant under Sodium Hypochlorite Stress

ZHOU Mi, TANG Yuyi, WANG Xu, ZHANG Weijia, PAN Yingjie, ZHAO Yong*
(Shanghai Engineering Research Center of Aquatic-Product Processing & Preservation, Laboratory of Quality Safety Risk Assessment for Aquatic Products on Storage and Preservation, Ministry of Agriculture, College of Food Science & Technology, Shanghai Ocean University, Shanghai 201306, China)

Objective: The purpose of this study w as to explore whether the sigB gene palyed a regulatory role in Listeria monocytogenes (Lm) exposed to sodium hypochlorite stress. Methods: We studied the phenotypic changes and compared the percent increases in reactive oxygen species (ROS) levels in the wild-type Lm WaX12 and its sigB deletion mutant under sodium hypochlorite stress at the median lethal concentration (3 mmol/L). The changes in the transcriptional leve ls of lmo1433, lmo0906, lmo2344, ohrR and lmo2770 genes were investigated during sodium hypochlorite stress. Results: The wild-type strain p resented a stronger tolerance to sodium hypochlorite stress than the mutant, especailly during the stationary growth phase. The percent increase in ROS levels in the wild-type strain was 19.97% higher than that in the mutant after 30 min of sodium hypochlorite stress, confirming the regulatory role of the sigB gene in Lmunder sodium hypochlorite stress. Moreover, the relative expression levels of lmo1433, lmo2344 and ohrR genes in the wild-type strain were much higher than those in the mutant (P ＜ 0.01), as revealed by RT-PCR. No significant differences in the expression levels of lmo0906 and lmo2770 were found between the wild-type and mutant strains. Conclusion: The sigB gene plays an important regulatory role in Lm exposed to NaClO stress, which may be partially achieved by directly or indirectly activating some genes regulating the redox balance in the body.

2016-09-01

國(guó)家自然科學(xué)基金面上項(xiàng)目（31271870；31571917）；上海市科委計(jì)劃項(xiàng)目（14DZ1205100；14320502100）；上海市科技興農(nóng)重點(diǎn)攻關(guān)項(xiàng)目（滬農(nóng)科攻字2014第3-5號(hào)；2015第4-8號(hào)）；上海市科委工程中心建設(shè)項(xiàng)目（11DZ2280300）

周密（1991—），女，碩士，研究方向?yàn)槭吃葱灾虏【-mail：meechyou@163.com

*通信作者：趙勇（1975—），男，教授，博士，研究方向?yàn)槭吃葱灾虏【目焖贆z測(cè)技術(shù)、高效防控技術(shù)及其風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估。E-mail：yzhao@shou.edu.cn

10.7506/spkx1002-6630-201710009

TS20

A

1002-6630（2017）10-0049-06

周密, 唐毓祎, 王旭, 等. NaClO脅迫下單核細(xì)胞增生李斯特菌WaX12及其sigB基因缺失突變株抗氧化脅迫相關(guān)功能基因表達(dá)比較[J]. 食品科學(xué), 2017, 38(10): 49-54. DOI:10.7506/spkx1002-6630-201710009. http://www.spkx.net.cn

ZHOU Mi, TANG Yuyi, WANG Xu, et al. Comparative analysis of the expression of antioxidation related genes in Listeria monocytogenes WaX12 and its sigB gene deletion mutant under sod ium hypochlorite stress[J]. Food Science, 2017, 38(10): 49-54. (in Chinese with English abstract)

10.7506/spkx1002-6630-201710009. http://www.spkx.net.cn

單增李斯特菌；sigB；NaClO；氧化脅迫；RT-PCR