蟠桃褐腐病原菌生物學(xué)特性及細(xì)胞壁降解酶活性

宋丹丹，孔慶軍，李鴻彬，任雪艷,*

蟠桃褐腐病原菌生物學(xué)特性及細(xì)胞壁降解酶活性

宋丹丹1，孔慶軍2，李鴻彬1，任雪艷2,*

（1.石河子大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，新疆 石河子 832003；2.陜西師范大學(xué)食品工程與營(yíng)養(yǎng)科學(xué)學(xué)院，陜西 西安 710062）

由桃褐腐病原菌（Monilinia fructicola）引起的蟠桃褐腐病是蟠桃采后主要的病害，造成水果采后損失嚴(yán)重。同時(shí)，M. fructicola引起果實(shí)采后疾病的發(fā)生，因宿主不同，其致病性也不盡相同。以M. fructicola為對(duì)象，研究其在不同環(huán)境條件（溫度、pH值、光照條件）下的生物學(xué)特性和不同培養(yǎng)條件（溫度、pH值、培養(yǎng)時(shí)間）對(duì)M. fructicola自身產(chǎn)生的細(xì)胞壁降解酶活性的影響。結(jié)果表明：M. fructicola孢子萌發(fā)和芽管延長(zhǎng)的最適pH值為5.0，且偏弱酸性環(huán)境更適宜其生長(zhǎng)，但是過(guò)酸環(huán)境其孢子萌發(fā)率明顯降低；菌落生長(zhǎng)的最適溫 度范圍為20～28 ℃，高于36 ℃，則菌不能正常生長(zhǎng)；溫度會(huì)影響菌落形態(tài)，溫度不同，則菌落形態(tài)不同；光照對(duì)菌落生長(zhǎng)影響甚微；內(nèi)切葡聚糖酶（endoglucanase，EG）、β-葡萄糖苷酶（β-glucosi dase，BG）、果膠甲基半乳糖醛酸酶（polymethylgalacturonase，PMG）、多聚半乳糖醛酸酶（polygalacturonase，PG）活力均在28 ℃ 條件下最 高；pH 6.0時(shí)EG、BG酶活力均達(dá)到最高；PMG、PG酶活力在pH 7.0時(shí)達(dá)到最高；EG、BG、PMG、PG在培養(yǎng)5 d時(shí)的酶活力最高；在各pH值、溫度、培養(yǎng)時(shí)間條件下，BG酶活力高于EG酶活力，PG酶活力 高于PMG酶活力。

桃褐腐病原菌；生物學(xué)特性；細(xì)胞壁降解酶活力；培養(yǎng)條件

蟠桃（Amygdalus persica Linn. var. compressa）別名仙桃，因形美色艷、味佳肉細(xì)、汁多甘厚、味濃香溢、營(yíng)養(yǎng)豐富而受到人們的青睞，熱銷(xiāo)港外。蟠桃采收后會(huì)迅速進(jìn)入呼吸高峰期，果實(shí)采后由真菌引起的果實(shí)的腐敗變質(zhì)，使果實(shí)在流通過(guò)程中難以貯藏，從而導(dǎo)致鮮桃出口量與出口額的下降[1-2]。桃褐腐病是由鏈核盤(pán)菌屬（Monilinia. spp）引起的主要水果采后疾病，對(duì)采后水果的感染率極高，直接影響果實(shí)的口感、品質(zhì)、銷(xiāo)量，造成了極大的經(jīng)濟(jì)損失[3-4]。

桃褐腐菌分為美澳型核果褐腐菌（Monilinia fructicola）、核果褐腐菌（M. laxa）和仁果褐腐菌（M. fiuctigena）三大類(lèi)[3]。其中，M. fructicola在我國(guó)廣泛分布[4]。致病過(guò)程中病原菌產(chǎn)生的細(xì)胞壁降解酶，如纖維素酶、果膠酶、角質(zhì)酶等，是使桃果實(shí)發(fā)病的因素之一[5-6]。

纖維素酶是一類(lèi)能夠分解纖維素的酶的總稱(chēng)，包括水解酶類(lèi)，一般分為葡聚糖內(nèi)切酶（1,4-β-D-glucan glucanohydrolase，真菌產(chǎn)生簡(jiǎn)稱(chēng)EG，細(xì)菌產(chǎn)生簡(jiǎn)稱(chēng)Cx）、葡聚糖外切酶（1,4-β-D-glucan cellobilhydrolase，Cl）和β-葡萄糖苷酶（β-1,4-glucosidase，BG）[7-8]。內(nèi)切葡聚糖酶，破壞β-1,4-葡萄糖苷鍵，形成大量纖維寡糖、葡萄糖和纖維二糖，包括多個(gè)組分，專(zhuān)一性不強(qiáng)。外切葡聚糖酶，此酶作用時(shí)每次水解下一個(gè)纖維二糖單位，單獨(dú)作用于天然纖維素時(shí)，幾乎無(wú)還原糖生成。β-葡萄糖苷酶，是一種能夠水解還原性的β-D-葡萄糖苷鍵的水解酶，在食品風(fēng)味的改善及纖維素降解等領(lǐng)域具有重要的應(yīng)用價(jià)值[9]。纖維素酶各酶組分單獨(dú)作用時(shí)效果不是很強(qiáng)，但當(dāng)它們協(xié)同作用時(shí)卻表現(xiàn)出很強(qiáng)的分解活性[10]。

果膠酶是一類(lèi)能夠分解果膠類(lèi)物質(zhì)的酶的總稱(chēng)，含有多種組分的復(fù)合酶。其廣泛分布于植物和微生物中，在某些原生動(dòng)物和昆蟲(chóng)中也有發(fā)現(xiàn)。自然界微生物中，細(xì)菌、放線菌、酵母和霉菌都能夠分泌果膠酶。常見(jiàn)的果膠酶有多聚半乳糖醛酸酶（polygalacturonase，PG）、果膠酯酶（pectinesterase，PE）、聚甲基半乳糖醛酸酶（polymethylgalacturonase，PMG）、聚甲基半乳糖醛酸裂解酶（polymethylgalacturonate lyase，PMGL）和聚半乳糖醛酸裂解酶（polygalacturonate lyase，PGL）。PG是一種在細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)的改變中起重要作用的酶，主要功能是將果實(shí)中果膠的主要成分，即多聚半乳糖醛酸降解為半乳糖醛酸，使細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)解體，導(dǎo)致果實(shí)軟化[11]。PMG是一種專(zhuān)一水解底物糖苷鍵的水解酶，對(duì)底物的酯化程度具有選擇性，以酯含量高的果膠酯酸為底物。

本實(shí)驗(yàn)所用病原菌是從蟠桃病果上分離得到的，經(jīng)形態(tài)學(xué)和分子生物學(xué)鑒定為M. fructicola，屬于鏈核盤(pán)菌屬。鏈核盤(pán)菌屬病菌是影響核果果實(shí)貨架期的主要真菌病害之一。國(guó)內(nèi)外對(duì)核果果實(shí)褐腐病害采后病理生理和采后病害控制技術(shù)方面已做了大量的研究[12-13]，而對(duì)胞壁降解酶活力、致病機(jī)理及環(huán)境條件對(duì)細(xì)胞壁降解酶的影響研究較少。所以，探索在可控條件下的菌絲生長(zhǎng)和孢子萌發(fā)的最適環(huán)境條件及不同培養(yǎng)條件下病原菌細(xì)胞壁降解酶活力，以掌握病原菌在致病過(guò)程中，主要致病因子及菌生長(zhǎng)狀況的動(dòng)態(tài)變化，有利于進(jìn)一步解釋其致病的機(jī)制，也有利于在采后儲(chǔ)存和運(yùn)輸過(guò)程中控制環(huán)境條件來(lái)降低蟠桃褐腐病發(fā)生的可能性。

1 材料與方法

1.1 材料與菌種

蟠桃為市購(gòu)，挑選大小及成熟度較為均一、無(wú)病蟲(chóng)害且無(wú)機(jī)械損傷的果實(shí)。

美澳型核果褐腐菌（M. fructicola）由蟠桃褐腐病病果上分離純化得到。

1.2 試劑與培養(yǎng)基

3,5-二硝基水楊酸（3,5-dinitrosalicylic acid，DNS） 上海科豐實(shí)業(yè)有限公司；苯酚、酒石酸鉀鈉、HCl、醋酸鈉天津市天力化學(xué)試劑有限公司；乙二胺四乙酸二鈉 天津市永晟精細(xì)化工有限公司；連苯三酚 上海晶都生物技術(shù)有限公司；三羥甲基氨基甲烷北京廣達(dá)恒益科技有限公司；醋酸 天津市富宇精細(xì)化工有限公司；水楊苷 成都埃法生物科技有限公司；多聚半乳糖醛酸上海拓旸生物科技有限公司；柑橘果膠 上海莼試生物技術(shù)有限公司；Tris 北京博奧拓達(dá)科技有限公司。

馬鈴薯葡萄糖（potato dextrose，PDB）培養(yǎng)基：馬鈴薯200 g、葡萄糖20 g、瓊脂18 g、蒸餾水1 000 mL，自然pH值。

馬鈴薯葡萄糖瓊脂（potato dextrose agar，PDA）培養(yǎng)基：PDB中加入瓊脂18 g。

纖維素酶培養(yǎng)液[14]：羧甲基纖維素鈉鹽0.5 g、KH2PO40.5 g、CaCl20.5 g、VB10.5 g、MgCl22 mmol、酵母粉5.0 g、酒石酸銨0.5 g、蒸餾水1 000 mL。

果膠酶培養(yǎng)液[15]：KNO32.0 g、K2HPO41.0 g、KCl 0.5 g、MgSO4·7H2O 0.5 g、L-天冬酰胺0.5 g、FeSO40.01 g、VB10.2 mg、羧甲基纖維素鈉鹽10.0 g、蒸餾水1 000 mL。

1.3 儀器與設(shè)備

LDZX-30KBS型立式壓力蒸汽滅菌器 上海申安醫(yī)療器械廠；YT-L5-2D型超凈工作臺(tái) 北京亞泰科隆儀器技術(shù)有限公司；DH4000Ⅱ型電熱恒溫培養(yǎng)箱天津市泰勒斯儀器有限公司；ZD-85A型雙功能恒溫氣浴搖床 江蘇省金壇市友聯(lián)儀器研究所；ML104型電子天平、Orion Star A111型臺(tái)式pH計(jì) 梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司；ME21（MSHOT）型數(shù)碼生物顯微鏡 日本奧林巴斯公司；XB-K-25型血球計(jì)數(shù)板上海求精實(shí)業(yè)有限公司；XL30 ESEM型環(huán)境掃描電鏡荷蘭Philips公司；冷凍高速離心機(jī) 賽默飛世爾科技有限公司；電熱恒溫水浴鍋 上?？坪銓?shí)業(yè)發(fā)展有限公司；全波長(zhǎng)酶標(biāo)儀 美國(guó)熱電公司。

1.4 方法

1.4.1 生物特性的測(cè)定

1.4.1.1 pH值和萌發(fā)時(shí)間對(duì)M. fructicola孢子萌發(fā)及芽管延長(zhǎng)的影響

向50 mL PDB培養(yǎng)液的錐形瓶中加入孢子懸浮液使其終濃度為6×105個(gè)/mL，于28 ℃、130 r/min搖床培養(yǎng)5、7、9、11 h后用顯微鏡進(jìn)行鏡檢，計(jì)算孢子萌發(fā)率及芽管延長(zhǎng)的長(zhǎng)度（萌發(fā)標(biāo)準(zhǔn)是芽管長(zhǎng)度超過(guò)孢子本身直徑的一半）。每個(gè)處理重復(fù)3 次。

1.4.1.2 溫度和光照對(duì)病原菌M. fructicola生長(zhǎng)的影響

在培養(yǎng)7 d的M. fructicola PDA平板上切取5 mm菌塊接種到新PDA培養(yǎng)皿中，設(shè)計(jì)光照（太陽(yáng)光）、黑暗2 個(gè)處理，并分別在20、24、28、32、36 ℃條件下培養(yǎng)，在2、3、4、6 d后分別測(cè)量不同溫度條件下菌落生長(zhǎng)直徑并作記錄。每個(gè)處理重復(fù)3 次。

1.4.2 酶活力的測(cè)定

1.4.2.1 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作

準(zhǔn)確稱(chēng)取100 mg葡萄糖（預(yù)先在105 ℃烘干至恒質(zhì)量），用去離子水溶解后定容至100 mL，得到葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液。取標(biāo)準(zhǔn)溶液0、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1.0 mL，加蒸餾水定容至2 mL，再分別加入3 mL DNS試劑，混勻后沸水浴5 min，立即冷卻至室溫，加蒸餾水至25 mL，搖勻，540 nm波長(zhǎng)處測(cè)吸光度，以此制作葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算出回歸方程和回歸系數(shù)。

1.4.2.2 纖維素酶活力的測(cè)定

粗酶液的提?。合?0 mL PDB培養(yǎng)液的錐形瓶中加入孢子懸浮液使其終濃度為6×105個(gè)/mL，于28 ℃、130 r/min搖床中培養(yǎng)，設(shè)置不同的溫度梯度及培養(yǎng)時(shí)間，進(jìn)行取樣，4 層紗布過(guò)濾，4 ℃、10 000 r/min離心30 min，上清液4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

酶活力的測(cè)定：采用DNS法[16]。

BG酶活力的測(cè)定：在試管中加入粗酶液0.5 mL，然后加入1 mL 50 mmol/L醋酸-醋酸鈉緩沖液（pH 5.0，內(nèi)含1.0%水楊苷），于50 ℃條件下準(zhǔn)確酶解30 min，立即加入3.0 mL DNS試劑終止反應(yīng)，充分搖勻后沸水浴6 min，取出冷卻，用蒸餾水定容至20 mL，充分搖勻后在540 nm波長(zhǎng)處測(cè)定OD值，通過(guò)查標(biāo)準(zhǔn)曲線或用線性回歸方程求出還原糖的質(zhì)量濃度。對(duì)照將粗酶液換為蒸餾水，其余操作同上。

EG酶活力的測(cè)定：以1.0%羧甲基纖維素鈉代替BG測(cè)定方法中的1.0%水楊苷，其他操作相同。

以上酶活力單位（U/mL）定義為在50℃條件下，每毫升酶液在1 min內(nèi)催化底物生成1 μg葡萄糖所需的酶量。1.4.2.3 果膠酶活力的測(cè)定

粗酶液的提取同1.4.2.2節(jié)方法。酶活力的測(cè)定采用DNS法[16]。

PG活力的測(cè)定：在試管中加入粗酶液0.5 mL，然后加入0.5 mL 50 mmol/L醋酸-醋酸鈉緩沖液（pH 5.0，內(nèi)含1.0%多聚半乳糖醛酸），于50 ℃準(zhǔn)確酶解60 min，立即加入DNS試劑 3.0 mL終止反應(yīng)，充分搖勻后沸水浴6 min，取出冷卻，用蒸餾水定容至20 mL，充分搖勻后在540 nm 波長(zhǎng)處測(cè)定OD值，通過(guò)查標(biāo)準(zhǔn)曲線或用線性回歸方程求出還原糖的含量。對(duì)照將粗酶液換為蒸餾水，其余操作同上。

PMG活力的測(cè)定：以1.0%果膠代替PG測(cè)定方法中的1.0%多聚半乳糖醛酸，其他操作相同。以上酶活力單位（U/mL）定義為1 mL酶液每分鐘催化底物產(chǎn)生1 μg半乳糖酵酸為一個(gè)酶活力單位。

1.4.2.4 不同培養(yǎng)條件下酶活力的測(cè)定

不同培養(yǎng)溫度：向50 mL PDB培養(yǎng)液的錐形瓶中加入孢子懸浮液使其終濃度為6×105個(gè)/mL，于28 ℃、130 r/min搖床培養(yǎng)，設(shè)置溫度梯度18、23、28、33、38 ℃。培養(yǎng)5 d后測(cè)定酶活力。每個(gè)處理重復(fù)3 次。

不同初始pH值：向50 mL PDB培養(yǎng)液的錐形瓶中加入孢子懸浮液使其終濃度為6×105個(gè)/mL，設(shè)置初始pH值梯度4.0、5.0、6.0、7.0、8.0。130 r/min培養(yǎng)5 d后測(cè)定酶活力。每個(gè)處理重復(fù)3 次。

不同培養(yǎng)時(shí)間：向50 mL PDB培養(yǎng)液的錐形瓶中加入孢子懸浮液使其終濃度為6×105個(gè)/mL，于28 ℃、130 r/min搖床培養(yǎng)，分別在培養(yǎng) 1、3、5、7、9 d后測(cè)定酶活力。每個(gè)處理重復(fù)3 次。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同環(huán)境條件下蟠桃病原菌M. fructicola的生物學(xué)特性

2.1.1 pH值和萌發(fā)時(shí)間對(duì)M. fructicola孢子萌發(fā)及芽管延長(zhǎng)的影響

為了測(cè)定pH值對(duì)孢子萌發(fā)及芽管長(zhǎng)度的影響，分別測(cè)定了在5、7、9、11 h pH值對(duì)孢子萌發(fā)及芽管長(zhǎng)度的影響。在5 h時(shí)，pH 3.0、4.0的萌發(fā)率分別為52.4%、60.0%，其余pH值下孢子均萌發(fā)；在培養(yǎng)7 h后，pH 3.0孢子萌發(fā)率為80.0%，其余pH值條件下孢子萌發(fā)率均為100%；在培養(yǎng)9 h時(shí)，在pH 3～8孢子萌發(fā)率均達(dá)到100%。

圖 1 7 h時(shí)pH值對(duì)M. fructicola芽管延長(zhǎng)的影響Fig. 1 Effect of pH on germ tube extension of M. fructicola after cultivated for 7 h

如圖1所示，pH 5.0時(shí)，M. fructicola孢子的芽管長(zhǎng)度顯著高于其他pH值（P＜0.01）；當(dāng)pH 3.0時(shí)，M. fructicola孢子的芽管生長(zhǎng)速率明顯降低；堿性條件下，隨著pH值的升高，孢子萌發(fā)率及芽管長(zhǎng)度變化不顯著（P＞0.01）。綜合可知，酸性環(huán)境更利于病原菌生長(zhǎng)，當(dāng)培養(yǎng)基pH值過(guò)低、過(guò)高時(shí)，M. fructicola孢子萌發(fā)及芽管延長(zhǎng)，均有降低，且在pH值小于3.0，孢子的萌發(fā)率以及芽管長(zhǎng)度降低明顯。

2.1.2 溫度和光照對(duì)M. fructicola孢子萌發(fā)及菌落生長(zhǎng)的影響

圖 2 溫度對(duì)菌落生長(zhǎng)的影響Fig. 2 Effect of temperature on colony growth of of M. fructicola

如圖2所示，M. fructicola在20～32 ℃時(shí)可以正常生長(zhǎng)，高于36 ℃時(shí)不能生長(zhǎng)。培養(yǎng)初期，菌落在培養(yǎng)在1 d和2 d時(shí)，28 ℃菌落生長(zhǎng)速率顯著高于其他溫度（P＜0.01），但是在培養(yǎng)4 d后，溫度為20 ℃和24 ℃的菌落直徑超過(guò)28 ℃條件下培養(yǎng)的菌落直徑。

28 ℃以下，光照對(duì)M. fructicola生長(zhǎng)的影響較小，光照與在黑暗下的菌落直徑差異不顯著（P＞0.01），但是當(dāng)溫度為32 ℃時(shí)，光照下菌落直徑為4.13 cm，黑暗處菌落直徑為3.55 cm，說(shuō)明高溫下，光照對(duì)菌落生長(zhǎng)的影響增大。36 ℃為致死溫度，培養(yǎng)過(guò)程中無(wú)生長(zhǎng)跡象。溫度對(duì)菌落的形態(tài)也具有影響，培養(yǎng)溫度為20 ℃時(shí)，菌落為褐色，呈同心圓狀，溫度為24 ℃時(shí)菌落形態(tài)與20 ℃相差不多，但是當(dāng)溫度達(dá)到28 ℃，菌落顏色變淺，且不再呈同心圓狀，且在20～28 ℃范圍內(nèi)，菌落均貼培養(yǎng)基生長(zhǎng)，當(dāng)溫度為32 ℃時(shí)，像棉花狀于接種處生長(zhǎng)出長(zhǎng)的突起的白色菌絲，說(shuō)明高溫條件下基生菌絲蔓延速率減慢，且孢子生成量下降。

2.2 不同環(huán)境條件下M. fructicola的酶活力

2.2.1 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線

運(yùn)用Excel繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，對(duì)應(yīng)的回歸方程為y= 0.007 9x－0.012 3，R2=0.995 9。該標(biāo)準(zhǔn)曲線線性關(guān)系良好，可用于酶活力的測(cè)定。

2.2.2 不同條件下細(xì)胞壁降解酶的活性變化

2.2.2.1 溫度對(duì)M. fructicola產(chǎn)生的細(xì)胞壁降解酶活性的影響

圖 3 溫度對(duì)纖維素酶活性的影響Fig. 3 Effects of temperatures on cellulase activity of M. fructicola

如圖3所示，在18～38 ℃范圍內(nèi)，M. fructicola均可產(chǎn)生EG和BG，且BG酶活力要明顯高于EG。在高于18 ℃時(shí)，EG和BG酶活力均呈逐漸上升趨勢(shì)，當(dāng)溫度達(dá)到28 ℃時(shí)，2 種酶活力均達(dá)到峰值，BG酶活力為16.05 U/mL，EG酶活力為8.51 U/mL，高于28 ℃，2 種酶活力均呈下降趨勢(shì)，尤其是BG酶活力急劇下降，說(shuō)明BG酶活力受溫度影響較大。

如圖4所示，在18～38 ℃范圍內(nèi)，M. fructicola均可產(chǎn)生PG和PMG。在高于18 ℃時(shí)，PG和PMG酶活力均呈逐漸上升趨勢(shì)，當(dāng)溫度達(dá)到28 ℃時(shí)，2 種酶活力均達(dá)到峰值，PG酶活力為15.23 U/mL，PMG酶活力為13.39 U/mL。高于28 ℃以后，2 種酶活力均急劇下降。

圖 4 溫度對(duì)果膠酶活性的影響Fig. 4 Effect of temperature on pectinase activity of M. fructicola

2.2.2.2 pH值對(duì)M. fructicola產(chǎn)生的細(xì)胞壁降解酶活性的影響

圖 5 pH值對(duì)纖維素酶活性的影響Fig. 5 Effect of pH on cellulase activit y of M. fructicola

如圖5所示，在pH 4.0～8.0范圍內(nèi)，M. fructicola均可產(chǎn)生EG和BG，且BG酶活力要明顯高于EG。在pH 4.0～6.0時(shí)，EG和BG酶活力均呈逐漸上升趨勢(shì)，當(dāng)pH 6.0時(shí)，2 種酶活力均達(dá)到峰值，BG酶活力為13.19 U/mL，EG酶活力為9.34 U/mL，pH值大于6.0后2 種酶活力均下降，且BG酶活力下降趨勢(shì)更為明顯，說(shuō)明BG酶活力受pH值影響較大。

圖 6 pH值對(duì)產(chǎn)果膠酶活性的影響Fig. 6 Effect of pH on pectinase activity of M. fructicola

如圖6所示，在pH 4.0～8.0范圍內(nèi)，M. fructicola均可產(chǎn)生PG和PMG。在pH 4.0～7.0時(shí)，PG和PMG酶活力均呈逐漸上升趨勢(shì)，當(dāng)pH 7.0時(shí)，2 種酶活力均達(dá)到峰值，PG酶活力為8.56 U/mL，PMG酶活力為6.76 U/mL，pH值大于7.0后2 種酶活力均下降明顯。

2.2.2.3 培養(yǎng)時(shí)間對(duì)M. fructicola產(chǎn)生的細(xì)胞壁降解酶的活性影響

由圖7可知，在培養(yǎng)1～9 d內(nèi)，M. fructicola均可產(chǎn)生EG和BG，且BG酶活力要高于EG。在第1～5天內(nèi)，EG和BG酶活力均呈上升趨勢(shì)，且BG酶活力上升更顯著。當(dāng)?shù)?天時(shí)，2 種酶活力均達(dá)到峰值，BG酶活力為16.05 U/mL，EG酶活 力為8.51 U/mL，第5天后2 種酶活力均下降。

圖 7 培養(yǎng)時(shí)間對(duì)纖維素酶活性的影響Fig. 7 Effect of culture time on cellulose activity of M. fructicola

圖 8 培養(yǎng)時(shí)間對(duì)果膠酶活性的影響Fig. 8 Effect of culture time on pectinase activity of M. fructicola

如圖8所示，在培養(yǎng)1～9 d內(nèi)，M. fructicola均可產(chǎn)生PG和PMG，在1～5 d時(shí)，PG和PMG酶活力均呈急劇上升趨勢(shì)，當(dāng)?shù)?天時(shí)，2 種酶活力均達(dá)到峰值，PG酶活力為15.23 U/mL，PMG酶活力為13.39 U/mL，第5天后，2 種酶活力均明顯下降，且整個(gè)培養(yǎng)過(guò)程中，PG和PMG酶活力及變化趨勢(shì)相差不大。

3 討 論

目前關(guān)于采后果實(shí)褐腐病的研究主要集中在桃[17-19]、櫻桃[20-22]、李[22,24-25]、蘋(píng)果[26-27]等果實(shí)上。近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn)不同地區(qū)不同寄主上的褐腐病菌生物學(xué)特性除了溫度影響存在一定差異，其他無(wú)明顯差異[28]，本實(shí)驗(yàn)表明，M. fructicola在20～32 ℃之間均可以生長(zhǎng)，致死溫度為36 ℃，孢子萌發(fā)最適pH值為5.0，光照對(duì)菌落生長(zhǎng)影響甚微。郝曉娟等[24]發(fā)現(xiàn)歐李M. fructicola菌絲在7～27 ℃范圍內(nèi)均可生長(zhǎng)，最適生長(zhǎng)溫度為22 ℃，溫度高于32 ℃病菌停止生長(zhǎng)，孢子萌發(fā)最適溫pH值為6.0～8.0，光照對(duì)孢子萌發(fā)沒(méi)有顯著影響。而趙曉燕等[19]報(bào)道的M. fructicola在35 ℃時(shí)仍可生長(zhǎng)。這說(shuō)明不用地區(qū)不同寄主M. fructicola的生物學(xué)特性溫度和pH值的影響均有差異，光照條件無(wú)明顯差異。

病原菌使宿主發(fā)病不僅與病原菌本身的生物學(xué)特性相關(guān)，同時(shí)也與病原菌細(xì)胞壁降解酶活力有很密切的聯(lián)系。宋喜霞[29]發(fā)現(xiàn)人參銹腐病在體外也可以產(chǎn)生PG、果膠甲基反式消除酶（pectin methyl trans-eliminase，PMTE）、PMG和Cx 4 種細(xì)胞壁降解酶，并判斷PMTE和PG在銹腐菌侵染人參過(guò)程中起重要作用。李寶聚等[30]證明果膠酶、纖維素酶在黃瓜黑星病菌致病中起著 重要作用，是主要的致病因子之一。Sasaki等[31]報(bào)道灰葡萄孢菌株的致病力與β-葡聚糖苷酶具有相關(guān)性。李喜玲等[32]證明了灰葡萄孢菌株的致病力與纖維素酶活力呈正相關(guān)，灰霉菌果膠酶活力高低與致病力強(qiáng)弱有一定的相關(guān)性。這都印證了纖維素酶和果膠酶是病原菌的兩種重要的致病因子，所以對(duì)病原菌細(xì)胞壁降解酶活力進(jìn)行測(cè)定可以間接地了解病原菌在不同條件下對(duì)宿主的致病能力。

近年來(lái)，有關(guān)腐朽菌產(chǎn)纖維素酶的研究較少[33]。韓樹(shù)英等[14]研究發(fā)現(xiàn)，M. fructicola在培養(yǎng)5 d時(shí)纖維素酶活力最高，EG為21.71 U/mL，BG為10.69 U/mL。當(dāng)初始pH 6.0時(shí)，產(chǎn)EG最高，酶活力為12.62 U/mL。菌株在4.0～6.0之間有利于產(chǎn)生EG，該菌適宜在偏酸環(huán)境下生長(zhǎng)。本研究中，在培養(yǎng)5 d和初始pH 6.0時(shí)的EG、BG酶活力最高，與其結(jié)果一致。董小梅[34]發(fā)現(xiàn)龍眼焦腐病菌在1～14 d、8～38 ℃、pH 4.5～8.5范圍內(nèi)均可產(chǎn)生Cx、BG、PG和PMG，在培養(yǎng)6 d酶活力均達(dá)到最大，Cx酶活力明顯高于其他3 種酶，最適培養(yǎng)溫度為28 ℃，PMG酶活力最大，最適pH值為7.0，且PG酶活力顯著高于其他3 種酶。說(shuō)明病原菌不同，其最適產(chǎn)酶條件也存在差異。

且在實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)病原菌的最適生長(zhǎng)條件與其最適產(chǎn)酶條件存在差異。實(shí)驗(yàn)證明，M. fructicola生長(zhǎng)的最適溫度和其產(chǎn)酶最適溫度相同，均為28 ℃，李寶聚等[16,35]也有類(lèi)似的研究結(jié)果，其團(tuán)隊(duì)證明了灰霉病菌孢子的萌發(fā)和菌絲擴(kuò)展最適溫度為20 ℃，其細(xì)胞壁降解酶β-葡萄糖苷酶、PG和Cx也在20 ℃時(shí)表現(xiàn)出最高的活性。但是，雖然病原菌生長(zhǎng)的最適溫度與產(chǎn)酶最適溫度相同，但其最適pH值卻存在差異，M. fructicola生長(zhǎng)的最適pH值為5.0，而產(chǎn)纖維素酶最適pH值為6.0，產(chǎn)果膠酶最適pH值為7.0，因此病原菌生長(zhǎng)最適的環(huán)境條件與其最優(yōu)產(chǎn)酶條件由于其各自影響因素的差異而不盡相同。

真菌病原菌侵染植物是一個(gè)復(fù)雜的過(guò)程，在侵入寄主果實(shí)過(guò)程中其致病力的大小首先與病原菌的生物學(xué)特性相關(guān)，其次，病原菌在侵入宿主初期會(huì)遇到細(xì)胞壁屏障，在病原菌與寄主識(shí)別的過(guò)程中，病原菌釋放細(xì)胞壁降解酶，從而有利于其入侵。對(duì)褐腐病原菌侵入蟠桃果實(shí)，除了自身特性、酶活力，還存在一系列其他的致病因子還有待于基因水平及功能上進(jìn)一步探索。

[1] 董金皋. 農(nóng)業(yè)植物病理學(xué): 北方本[M]. 北京: 中國(guó)農(nóng)業(yè)出版社, 2001: 203-207.

[2] 楊海清. 桃褐腐病菌致病性及拮抗細(xì)菌生防機(jī)制的研究[D]. 呼和浩特: 內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué), 2007: 1-2.

[3] IOOS R, FREY P. Genomic variation within Monilinia laxa, M. fructigena and M. fructicola, and application to species identi cation by PCR[J]. European Journal of Plant Pathology, 2000, 106(4): 373-378. DOI:10.1023/A:1008798520882.

[4] Y?NEZ-MENDIZáBAL V, ZERIOUH H, VI?AS I, et al. Biological control of peach brown rot (Monilinia spp.) by Bacillus subtilis CPA-8 is based on production of fengycin-like lipopeptides[J]. European Journal of Plant Pathology, 2012, 132(4): 609-619. DOI:10.1007/s10658-011-9905-0.

[5] ALBERSHEIM P, JONES T M, PATRICIA D. Biochemistry of the cell wall in relation to infective process[J]. Annual Review of Phytopathology, 1969, 7: 171-194. DOI:10.1146/annurev. py.07.090169.001131.

[6] MEDGEN K, HSHN M, DEISING H. Morphogenesis and mechanisms of penetration by plant pathogenic fungi[J]. Annual Review of Phytopathology, 1996, 34: 367-386. DOI:10.1146/annurev. phyto.34.1.367.

[7] 李燕紅, 趙輔昆. 纖維素酶的研究進(jìn)展[J]. 生命科學(xué), 2005, 17(5): 392-397. DOI:10.3969/j.issn.1004-0374.2005.05.005.

[8] 張小梅, 李單單, 王祿山, 等. 纖維素酶家族及其催化結(jié)構(gòu)域分子改造的新進(jìn)展[J]. 生物工程學(xué)報(bào), 2013, 29(4): 422-433. DOI:10.13345/ j.cjb.2013.04.008.

[9] 潘利華, 羅建平. β-葡萄糖苷酶的研究及應(yīng)用進(jìn)展[J]. 食品科學(xué), 2006, 27(12): 803-807. DOI:10.3321/j.issn:1002-6630.2006.12.210.

[10] 趙艷琴, 吳元華, 伏穎, 等. 煙草靶斑病菌(Rhizoctonia solani)細(xì)胞壁降解酶活性分析及其致病作用[J]. 煙草科技, 2014(11): 84-88.

[11] 段學(xué)武, 張昭其, 季作梁. PG酶與果實(shí)的成熟軟化[J]. 果樹(shù)學(xué)報(bào), 2001, 18(4): 229-233. DOI:10.13925/j.cnki.gsxb.2001.04.012.

[12] SISQUELLA M, CASALS C, PICOUET P, et al. Immersion of fruit in water to improve radio frequency treatment to control brown rot in stone fruit[J]. Postharvest Biology and Technology, 2013, 80: 31-36. DOI:10.1016/j.postharvbio.2013.01.010.

[13] CHEN Jiaojiao, ZHANG Shaoshan, YANG Xiaoping. Control of brown rot on nectarines by tea polyphenol combined with tea saponin[J]. Crop Protection, 2013, 45: 29-35. DOI:10.1016/ j.cropro.2012.11.006.

[14] 韓樹(shù)英, 池玉杰, 薛煜. 一株褐腐真菌產(chǎn)纖維素酶活力的分析[J].安徽農(nóng)業(yè)科學(xué), 2014, 42(16): 4953-4955. DOI:10.13989/ j.cnki.0517-6611.2014.16.001.

[15] 陳峰, 許煜泉, 祝新德, 等. 聚半乳糖醛酸酶高產(chǎn)菌的產(chǎn)酶條件研究[J]. 工業(yè)微生物學(xué)報(bào), 2001, 31(4): 9-12. DOI:10.3969/ j.issn.1001-6678.2001.04.003.

[16] 李寶聚, 陳立芹, 孟偉軍, 等. 溫濕度調(diào)控對(duì)番茄灰霉病菌產(chǎn)生的細(xì)胞壁降解酶的影響[J]. 植物病理學(xué)報(bào), 2003, 33(3): 209-221. DOI:10.13926/j.cnki.apps.2003.03.004.

[17] de CAL A, SANDíN-ESPA?A P, MARTINEZ F, et al. Role of gluconic acid and pH modulation in virulence of Monilinia fructicola on peach fruit[J]. Postharvest Biology and Technology, 2013, 86: 418-423. DOI:10.1016/j.postharvbio.2013.07.012.

[18] MARI M, MARTINI C, GUIDARELLI M, et al. Postharvest biocontrol of Monilinia laxa, Monilinia fructicola and Monilinia fructigena on stone fruit by two Aureobasidium pullulans strains[J]. Biological Control, 2012, 60: 132-140. DOI:10.1016/j.biocontrol.2011.10.013.

[19] 趙曉燕, 王穎潔, 楊海清, 等. 環(huán)境條件對(duì)桃褐腐病菌生長(zhǎng)和分生孢子萌發(fā)的影響[J]. 北京農(nóng)學(xué)院學(xué)報(bào), 2007, 22(4): 34-37.

[20] ORO L, ERICA F, MAURIZIO C, et al. Biocontrol of postharvest brown rot of sweet cherries by Saccharomyces cerevisiae Disva 599, Metschnikowia pulcherrima Disva 267 and Wickerhamomyces anomalus Disva 2 strains[J]. Postharvest Biology and Technology, 2014, 96: 64-68. DOI:10.1016/j.postharvbio.2014.05.011.

[21] QIN G Z, TIAN S P, XU Y, et al. Combination of antagonistic yeasts with two food additives for control of brown rot caused by Monilinia fructicola on sweet cherry fruit[J]. Journal of Applied Microbiology, 2006, 100(3): 508-515. DOI:10.1111/j.1365-2672.2005.02821.x.

[22] SPOTTS R A, CERVANTES L A, FACTEAU T J. Integrated control of brown rot of sweet cherry fruit with a preharvest fungicide, a postharvest yeast, modi ed atmosphere packaging, and cold storage temperature[J]. Postharvest Biology and Technology, 2002, 24(3): 251-257. DOI:10.1016/S0925-5214(01)00155-7.

[23] 徐成楠, 周宗山, 吳玉星, 等. 歐李褐腐病病原菌鑒定[J]. 植物病理學(xué), 2011, 41(6): 626-630. DOI:10.13926/j.cnki.apps.2011.06.008.

[24] 郝曉娟, 高瑩, 李新鳳, 等. 歐李褐腐病病原菌生物學(xué)特性及其寄主范圍[J]. 果樹(shù)學(xué)報(bào), 2014, 31(1): 101-104. DOI:10.13925/j.cnki. gsxb.2014.01.006.

[25] WOJCIECH J, JANISIEWIC Z, WAYNE M, et al. Yeasts associated with plums and their potential for controlling brown rot after harvest[J]. Yeast, 2014, 31(6): 207-218. DOI:10.1002/yea.3009.

[26] VASIC M, DUDUK N, IVANOVIC M S. First report of brown rot caused by Monilia polystroma on apple in serbia[J]. Plant Disease, 2013, 97(1): 145-145.

[27] IMRE H, BALLA B, VáMOS A, et al. In uence of preharvest calcium applications, fruit injury and storage atmospheres on postharvest brown rot of apple[J]. Postharvest Biology and Technology, 2012, 67(5): 29-36. DOI:10.1016/j.postharvbio.2011.12.008.

[28] 凡先芳, 王寶剛, 曾凱芳. 采后果實(shí)褐腐病防治技術(shù)研究進(jìn)展[J]. 食品工業(yè)科技, 2015, 36(12): 390-394. DOI:10.13386/ j.issn1002-0306.2015.12.074.

[29] 宋喜霞. 人參與銹腐菌互作生理生化機(jī)制的研究[D]. 長(zhǎng)春: 吉林農(nóng)業(yè)大學(xué), 2007: 15-23.

[30] 李寶聚, 周長(zhǎng)力, 趙奎華, 等. 黃瓜黑星病菌致病機(jī)理的研究Ⅱ細(xì)胞壁降解酶及其在致病中的作用[J]. 植物病理學(xué)報(bào), 2000, 30(1): 13-18. DOI:10.13926/j.cnki.apps.2000.01.003.

[31] SASAKI I, NAGAYAMA H. Beta-glucosidase from Botrytis cinerea: its relation to the pathogenicity of this fungus[J]. Bioscience Biotechnology and Biochemistry, 1994, 58(4): 616-620. DOI:10.1271/ bbb.58.616.

[32] 李喜玲. 灰葡萄孢致病力的分化及與細(xì)胞壁降解酶活性的關(guān)系研究[D]. 合肥: 安徽農(nóng)業(yè)大學(xué), 2008: 28-33.

[33] 安莉穎, 施思, 譚德勇, 等. 里氏木霉RutC-30產(chǎn)纖維素酶條件優(yōu)化研究[J]. 安徽農(nóng)業(yè)科學(xué), 2012, 40(8): 4818-4820. DOI:10.13989/ j.cnki.0517-6611.2012.08.021.

[34] 董小梅. 龍眼焦腐病菌細(xì)胞壁降解酶及其致病機(jī)理的研究[D]. 福州:福建農(nóng)林大學(xué), 2010: 16-23.

[35] 李寶聚, 陳立芹, 孟偉軍, 等. 溫度調(diào)控對(duì)番茄灰霉病菌侵染的影響[J].植物保護(hù), 2004, 30(2): 75-80.

Biological Characteristics and Cell Wall Degrading Enzyme Activities of Flat Peach Brown Rot Pathogen

SONG Dandan1, KONG Qingjun2, LI Hongbin1, REN Xueyan2,*
(1. College of Life Sciences, Shihezi University, Shihezi 832003, China; 2. College of Food Engineering and Nutritional Science, Shaanxi Normal University, Xian 710062, China)

Brown rot disease caused by Monilinia fructicola is one of the major postharvest diseases ofat peach, which causes serious postharvest loss. Meanwhile, the pathogenicities of M. fructicola for different fruit hosts are different. In this investigation, we studied the biological characteristics of M. fructicola under different culture conditions including temperature, pH, and light, and we also examined the impacts of culture temperature, pH and time on the activities of cell wall degrading enzymes. The results showed that the optimum pH for spore germination and germ tube extension of M. fructicola was 5.0 and it grew well in a weak acidic environment, while the spore germination rate was signi cantly lower in an excessively acidic environment. The optimum temperature for colony growth was in the range of 20～ 28 ℃, and the pathogen could not grow normally at a temperature above 36 ℃. Temperature affected colony morphology, and at different temperatures, the colony morphology characteristics were different. Light had little effect on the hyphal growth. The activities of the cell wall degrading enzymes endoglucanase (EG), β-glucosidase (BG), polymethylgalacturonase (PMG), and polygalacturonase (PG) were the highest at 28 ℃. The activities of EG and BG reached the highest values at pH 6.0, while the activities of PMG and PG reached the highest values at pH 7.0. The activi ties of these four enzymes were the highest after cultivation for 5 days. Regardless of changes in pH, temperature and incubation time, BG activity was higher than EG activity and PG activity was higher than PMG activity.

Monilinia fructicola; biological characteristics; cell wall degrading enzymes; culture conditions

10.7506/spkx1002-6630-201710008

Q934.1；Q55

A

1002-6630（2017）10-0042-07

2016- 07-14

國(guó)家自然科學(xué)基金地區(qū)科學(xué)基金項(xiàng)目（31260402；31460411；21362028）；國(guó)家自然科學(xué)基金面上項(xiàng)目（31671904）；陜西省農(nóng)業(yè)科技創(chuàng)新與攻關(guān)項(xiàng)目（2016NY-184；2016NY-194）；中央高校基本科研業(yè)務(wù)費(fèi)專(zhuān)項(xiàng)（GK201503069；GK201603095）

宋丹丹（1991—），女，碩士研究生，研究方向?yàn)楣卟珊蠓乐?。E-mail：1424435556@qq.com

*通信作者：任雪艷（1978—），女，副教授，博士，研究方向?yàn)檗r(nóng)產(chǎn)品貯藏與加工。E-mail：rxy104@snnu.edu.cn

宋丹丹, 孔慶軍, 李鴻彬, 等. 蟠桃褐腐病原菌生物學(xué)特性及細(xì)胞壁降解酶活性[J]. 食品科學(xué), 2017, 38(10): 42-48.

DOI:10.7506/spkx1002-6630-201710008. http://www.spkx.net.cn SONG Dandan, KONG Qingjun,LI Hongbin, et al. Biological characteristics and cell wall degrading enzyme activities of flat peach brown rot pa thogen[J]. Food Science, 2017, 38(10): 42-48. (in Chinese with English abstract) DOI:10.7506/ spkx1002-6630-201710008. http://www.spkx.net.cn