植物乳桿菌YM-2菌株胞外多糖生物合成工藝優(yōu)化

司天昭，柳陳堅(jiān)，秦曉萌，李曉然，羅義勇，楊 恩

植物乳桿菌YM-2菌株胞外多糖生物合成工藝優(yōu)化

司天昭，柳陳堅(jiān)，秦曉萌，李曉然，羅義勇，楊 恩*

（昆明理工大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，云南 昆明 650500）

對從云南傳統(tǒng)發(fā)酵豆豉分離得到的植物乳桿菌YM-2（Lactobacillus plantarum YM-2）菌株胞外多糖（exopolysaccharide，EPS）生物合成條件進(jìn)行優(yōu)化。首先對培養(yǎng)基成分中的碳源、氮源種類進(jìn)行篩選；然后利用單因素試驗(yàn)分析碳源含量、氮源含量、培養(yǎng)時(shí)間以及培養(yǎng)溫度對EPS產(chǎn)量的影響；最后采用Box-Behnken法進(jìn)行四因素三水平響應(yīng)面分析以確定其最優(yōu)工藝條件。結(jié)果表明，植物乳桿菌YM-2菌株生物合成EPS最佳條件為碳源（葡萄糖）含量30 g/L、氮源（酵母粉）含量30 g/L、培養(yǎng)時(shí)間30.05 h、培養(yǎng)溫度36.36 ℃，在此工藝條件下，植物乳桿菌YM-2 EPS產(chǎn)量為257.362 mg/L。

植物乳桿菌；胞外多糖；條件優(yōu)化；響應(yīng)面法

乳酸菌利用的歷史悠久，是一種公認(rèn)的安全型微生物。當(dāng)前乳酸菌在食品行業(yè)中應(yīng)用廣泛，與人體健康關(guān)系密切[1]。乳酸菌胞外多糖（exopolysaccharide，EPS）是一種次生代謝產(chǎn)物，與細(xì)胞松散連接，并且可以直接分泌至細(xì)胞外環(huán)境中[2]。與植物多糖和動(dòng)物多糖相比，由于微生物EPS的生產(chǎn)受地理環(huán)境及氣候條件等自然因素的影響較小，并且其產(chǎn)量及質(zhì)量穩(wěn)定，性價(jià)比較高。另外EPS除具有良好的增黏性、耐鹽性、抗溫性、抗剪切性等理化特性外，還具有免疫調(diào)節(jié)、抗腫瘤、抗氧化[3]以及改善胃腸道機(jī)能[4]等多種生理機(jī)能，因此在食品和制藥領(lǐng)域具有廣闊的應(yīng)用前景。但是，當(dāng)前乳酸菌EPS的應(yīng)用還很有限，主要原因是多糖產(chǎn)量過低，生產(chǎn)和提取成本很高。通過合成條件的研究可以發(fā)現(xiàn)影響EPS產(chǎn)量的關(guān)鍵因素，加之基因工程技術(shù)能夠定向改造乳酸菌的遺傳物質(zhì)，這些方法都可以有效提高多糖產(chǎn)量并降低成本。

自然界中很多乳酸菌可以生物合成EPS，植物乳桿菌就是其中一類。乳酸菌EPS產(chǎn)量受諸多因素影響，乳酸菌菌株本身起決定性作用。不同乳酸菌在乳培養(yǎng)基中產(chǎn)EPS的范圍不同，如噬熱鏈球菌EPS產(chǎn)量為50～360 mg/L，干酪乳桿菌EPS產(chǎn)量為50～60 mg/L[5]。不同植物乳桿菌在MRS培養(yǎng)基中，EPS產(chǎn)量不同。EPS產(chǎn)量的范圍為29.86～324.80 mg/L[6-9]。優(yōu)化條件后G1德氏乳桿菌保加利亞亞種EPS產(chǎn)率提高17.8%[10]，干酪乳桿菌LC2W在優(yōu)化培養(yǎng)成分后，EPS產(chǎn)量提高28.75%[11]，Lactobacillus reuteri-YR在最優(yōu)發(fā)酵條件下，EPS實(shí)際產(chǎn)量可高達(dá)7 214.4 mg/L[12]，這就使EPS的工業(yè)應(yīng)用成為可能。除菌種因素外，培養(yǎng)基組成、培養(yǎng)條件等都會(huì)影響乳酸菌EPS產(chǎn)量[5]，因此可以通過優(yōu)化EPS生物合成的條件提高多糖產(chǎn)量。

本研究以EPS產(chǎn)量作為指標(biāo)，通過單因素試驗(yàn)對EPS的培養(yǎng)基成分及培養(yǎng)條件進(jìn)行研究，并通過Box-Behnken響應(yīng)面法分析各因素之間交互作用對EPS產(chǎn)量的影響，進(jìn)一步確定從云南傳統(tǒng)發(fā)酵豆豉分離得到的植物乳桿菌YM-2菌株（Lactobacillus plantarum YM-2）[13]生物合成EPS的最優(yōu)條件，從而提高其EPS產(chǎn)量，為進(jìn)一步研究EPS生物學(xué)活性提供良好基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

菌株：從云南傳統(tǒng)發(fā)酵豆豉分離得到的Lactobacillus plantarum subsp. plantarum YM-2菌株[14]。

MRS培養(yǎng)基（微生物干粉培養(yǎng)基質(zhì)控圖解手冊）：蛋白胨10.0 g、牛肉粉8.0 g、酵母粉4.0 g、葡萄糖20.0 g、K2HPO42.0 g、檸檬酸三銨2.0 g、乙酸鈉5.0 g、MgSO4·7H2O 0.2 g、MnSO4·4H2O 0.05 g、吐溫1 mL、蒸餾水1 000 mL，pH 6.2～6.4，115 ℃滅菌20 min。

硫酸（分析純） 重慶川東化工（集團(tuán)）有限公司；三氯乙酸（分析純） 天津市光復(fù)精細(xì)化工研究所；碳酸氫鈉、苯酚（均為分析純）天津市風(fēng)船化學(xué)試劑科技有限公司；乙二胺四乙酸（分析純） 生工生物工程（上海）有限公司；MD34透析袋（1 000 D） 上海有漁實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

3-18K離心機(jī) 美國Sigma公司；FD5-12真空冷凍干燥機(jī) 美國SIM公司；Ultrospec 2100 pro紫外-可見分光光度計(jì) 美國GE公司。

1.3 方法

1.3.1 植物乳桿菌EPS的提取純化[15]

對活化的菌種用血球計(jì)數(shù)板進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)，通過稀釋的方法保持接種前細(xì)胞數(shù)量一致，之后根據(jù)體積比接種。植物乳桿菌按體積分?jǐn)?shù)2%的接種量接種于MRS液體培養(yǎng)基中，37 ℃培養(yǎng)24 h；培養(yǎng)液4 ℃、10 000×g離心30 min，取上清液；加三氯乙酸至質(zhì)量分?jǐn)?shù)為4%，10 000×g離心15 min，取上清液；3 倍體積的預(yù)冷無水乙醇－20 ℃沉淀過夜；4 ℃、12 000×g離心30 min收集沉淀；待乙醇完全蒸發(fā)，加入2 mL的雙蒸水溶解沉淀，轉(zhuǎn)移到經(jīng)過前處理的透析袋中透析2 d，其間8 h換水一次；收集透析液，真空冷凍干燥得到植物乳桿菌的EPS。

1.3.2 EPS產(chǎn)量的測定

利用苯酚-硫酸法[16]測定EPS含量。以葡萄糖為標(biāo)準(zhǔn)品作標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到回歸方程為y=13.307x+0.023，R2=0.996 9，曲線擬合良好。通過回歸方程計(jì)算植物乳桿菌YM-2的EPS產(chǎn)量。

1.3.3 產(chǎn)糖培養(yǎng)基成分的優(yōu)化

1.3.3.1 最佳碳源的篩選

選取葡萄糖、果糖、蔗糖、乳糖以及果糖和蔗糖混合碳源替代MRS培養(yǎng)基中的碳源，其他成分不變。每種碳源類型的含量確定為20 g/L，37 ℃培養(yǎng)24 h。

1.3.3.2 最佳氮源的篩選

將MRS培養(yǎng)基中的蛋白胨、牛肉膏和酵母粉選定為研究因素，每種氮源的含量確定為20 g/L，除氮源外，培養(yǎng)基中其他成分不變。培養(yǎng)條件為37 ℃、24 h。

1.3.4 培養(yǎng)條件的優(yōu)化

已報(bào)道的影響乳酸菌EPS產(chǎn)量的條件包括：碳源、氮源、培養(yǎng)時(shí)間、培養(yǎng)溫度、培養(yǎng)基初始pH值等[17]。本研究首先通過單因素試驗(yàn)篩選發(fā)酵條件，再通過響應(yīng)面試驗(yàn)[18]，得出植物乳桿菌YM-2菌株生物合成EPS的最優(yōu)培養(yǎng)條件。

1.3.4.1 單因素試驗(yàn)優(yōu)化

根據(jù)優(yōu)化結(jié)果，本研究選定葡萄糖、酵母粉分別作為培養(yǎng)的碳源和氮源。在接種量2%、其余成分與MRS培養(yǎng)基成分比例一致、37 ℃培養(yǎng)24 h條件下，測定不同葡萄糖含量（10、15、20、25、30 g/L）對EPS產(chǎn)量的影響。在接種量2%、葡萄糖含量20 g/L、37 ℃培養(yǎng)24 h條件下，測定不同酵母粉含量（10、15、20、25、30 g/L）對EPS產(chǎn)量的影響。在接種量2%、碳源為葡萄糖20 g/L、氮源為酵母粉20 g/L、37 ℃培養(yǎng)條件下，測定不同培養(yǎng)時(shí)間（12、16、24、30、36 h）對EPS產(chǎn)量的影響。在接種量2%、碳源為葡萄糖20 g/L、氮源為酵母粉20 g/L、培養(yǎng)24 h條件下，測定不同培養(yǎng)溫度（32、35、37、40、42 ℃）對EPS產(chǎn)量的影響。

1.3.4.2 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)

響應(yīng)面優(yōu)化可以通過擬合回歸方程以構(gòu)建連續(xù)變量曲面預(yù)測模型，從而能夠?qū)Σ煌蛩厮郊捌浣换プ饔眠M(jìn)行優(yōu)化和評價(jià)，所需試驗(yàn)次數(shù)較少，因此被成功地應(yīng)用于各種優(yōu)化過程[19-20]。根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，選取碳源含量、氮源含量、培養(yǎng)時(shí)間、培養(yǎng)溫度4 個(gè)因素，以EPS產(chǎn)量為響應(yīng)值，根據(jù)Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)原理[21]，設(shè)計(jì)四因素三水平響應(yīng)面試驗(yàn)。每組試驗(yàn)重復(fù)3次。

1.4 數(shù)據(jù)處理

單因素試驗(yàn)設(shè)計(jì)中每項(xiàng)因素試驗(yàn)重復(fù)3 次，數(shù)據(jù)結(jié)果使用SPSS 22.0軟件對其進(jìn)行方差分析（One-Way ANOVA）。具體選用事后多重比較中假定方差齊性為LSD和Duncan，選項(xiàng)statistics為描述性，缺失值選擇按分析順序排除個(gè)案。采用Design-Expert（Version 8.0.6）軟件進(jìn)行試驗(yàn)設(shè)計(jì)、模型建立和數(shù)據(jù)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 培養(yǎng)基營養(yǎng)成分對EPS產(chǎn)量的影響

2.1.1 碳源種類對EPS產(chǎn)量的影響

圖 1 碳源種類對菌株YM-2 EPS產(chǎn)量的影響Fig. 1 Effects of carbon sources on the EPS yield of strain YM-2

由圖1可知，植物乳桿菌YM-2能利用多種碳源生物合成EPS。當(dāng)葡萄糖、蔗糖和果糖混合為碳源與蔗糖、果糖、乳糖為碳源兩者存在顯著差異（P＜0.05）。當(dāng)糖源為葡萄糖時(shí)，YM-2的EPS產(chǎn)量略高于糖源為蔗糖和果糖混合物，因此選擇葡萄糖作為乳酸菌發(fā)酵的糖源。而從印度發(fā)酵飲料（Kyiad pyrsi）分離得到的菌株Leuconstoc lactis[22]當(dāng)碳源為蔗糖時(shí)，EPS產(chǎn)量最高。Lactobacillus ke ranofaciens[23]、Lactobacillus strain A[24]當(dāng)碳源為乳糖時(shí)，EPS產(chǎn)量最高。說明優(yōu)勢碳源的利用具有菌株差異性。

2.1.2 氮源種類對EPS產(chǎn)量的影響

氮源是乳酸菌合成EPS所必需的養(yǎng)分，不同的氮源和適量的添加量對菌體分泌EPS均有一定的影響[25]。由圖2可知，該菌株能利用多種氮源進(jìn)行發(fā)酵產(chǎn)糖。3 種不同的氮源對植物乳桿菌菌株YM-2 EPS產(chǎn)量的影響具有極顯著性差異（P＜0.001），當(dāng)?shù)礊榻湍阜蹠r(shí)，該菌株的EPS產(chǎn)量最大，因此選擇酵母粉作為乳酸菌發(fā)酵的氮源。氮源主要通過影響微生物生長速率影響EPS等代謝的合成[26]。與植物乳桿菌YM-2不同的是，從在奶酪乳清生長分離得到的kefiran[27]、從發(fā)酵穇子分離得到的Lactobacillus strain A[11]、Lactobacillus casei LC2W[28]在利用的氮源分別為酵母提取物、酪蛋白水解物、蛋白胨時(shí)，EPS產(chǎn)量達(dá)到最大值。說明優(yōu)勢 氮源的應(yīng)用具有菌株差異性。

圖 2 氮源種類對菌株YM-2 EPS產(chǎn)量的影響Fig. 2 Effects of nitrogen sources on the EPS yield of strain YM-2

2.2 培養(yǎng)條件的優(yōu)化

2.2.1 單因素試驗(yàn)結(jié)果

2.2.1.1 葡萄糖含量對EPS產(chǎn)量的影響

圖 3 葡萄糖含量對菌株YM-2 EPS產(chǎn)量的影響Fig. 3 Effects of glucose concentration in the medium on the EPS yield of strain YM-2

由圖3可知，葡萄糖含量對植物乳桿菌EPS產(chǎn)量影響不大，當(dāng)葡萄糖含量為10 g/L時(shí)，植物乳桿菌YM-2的EPS產(chǎn)量為（224.24±0.651）mg/L；當(dāng)葡萄糖含量達(dá)到20 g/L時(shí)，EPS產(chǎn)量達(dá)到最大（228.684±0.483）mg/L；當(dāng)葡萄糖含量達(dá)到25 g/L時(shí)，EPS產(chǎn)量有所下降；當(dāng)葡萄糖含量為30 g/L時(shí)，EPS產(chǎn)量為（222.183±0.710）mg/L。葡萄糖含量較低時(shí)，EPS產(chǎn)量隨著葡萄糖含量的提高而增多；當(dāng)達(dá)到一定階段時(shí)，EPS產(chǎn)量又隨著葡萄糖含量的提高而下降。葡萄糖的含量較高時(shí)可以抑制乳酸菌EPS的合成。與此不同的是Lactobacillus cinfusus[28]在糖源含量高的條件下，EPS產(chǎn)量高。而Bacillus licheniformis[29]在糖源含量很低條件下，EPS產(chǎn)量反而會(huì)很高。這種現(xiàn)象是由于所研究的植物乳桿菌YM-2菌株中可能存在不同單糖轉(zhuǎn)運(yùn)與轉(zhuǎn)化系統(tǒng)，乳酸菌可以通過這些轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)控制進(jìn)入細(xì)胞的碳源的量，轉(zhuǎn)化系統(tǒng)又可以實(shí)現(xiàn)不同碳源的轉(zhuǎn)化，使得菌體獲得其所需要的糖。碳源表現(xiàn)的高濃度抑制EPS合成的現(xiàn)象表明菌體細(xì)胞中具有反饋抑制體系，這對EPS的生產(chǎn)應(yīng)用是巨大的不利因素，因此研究碳源代謝體系，解除反饋抑制是另一個(gè)重要方面。

2.2.1.2 酵母粉含量對EPS產(chǎn)量的影響

圖 4 酵母粉含量對菌株YM-2 EPS產(chǎn)量的影響Fig. 4 Effects of yeast powder concentration in the medium on the EPS yield of strain YM-2

由圖4可知，植物乳桿菌YM-2的EPS產(chǎn)量與酵母粉的含量呈正相關(guān)關(guān)系，當(dāng)酵母粉含量為10 g/L時(shí)，EPS產(chǎn)量為（170.163±1.689）mg/L；隨著酵母粉含量的增加，EPS產(chǎn)量不斷增加，當(dāng)酵母粉含量為30 g/L時(shí)，EPS產(chǎn)量達(dá)到（256.561±1.138）mg/L。當(dāng)酵母粉含量較高時(shí)，EPS產(chǎn)量雖然還在增加，但增速有所減緩。在酵母粉含量在10～30 g/L范圍內(nèi)，植物乳桿菌YM-2的EPS產(chǎn)量沒有下降趨勢，因此可以確定氮源的種類和含量對EPS的合成起到了極為重要的作用。與之不同的是Lactobacillus LB 121[30]在高糖源（100 g/L）存在、缺乏氮源（MRS培養(yǎng)基配方中氮源）培養(yǎng)基中，EPS含量會(huì)升高。氮源對EPS合成的影響巨大，這可能是由于在植物乳桿菌YM-2中，氮源通過影響 EPS合成相關(guān)酶類的合成進(jìn)而影響EPS的合成[31]。

2.2.1.3 培養(yǎng)時(shí)間對EPS產(chǎn)量的影響

圖 5 培養(yǎng)時(shí)間對菌株YM-2 EPS產(chǎn)量的影響Fig. 5 Effect of culture time on the EPS yield of strain YM-2

由圖5可知，培養(yǎng)時(shí)間對植物乳桿菌EPS的生物合成具有重要影響。當(dāng)培養(yǎng)時(shí)間較短時(shí)，乳酸菌EPS產(chǎn)量隨著時(shí)間的延長而提高；當(dāng)某個(gè)時(shí)間點(diǎn)達(dá)到最大合成量后，EPS產(chǎn)量又隨著時(shí)間的延長而下降。這說明隨著時(shí)間的延長，當(dāng)培養(yǎng)液的環(huán)境變得惡劣，營養(yǎng)物質(zhì)無法滿足乳酸菌的生長需要時(shí)，乳酸菌開始分解利用EPS以滿足自身的生長。

2.2.1.4 培養(yǎng)溫度對EPS產(chǎn)量的影響

圖 6 培養(yǎng)溫度對菌株YM-2 EPS產(chǎn)量的影響Fig. 6 Effect of culture temperature on the EPS yield of strain YM-2

由圖6可知，培養(yǎng)溫度對植物乳桿菌YM-2的EPS的生物合成具有重要影響。溫度較低時(shí)，隨著溫度的提升EPS產(chǎn)量增加。當(dāng)產(chǎn)量達(dá)到最大值后，溫度再繼續(xù)升高EPS產(chǎn)量出現(xiàn)下降。培養(yǎng)溫度的影響表現(xiàn)為低溫和高溫都會(huì)抑制EPS的合成，只有在最適培養(yǎng)溫度時(shí)EPS產(chǎn)量才能達(dá)到最高。

2.2.2 響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果

2.2.2.1 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果及方差分析

根據(jù)四因素三水平的響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)，共設(shè)立29 個(gè)試驗(yàn)點(diǎn)，試驗(yàn)方案及結(jié)果見表1。

表 1 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果Table 1 Experimental design and results for response surface analysis

表 1 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果Table 1 Experimental design and results for response surface analysis

試驗(yàn)號(hào) A葡萄糖含量/（g/L）EPS產(chǎn)量/（mg/L）120202437212.152 220203632174.779 320201242172.474 42010244272.977 530202432177.985 630203637192.914 72010363735.37 830202442164.124 9 20202437212.152 102010243297.927 1130302437239.072 1210202432174.445 1330201237167.664 1420302432263.955 1520202437212.152 1620201232164.258 1710203637167.364 1820202437212.152 1910201237179.221 201010243793.318 213010243783.031 2220202437212.152 2320203642171.472 2420301237243.013 252010123784.634 2610202442176.215 2710302437298.222 2820302442252.766 2920303637261.583 B酵母粉含量/（g/L）C培養(yǎng)時(shí)間/h D培養(yǎng)溫度/℃

利用Design-Expert（Version 8.0.6）軟件對表1試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行回歸擬合分析，得到植物乳桿菌YM-2菌株EPS產(chǎn)量（Y）對葡萄糖含量（A）、酵母粉含量（B）、培養(yǎng)時(shí)間（C）、培養(yǎng)溫度（D）4 個(gè)因素的回歸方程為：

Y=212.15－5.33A+90.95B－0.65C－3.61D－12.22AB+9.28AC－3.91AD+16.96BC+3.44BD－2.88CD－13.08A2－24.04B2－25.43C2－19.35D2

表 2 回歸方程方差分析結(jié)果Table 2 Analysis of variance (AOVNA) of regression model

如表2所示，響應(yīng)面方差分析所得的結(jié)果顯著，說明試驗(yàn)結(jié)果可靠，預(yù)測結(jié)果與試驗(yàn)結(jié)果符合度很好，結(jié)果可信[21]。其中R2（0.980 8）與（0.961 6）值相近，而變異系數(shù)為6.83%，小于10%，說明模型可靠，在試驗(yàn)因素和水平條件下能夠準(zhǔn)確預(yù)測植物乳桿菌EPS的產(chǎn)量。

對回歸方程各項(xiàng)進(jìn)行方差分析，結(jié)合A、B、C、D各因素F值的大小，可以得出4 個(gè)因素對EPS產(chǎn)量影響的次序?yàn)椋航湍阜酆浚酒咸烟呛浚九囵B(yǎng)溫度＞培養(yǎng)時(shí)間。其中B、B2、C2、D2對EPS產(chǎn)量的影響極顯著，BC、A2對其影響顯著，其余項(xiàng)對其影響不顯著。

2.2.2.2 響應(yīng)面交互作用結(jié)果

固定其中2 個(gè)因素，利用Design-Expert軟件對試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行二元多次回歸擬合，所得方程響應(yīng)面如圖7所示?；诳疾斓脑囼?yàn)條件范圍內(nèi)，結(jié)果顯示：在葡萄糖含量與酵母粉含量的交互作用中，葡萄糖含量對EPS產(chǎn)量影響不大，不同葡萄糖含量條件下EPS產(chǎn)量相對穩(wěn)定。而酵母粉含量對EPS的合成影響較大，酵母粉含量與EPS產(chǎn)量呈現(xiàn)正相關(guān)性（P＜0.001），當(dāng)酵母粉含量較高時(shí)EPS產(chǎn)量的增加有所減緩（圖7a）。葡萄糖含量與培養(yǎng)時(shí)間互相作用明顯，葡萄糖含量和培養(yǎng)時(shí)間水平增加到一定量時(shí)，EPS產(chǎn)量出現(xiàn)峰值隨后下降（圖7b）。葡萄糖含量與培養(yǎng)溫度的交互作用中，EPS產(chǎn)量也呈現(xiàn)出相似的趨勢（圖7c）。

與酵母粉含量單因素試驗(yàn)相似，在酵母粉含量與培養(yǎng)時(shí)間的交互作用中，EPS產(chǎn)量與酵母粉含量具有正相關(guān)關(guān)系。而此時(shí)培養(yǎng)時(shí)間的作用與單因素試驗(yàn)不同，EPS產(chǎn)量只是在較短培養(yǎng)時(shí)間內(nèi)和較長時(shí)間培養(yǎng)時(shí)略有下降，而在整個(gè)培養(yǎng)時(shí)間段內(nèi)EPS產(chǎn)量變化并不大。在酵母粉含量與培養(yǎng)溫度的交互作用中得到的結(jié)論也是相似的。EPS產(chǎn)量與酵母粉含量具有正相關(guān)關(guān)系。在較低和較高培養(yǎng)溫度時(shí)EPS產(chǎn)量有所下降，而不同培養(yǎng)溫度對EPS產(chǎn)量影響不大，沒有單因素試驗(yàn)中的影響顯著（圖7d、7e）。

在培養(yǎng)時(shí)間和培養(yǎng)溫度的交互作用中，培養(yǎng)時(shí)間與培養(yǎng)溫度的作用都是顯著的。在培養(yǎng)時(shí)間和培養(yǎng)溫度都較低時(shí)，EPS產(chǎn)量隨著培養(yǎng)時(shí)間或溫度水平的提高而增加。當(dāng)達(dá)到最大量后又隨著時(shí)間或溫度水平的提高而下降，時(shí)間和溫度過低或過高時(shí)都會(huì)抑制EPS的合成（圖7f）。

圖 7 各因素交互作用對菌株YM-2 EPS產(chǎn)量的影響Fig. 7 Response surface plots showing the effects of various factors on the EPS yield of strain YM-2

由響應(yīng)面優(yōu)化得到EPS合成最優(yōu)條件分別為葡萄糖含量30 g/L、酵母粉含量30 g/L、培養(yǎng)時(shí)間30.05 h、培養(yǎng)溫度36.36 ℃，理論EPS產(chǎn)量為255.254 mg/L，這與驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)獲得的實(shí)際產(chǎn)量257.362 mg/L相近，因此認(rèn)為通過響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)獲得的模型是可信的。植物乳桿菌70810在發(fā)酵條件優(yōu)化（蔗糖含量34 g/L、接種量5%、發(fā)酵溫度31 ℃）后，EPS產(chǎn)量從64.17 mg/L[32]提高到425.16 mg/L[33]。植物乳桿菌C88經(jīng)過發(fā)酵條件優(yōu)化（初始pH 7.0、發(fā)酵溫度37 ℃和添加2%果糖作為碳源），EPS產(chǎn)量從29.86 mg/L提高到40.96 mg/L[6]。植物乳桿菌YM11在優(yōu)化的發(fā)酵條件下，EPS產(chǎn)量為129.915 mg/L[10]。本實(shí)驗(yàn)植物乳桿菌YM-2在優(yōu)化培養(yǎng)條件后EPS產(chǎn)量由（25.450±1.389）mg/L提高到（257.362±0.781）mg/L，產(chǎn)量提高效率達(dá)到90.11%，與植物乳桿菌70810產(chǎn)量提高率（84.91%）和植物乳桿菌C88產(chǎn)量提高率（27.10%）均要高。這可能是因?yàn)樵趦?yōu)化葡萄糖含量與培養(yǎng)溫度的同時(shí)，也優(yōu)化了酵母粉含量和培養(yǎng)時(shí)間。實(shí)驗(yàn)結(jié)果達(dá)到了預(yù)期結(jié)果，為今后更深入研究植物乳桿菌YM-2所產(chǎn)EPS的結(jié)構(gòu)、生理功能以及機(jī)理的闡明提供研究基礎(chǔ)，也為其進(jìn)一步商業(yè)化發(fā)展提供了參考。

3 結(jié) 論

本實(shí)驗(yàn)通過單因素試驗(yàn)分析了植物乳桿菌YM-2合成EPS的最佳條件，并采用Box-Behnken設(shè)計(jì)及響應(yīng)面分析，建立植物乳桿菌YM-2發(fā)酵條件的二次多項(xiàng)模型。經(jīng)檢驗(yàn)證明該模型具有可靠性，能較好地預(yù)測EPS產(chǎn)量。利用模型的響應(yīng)面分析，得到最佳發(fā)酵條件為碳源（葡萄糖）含量30 g/L、氮源（酵母粉）含量30 g/L、培養(yǎng)時(shí)間30.05 h、培養(yǎng)溫度36.36 ℃，此條件獲得的實(shí)際EPS產(chǎn)量為257.362 mg/L。這為今后更深入研究植物乳桿菌YM-2結(jié)構(gòu)、生理功能以及機(jī)理的闡明提供理論依據(jù)，也為其進(jìn)一步商業(yè)化發(fā)展提供了參考。

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Optimization of Biosynthesis Conditions for the Production of Exopolysaccharides by Lactobacillus plantarum YM-2

SI Tianzhao, LIU Chenjian, QIN Xiaomeng, LI Xiaoran, LUO Yiyong, YANG En*
(Faculty of Life Science and Technology, Kunming University of Science and Technology, Kunming 650500, China)

The fermentation conditions for the production of exopolysaccharides (EPS) by Lactobacillus plantarum YM-2, isolated from traditional fermented tempeh in Yunnan province, were optimized. Firstly, the carbon and nitrogen sources in the medium were screened. Secondly, the effects of carbon source concentration, nitrogen source concentration, culture time and culture temperature on EPS yield were studied through one-factor-at-a-time analysis. Finally, response surface methodology (RSM) based on a four-variable, three-level Box-Behnken design was used to determine the optimal culture conditions as follows: carbon source concentration, 30 g/L; nitrogen s ource concentration, 30 g/L; culture time, 30.05 h; and culture temperature, 36.36 ℃. Under these conditions, the yield of EPS was 257.362 mg/L.

Lactobacillus plantarum; exopolysaccharides (EPS); optimization; response surface methodology (RSM)

10.7506/spkx1002-6630-201710005

TS201.3

A

1002-6630（2017）10-0024-07

司天昭, 柳陳堅(jiān), 秦曉萌, 等. 植物乳桿菌YM-2菌株胞外多糖生物合成工藝優(yōu)化[J]. 食品科學(xué), 2017, 38(10): 24-30.

DOI:10.7506/spkx1002-6630-201710005. http://www.spkx.net.cn

SI Tianzhao, LIU Chenjian, QIN Xiaomeng, et al. Optimization of biosynthesis conditions for the production of exopolysaccharides by Lactobacillus plantarum YM-2[J]. Food Science, 2017, 38(10): 24-30. (in Chinese with English abstract) DOI:10.7506/spkx1002-6630-201710005. http://www.spkx.net.cn

2016-07-06

國家自然科學(xué)基金地區(qū)科學(xué)基金項(xiàng)目（31560447）

司天昭（1992—），女，碩士研究生，研究方向?yàn)槭称肺⑸?。E-mail：xizhao_si@126.com

*通信作者：楊恩（1982—），女，講師，博士，研究方向?yàn)槭称肺⑸?。E-mail：enen_yang@126.com