• <tr id="yyy80"></tr>
  • <sup id="yyy80"></sup>
  • <tfoot id="yyy80"><noscript id="yyy80"></noscript></tfoot>
  • 99热精品在线国产_美女午夜性视频免费_国产精品国产高清国产av_av欧美777_自拍偷自拍亚洲精品老妇_亚洲熟女精品中文字幕_www日本黄色视频网_国产精品野战在线观看 ?

    Pseudoalteromonas carrageenovora芳香基硫酸酯酶突變文庫熱穩(wěn)定性提高突變體的篩選及鑒定

    2017-06-05 08:56:56喬超超王新俠李鶴賓肖安風(fēng)朱艷冰
    食品科學(xué) 2017年10期
    關(guān)鍵詞:龍須菜熱穩(wěn)定性基團

    喬超超,王新俠,李鶴賓,倪 輝,肖安風(fēng),朱艷冰,*

    (1.集美大學(xué)食品與生物工程學(xué)院,福建 廈門 361021;2.廈門醫(yī)學(xué)院藥學(xué)系,福建 廈門 361023)

    Pseudoalteromonas carrageenovora芳香基硫酸酯酶突變文庫熱穩(wěn)定性提高突變體的篩選及鑒定

    喬超超1,王新俠1,李鶴賓2,倪 輝1,肖安風(fēng)1,朱艷冰1,*

    (1.集美大學(xué)食品與生物工程學(xué)院,福建 廈門 361021;2.廈門醫(yī)學(xué)院藥學(xué)系,福建 廈門 361023)

    利用易錯聚合酶鏈式反應(yīng)技術(shù)引入隨機誘變,構(gòu)建一個Pseudoalteromonas carrageenovora芳香基硫酸酯酶突變體庫。經(jīng)過篩選,獲得一個芳香基硫酸酯酶熱穩(wěn)定性提高的突變株4-153。序列分析表明,該突變體有2 個氨基酸替換,包括D84A和H260L。以對硝基苯硫酸鉀為底物,突變酶4-153(M4-153)的最適反應(yīng)溫度為55 ℃,在45、50、55、60 ℃處理30 min后,M4-153分別保留85%、83%、48%和13%的殘留酶活力。野生型酶(WT)在45、50、55、60 ℃處理30 min后,分別保留79%、68%、21%和1%的殘留酶活力。M4-153與WT相比具有更好的熱穩(wěn)定性。M4-153的最適反應(yīng)pH值為8.0,在pH 5.0~9.0范圍內(nèi)保持穩(wěn)定。EDTA對突變酶的抑制作用表明,金屬離子在突變酶的催化過程中起重要作用。M4-153對一些洗滌劑,包括Triton X-100、Tween 20、Tween 80和Chaps,有好的耐受性。M4-153對龍須菜粗多糖硫酸基團的脫硫率為79.5%。

    芳香基硫酸酯酶;易錯聚合酶鏈式反應(yīng);熱穩(wěn)定性提高;突變體性質(zhì)

    瓊脂是構(gòu)成紅藻細胞壁的主要結(jié)構(gòu)多糖,由瓊脂糖和硫瓊膠組成[1]。瓊脂糖是由(1-3)-β-D-半乳糖和(1-4)-3,6-內(nèi)醚-α-L-半乳糖相互交替連接而成的長鏈結(jié)構(gòu)[1]。硫瓊膠的結(jié)構(gòu)與瓊脂糖基本相同,主要差別是替換了半乳糖殘基C6位置上的羥基,以硫酸基、甲氧基等基團進行替代[1]。瓊脂的凝膠過程主要是由糖殘基的相互交聯(lián)作用所導(dǎo)致,交聯(lián)越緊密,形成的瓊脂凝膠強度就越大,而硫瓊膠上具有的硫酸基等基團會影響分子間的相互交聯(lián)作用,使得瓊脂凝膠強度降低[2],瓊膠產(chǎn)品質(zhì)量下降。在瓊脂的工業(yè)生產(chǎn)中,脫除硫酸基團是很重要的環(huán)節(jié),最為廣泛的方法為堿法[3]。國內(nèi)外常用的堿法可分為3 種類型:低溫濃堿法、常溫濃堿法和高溫稀堿法[4]。這類方法工藝簡單、操作方便,但是由于處理過程中大量強堿的使用,使得該方法有反應(yīng)難控制、產(chǎn)品得率低、膠質(zhì)易損失和環(huán)境污染嚴重等缺陷。很多研究者開始嘗試探索新的有效方法。芳香基硫酸酯酶能催化芳香基硫酸酯鍵的水解,生成芳基化合物和無機硫酸鹽[5]。芳香基硫酸酯酶具有廣泛的分布性,在真菌[6]、細菌[7]、海膽[8]、海藻[9]、蝸牛[10]、哺乳動物[11]和人體[12]中都有分離得到。其中對一些微生物來源的芳香基硫酸酯酶,這包括從米曲霉[13]、肺炎克雷伯桿菌[14]、肺炎克雷伯菌[15]、海單胞菌[16]、交替假單孢菌[17]、銅綠假單胞菌[7,18]、鼠傷寒沙門氏菌[19]、黏質(zhì)沙雷氏菌[20]、鞘氨醇單胞菌[21]、鏈霉菌[22]和海棲熱袍菌[23]中得到的芳基硫酸酯酶進行了研究,并發(fā)現(xiàn)某些芳香基硫酸酯酶具有可裂解瓊脂上硫酸酯鍵的功能[5,16-17]。利用酶法去除硫酸基團具有反應(yīng)條件溫和、易控制、硫酸基團脫除率高,環(huán)境污染小等優(yōu)點。芳香基硫酸酯酶在瓊脂提取工業(yè)中具有潛在的應(yīng)用價值[24]。

    來自Pseudoalteromonas carrageenovora的芳香基硫酸酯酶對對硝基苯硫酸鉀(potassium 4-nitrophenyl sulfate,p-NPS)有活性,以及有脫除瓊脂硫酸基團的能力[17]。從P. carrageenovora分離得到的芳香基硫酸酯酶基因(984 bp)克隆并在大腸桿菌中表達,發(fā)現(xiàn)45 ℃以上重組酶熱穩(wěn)定性不高。本研究以易錯聚合酶鏈式反應(yīng)(polymerase chain reaction,PCR)為基礎(chǔ)定向進化提高該酶的熱穩(wěn)定性,并研究突變酶的酶學(xué)性質(zhì)。

    1 材料與方法

    1.1 材料與試劑

    E. coli BL21(DE3)、pET-28a質(zhì)粒由集美大學(xué)食品與生物工程學(xué)院發(fā)酵工程實驗室保藏。

    質(zhì)粒提取試劑盒、DNA凝膠回收試劑盒 天根生化科技(北京)有限公司;限制性內(nèi)切酶BamHⅠ和HindⅢ、T4 DNA連接酶、rTaq酶、dNTPs TaKaRa公司;p-NPS 美國Sigma公司。

    1.2 儀器與設(shè)備

    雙層全溫度恒溫搖床 上海智城分析儀器制造有限公司;雙人單面凈化工作臺 蘇州凈化設(shè)備有限公司;酶標儀 美國BioTek公司;超聲細胞破碎儀 美國Sonics公司;數(shù)顯恒溫水浴鍋 常州國華電器有限公司;蛋白電泳儀 美國Bio-Rad公司;小型高速常溫離心機、蛋白核酸測定儀 德國Eppendorf公司;大型高速冷凍離心機 美國Beckman公司;離子色譜 美國Dionex公司;凝膠成像系統(tǒng) 美國GE公司;數(shù)控超聲波清洗器 昆山市超聲儀器有限公司。

    1.3 方法

    1.3.1 芳香基硫酸酯酶隨機突變體庫的構(gòu)建

    P. carrageenovora芳香基硫酸酯酶含有信號肽,其長度為18 個氨基酸。在前期研究中,構(gòu)建了不含信號肽的芳香基硫酸酯酶基因(930 bp)重組質(zhì)粒pET-28a-ars。隨機突變體庫是基于易錯PCR構(gòu)建。以重組質(zhì)粒pET-28aars為模板,使用上游引物ars-F(5’-CGCGGATCCTTT ACGTTTAACGGCAGC-3’)和下游引物ars-R(5’-CCC AAGCTTGCGTTTTAGTTCGTAAC-3’)(劃線部分分別為BamHⅠ和HindⅢ的酶切位點)對目的基因進行擴增??偡磻?yīng)體系為50 μL,其中包含5 μL 10×緩沖液、0.2 μmol/L引物、0.5 mmol/L dTTP、0.5 mmol/L dGTP、0.1 mmol/L dATP、0.1 mmol/L dCTP、1 U rTaq 聚合酶、7 mmol/L MgCl2、2 ng重組質(zhì)粒模板。熱循環(huán)參數(shù)為:95 ℃ 5 min;94 ℃ 45 s,50 ℃ 45 s,72 ℃ 1 min(35 次);72 ℃ 10 min。BamHⅠ和HindⅢ消化后,PCR產(chǎn)物插入pET-28a(+)載體,構(gòu)建重組質(zhì)粒突變文庫。質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21(DE3),生成突變文庫。

    1.3.2 熱穩(wěn)定性提高突變株的篩選

    將文庫的突變子涂布于LB固體培養(yǎng)基(含50 mg/mL卡那霉素和0.05 mmol/mL異丙基-β-D-硫代半乳糖苷(isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside,IPTG),37 ℃過夜培養(yǎng)后,根據(jù)產(chǎn)芳香基硫酸酯酶菌株水解底物p-NPS的顯色反應(yīng)來進行突變文庫的初篩。含有菌株的平板經(jīng)過50 ℃處理2 h后,用含20 mmol/L p-NPS的軟瓊脂覆蓋,這時野生型菌株無顯色反應(yīng),具有顯色反應(yīng)的菌落認為是熱穩(wěn)定性提高的突變株。菌株過夜培養(yǎng)后,按1∶100(V/V)轉(zhuǎn)接到5 mL LB液體培養(yǎng)基(含50 mg/mL卡那霉素)中,37 ℃、180 r/min培養(yǎng)至OD600nm達到0.6,加入終濃度為0.05 mmol/mL IPTG,25 ℃、180 r/min培養(yǎng)10 h。離心收集菌體,重懸于50 mmol/L Tris-HCl緩沖液(pH 7.5)中,在冰浴條件下進行超聲波破碎處理,10 000 r/min離心20 min獲得的上清液即為粗酶液。粗酶液在50 ℃處理2 h后,按下述1.3.5節(jié)的方法檢測酶的殘余活力,進行復(fù)篩驗證。復(fù)篩后得到的熱穩(wěn)定性提高突變株,送至鉑尚生物技術(shù)(上海)有限公司進行基因測序分析。

    1.3.3 重組酶的表達與純化

    突變型和野生型菌株分別接種至200 mL含50 μg/mL卡那霉素的LB培養(yǎng)基中,37 ℃搖動培養(yǎng)至OD600nm達到0.5,然后加入IPTG至終濃度為0.05 mmol/L。在25 ℃孵育10 h后,誘導(dǎo)細胞通過6 000 r/min離心5 min收獲。純化帶有His標簽的蛋白質(zhì),使用Ni Sepharose 6 Fast Flow在自然條件下進行親和層析。純化后的蛋白用Bradford法測定蛋白質(zhì)濃度[25],十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis,SDS-PAGE)分析純化的酶,并對其分子質(zhì)量進行分析。

    1.3.4 芳香基硫酸酯酶的活性測定

    根據(jù)Kim等[17]的方法稍作修改后,測定芳香基硫酸酯酶的活性(文中進行酶學(xué)性質(zhì)分析使用的酶為純化后的酶,除非另有說明)。取80 μL用50 mmol/L Tris-HCl緩沖液(野生型使用pH 7.5,突變體使用pH 8.0)配制的20 mmol/L p-NPS底物溶液,加入20 μL酶液(400 ng),55 ℃孵育10 min后,加入25 μL 5 mol/L NaOH溶液終止反應(yīng)。在410 nm波長處使用分光光度計測定吸光度。在此條件下,每分鐘催化生成1 μmoL對硝基苯酚所需的酶量定義為一個酶活力單位(U)。

    1.3.5 反應(yīng)溫度對酶活性的影響

    突變酶的最適反應(yīng)溫度在30~80 ℃的范圍內(nèi)測定。突變型與野生型酶的熱穩(wěn)定性在45、50、55、60 ℃下進行。將酶在不同溫度條件下處理30 min后,測定酶的殘余活力,以未經(jīng)處理的酶活力作為100%。

    1.3.6 pH值對突變酶活性的影響

    將酶在pH3.0~10.0的緩沖液中于37 ℃放置 1 h后,測定酶的殘余活力。以未經(jīng)處理的酶活力定義為100%。測定使用的緩沖液為:50 mmol/L 磷酸二氫鈉-檸檬酸(pH 3.0~5.0)、50 mmol/L檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液(pH 5.0~7.0),50 mmol/L Tris-HCl緩沖液(pH 7.0~9.0),50 mmol/L甘氨酸-氫氧化鈉緩沖液(pH 9.0~10.0)。

    1.3.7 金屬離子對突變酶活性的影響

    在突變酶中分別添加終濃度為1 mmol/L或10 mmol/L的不同金屬鹽離子,包括NaCl、KCl、CaCl2、MgCl2、ZnCl2、CuCl2、MnCl2、CoCl2和CdCl2。37 ℃條件下放置1 h后,測定酶的殘余活力,研究金屬離子對突變酶活性的影響。以未添加金屬離子的酶活力為100%。

    1.3.8 抑制劑和洗滌劑對突變酶活性的影響

    在突變型芳香基硫酸酯酶中分別添加終濃度為1 mmol/L或10 mmol/L的抑制劑(包括乙二胺四乙酸(ethylenediaminetetraacetic acid,EDTA)、β-巰基乙醇(β-mercaptoethano,β-ME)、二硫蘇糖醇(DL-dithiothreitol,DTT)和苯甲基磺酰氟(phenylmethanesulfonyluoride,PMSF))、0.1%或1%去垢劑(包括Triton X-100、Tween 20、Tween 80、Chaps和SDS)。置于37 ℃條件下放置1 h后,測定酶的殘余活力,研究抑制劑和洗滌劑對突變酶活性的影響。以未添加抑制劑或去垢劑的酶活力為100%。

    1.3.9 動力學(xué)參數(shù)的測定

    400 ng突變酶與不同濃度(0.1~3.0 mmol/L)p-NPS在最適條件下反應(yīng)10 min后,測定酶的活力。用Lineweaver-Burk雙倒數(shù)作圖,得到線性回歸方程,并分析計算酶的動力學(xué)參數(shù)米氏常數(shù)(Km)和最大反應(yīng)速率(vmax)。

    1.3.10 脫除龍須菜粗多糖硫酸基團的研究

    稱取0.1 g龍須菜粗多糖溶解于20 mL 50 mmol/L Tris-HCl(pH 7.5)緩沖液中。分別加入60 U和90 U的野生型或突變型酶,45 ℃條件下處理4 h。將處理后的混合溶液置于尼龍布上,用超純水充分洗滌后,烘干粉碎。稱取等質(zhì)量的經(jīng)過酶處理后與未處理的龍須菜粗多糖,高溫碳化后,置于馬弗爐中550 ℃灰化4 h,將所得灰分全部溶于超純水中,定容至25 mL。取1 mL溶液用0.22 μm的膜過濾后,利用ICS-2100離子色譜測定樣品的硫酸基團含量。以未經(jīng)酶處理的粗多糖為對照,根據(jù)以下公式計算脫硫率:

    2 結(jié)果與分析

    2.1 芳香基硫酸酯酶隨機突變體庫的構(gòu)建與篩選

    芳香基硫酸酯酶基因利用易錯PCR技術(shù)引入隨機誘變,庫容量約為2.0×105。經(jīng)過兩步篩選,發(fā)現(xiàn)突變體4-153與野生型相比熱穩(wěn)定性提高?;蛐蛄蟹治霭l(fā)現(xiàn),野生型與突變型酶基因相比有3 個堿基被替換,導(dǎo)致4-153有2 個氨基酸殘基發(fā)生改變,分別為D84A和H260L(野生型和突變型芳香基硫酸酯酶4-153分別命名為WT和M4-153)。突變酶4-153被選定做進一步的酶學(xué)性質(zhì)研究。

    2.2 突變型和野生型酶的表達與純化

    經(jīng)過誘導(dǎo)表達后,分別對重組的WT和M4-153進行純化。對純化后的蛋白質(zhì)進行SDS-PAGE分析顯示,突變后的芳香基硫酸酯酶大小與野生型一致,并測得WT和M4-153的酶活力分別為11.3、7.8 U/mg。

    圖 1 芳香基硫酸酯酶在大腸桿菌中的表達Fig. 1 Expression of the arylsulfatase genes in E. coli

    2.3 溫度對芳香基硫酸酯酶的影響

    圖 2 溫度對M4-153和WT的影響Fig. 2 Effect of temperature on the activity of M4-153 and WT

    M4-153的最適溫度在30~80 ℃內(nèi)進行測定。如圖2所示,M4-153和WT的最適反應(yīng)溫度為55 ℃,在45~60 ℃溫度范圍內(nèi)仍可以保持超過80%活性(圖2A)。熱穩(wěn)定性分析顯示,在45、50、55、60 ℃條件下處理30 min后,M4-153分別保留了85%、83%、48%、13%的殘余活性,而WT在45、50、55、60 ℃處理30 min后,分別保留了79%、68%、21%、1%的殘余活性(圖2B)。以上結(jié)果表明,突變酶M4-153比野生型酶WT具有更好的熱穩(wěn)定性。

    2.4 pH值對突變酶活性的影響

    芳香基硫酸酯酶M4-153和WT的最適pH值在5.0~10.0的范圍內(nèi)測定,結(jié)果如圖3A所示,M4-153的最適pH值為8.0,WT的最適pH值為7.5。當(dāng)pH值低于6.5或高于9.5,M4-153和WT的酶活性急劇降低。pH值穩(wěn)定性實驗結(jié)果表明,M4-153在pH 5.0~9.0范圍內(nèi)保持穩(wěn)定,在37 ℃放置1 h后仍能保留其原活性的60%以上,而WT在pH 6.0~9.0范圍內(nèi)保持穩(wěn)定,在37 ℃放置1 h后仍能保留其原活性的60%以上(圖3B)。

    圖 3 pH值對M4-153和WT活性和穩(wěn)定性的影響Fig. 3 Effect of pH on the activity and stability of M4-153 and WT

    2.5 金屬離子對突變酶活性的影響

    表 1 金屬離子對突變酶活性的影響Table 1 Effects of metal ions on mutant arylsulfatase activity

    由表1可知,K+對突變芳香基硫酸酯酶活力沒有顯著的影響,而Mg2+、Cu2+、Zn2+、Cd2+會抑制酶的活性,濃度越高抑制越明顯,Zn2+和高濃度的Cu2+會導(dǎo)致酶完全失活。Ca2+對突變酶的活力有一定的促進作用。1 mmol/L的Na+和Mn2+對酶活力沒有影響,而10 mmol/L的Na+、和Mn2+對酶活力具有促進作用。Co2+在1 mmol/L對酶活性有促進作用,當(dāng)濃度增大到10 mmol/L時會稍微抑制酶活力。

    2.6 抑制劑和去垢劑對突變酶活性的影響

    表 2 抑制劑和去垢劑對突變酶的影響Table 2 Effects of inhibitors and detergents on mutant arylsulfatase activity

    由表2可知,抑制劑EDTA、β-ME和DTT都對酶活力有抑制作用,其中最明顯的是EDTA,使得芳香基硫酸酯酶失去超過70%的酶活力。PMSF對酶活性沒有強烈的抑制效果,在濃度為10 mmol/L時,芳香基硫酸酯酶仍可保留89.7%的相對酶活力。去垢劑SDS和1%的Chaps對酶活力有抑制作用,其中SDS抑制效果顯著,在加入1%的SDS時,芳香基硫酸酯酶失去近70%的酶活力。突變酶對Triton X-100、Tween 20和Tween 80有良好的抗性。

    2.7 動力學(xué)參數(shù)

    以p-NPS為底物,用Lineweaver-Burk雙倒數(shù)法做圖,計算突變酶的動力學(xué)參數(shù)。M4-153的Km和vmax值分別為0.73 mmol/L和12.21 μmol/(mg·min)。

    2.8 脫除龍須菜粗多糖的硫酸基團

    由表3可知,在45 ℃條件下處理4 h的條件下,隨著加酶量的增多,龍須菜粗多糖被脫除的硫酸基團就越多。當(dāng)加酶量為90 U時,M4-153能脫除79.5%的硫酸基團,而野生型脫除率為76.3%。

    表 3 突變型和野生型芳香基硫酸酯酶對龍須菜粗多糖硫酸基團的脫除Table 3 Effects of enzymatic treatment with purified mutant and wide-type arylsulfatases on the desulfuration efficiency of crude polysaccharides from Gracilaria lemaneiformis

    3 討 論

    定向進化是一種提高酶熱穩(wěn)定性、底物特異性等的有效方法。基于易錯PCR的定向進化方法,由于簡單易行而被廣泛應(yīng)用[26-27]。本研究利用易錯PCR方法構(gòu)建了一個P. carrageenovora芳香基硫酸酯酶突變體庫,并篩選得到熱穩(wěn)定性提高的突變酶M4-153。

    瓊脂是典型的熱融性分子,需要加熱以成為液體狀態(tài),它的融解溫度為43 ℃,溫度保持在45 ℃以上時不會形成凝膠。因此,水解瓊脂硫酸基團的酶在45 ℃以上保持穩(wěn)定才能在工業(yè)應(yīng)用上有良好的前景。本研究中,突變酶的熱穩(wěn)定性分析結(jié)果顯示,酶在高于45 ℃時熱穩(wěn)定性提高。在相同的條件下,M4-153對龍須菜瓊脂硫酸基團的脫硫率高于WT,并且M4-153在pH 5.0~9.0范圍內(nèi)保持穩(wěn)定,這些提高了突變酶的工業(yè)應(yīng)用前景。

    EDTA對M4-153的酶活性有較強的抑制效果,這表明金屬離子在酶的催化過程中起主要作用。SDS對酶活力也有著抑制作用,推測是由于SDS與芳香基硫酸酯酶的疏水性氨基酸殘基上的烷基結(jié)合并造成影響,來自Marinomonas sp. FW-1的芳香基硫酸酯酶也有著相似的結(jié)果[16]。M4-153在一些洗滌劑的存在下仍然保持相對穩(wěn)定,如Triton X-100、Tween 20、Tween 80和Chaps,這些性質(zhì)提高了該突變酶在工業(yè)利用過程中的潛在價值。

    硫酸基含量是瓊脂的一個重要質(zhì)量標準[28],芳香基硫酸酯酶是一種可在溫和條件下進行瓊脂脫硫的理想候選酶。本研究中當(dāng)突變酶M4-153的加酶量達90 U,在45 ℃處理4 h后,龍須菜粗多糖硫酸基含量下降了79.5%,該突變芳香基硫酸酯酶是瓊脂脫硫應(yīng)用中的潛在催化劑。

    [1] DUCKWORTH M, YAPHE W. The structure of agar: part Ⅰ. Fractionation of a complex mixture of polysaccharides[J]. Carbohydrate Research, 1971, 16(1): 189-197. DOI:10.1016/S0008-6215(00)86113-3.

    [2] ARNOTT S, FULMER A, SCOTT W E, et al. The agarose double helix and its function in agarose gel structure[J]. Journal of Molecular Biology, 1974, 90(2): 269-284. DOI:10.1016/0022-2836(74)90372-6.

    [3] GUISELEY K B. The relationship between methoxyl content and gelling temperature of agarose[J]. Carbohydrate Research, 1970, 13(2): 247-256. DOI:10.1016/S0008-6215(00)80831-9.

    [4] 黃婷婷, 葉李藝, 沙勇, 等. 龍須菜提取瓊膠堿處理工藝條件優(yōu)化[J]. 化學(xué)工程與裝備, 2010(10): 12-15. DOI:10.3969/ j.issn.1003-0735.2010.10.004.

    [5] BOLTES I, CZAPINSKA H, KAHNERT A, et al. 1.3 ? structure of arylsulfatase from Pseudomonas aeruginosa establishes the catalytic mechanism of sulfate ester cleavage in the sulfatase family[J]. Structure, 2001, 9(6): 483-491. DOI:10.1016/S0969-2126(01)00609-8.

    [6] PAIETTA J V. Molecular cloning and regulatory analysis of the arylsulfatase structural gene of Neurospora crassa[J]. Molecular and Cellular Biology, 1989, 9(9): 3630-3637. DOI:10.1128/ MCB.9.9.3630Mol.Cell.Biol.

    [7] BEIL S, KEHRLI H, JAMES P, et al. Purification and characterization of the arylsulfatase synthesized by Pseudomonas aeruginosa PAO during growth in sulfate-free medium and cloning of the arylsulfatase gene (atsA)[J]. European Journal of Biochemistry, 1995, 229(2): 385-394. DOI:10.1111/j.1432-1033.1995.0385k.x.

    [8] YAMADA K, AKASAKA K, SHIMADA H. Structure of sea-urchin arylsulfatase gene[J]. European Journal of Biochemistry, 1989, 186(1/2): 405-410. DOI:10.1111/j.1432-1033.1989.tb15223.x.

    [9] HOSTOS E L, SCHILLING J, GROSSMAN A R. Structure and expression of the gene encoding the periplasmic arylsulfatase of Chlamydomonas reinhardtii[J]. Molecular and General Genetics, 1989, 218(2): 229-239. DOI:10.1007/BF00331273.

    [10] WITTSTOCK U, FISCHER M, SVENDSEN I, et al. Cloning and characterization of two cDNAs encoding sulfatases in the Roman snail, Helix pomatia[J]. International Union of Biochemistry and Molecular Biology Life, 2000, 49(1): 71-76. DOI:10.1080/713803591.

    [11] WAHEED A, RISLEY J M, van ETTEN R L. Structural and immunological relationships among mammalian arylsulfatase a enzymes[J]. Comparative Biochem istry and Physiology Part B: Comparative Biochemistry, 1985, 82(4): 855-862. DOI:10.1016/0305-0491(85)90535-8.

    [12] STEVENS R L, FLUHARTY A L, KILLGROVE A R, et al. Microheterogeneity of arylsulfatase a from human tissues[J]. Biochimica et Biophysica Acta-Enzymology, 1976, 445(3): 661-671. DOI:10.1016/0005-2744(76)90118-2.

    [13] BENKOVIC S J, VERGARA E V, HEVEY R C. Purification and properties of an arylsulfatase from Aspergillus oryzae[J]. Journal of Biological Chemistry, 1971, 246(16): 4926-4933.

    [14] OKAMURA H, YAMADA T, MUROOKA Y, et al. Purification and properties of arylsulfatase of Klebsiella aerogenes identity of the enzymes formed by non-repressed and de-repressed synthesis[J]. Agricultural and Biological Chemistry, 1976, 40(10): 2071-2076. DOI: 10.1080/00021369.1976.10862350.

    [15] MIECH C, DIERKS T, SELMER T, et al. Arylsulfatase from Klebsiella pneumoniae carries a formylglycine generated from a serine[J]. Journal of Biological Chemistry, 1998, 273(9): 4835-4837. DOI:10.1074/jbc.273.9.4835.

    [16] WANG X Y, DUAN D L, XU J C, et al. Characterization of a novel alkaline arylsulfatase from Marinomonas sp. FW-1 and its application in the desulfation of red seaweed agar[J]. Journal of Industrial Microbiology and Biotechnology, 2015, 42(10): 1353-1362. DOI:10.1007/s10295-015-1625-6.

    [17] KIM D E, KIM K H, BAE Y J, et al. Purification and characterization of the recombinant arylsulfatase cloned from Pseudoalteromonas carrageenovora[J]. Protein Expression and Purification, 2005, 39(1): 107-115. DOI:10.1016/j.pep.2004.09.007.

    [18] MARINO T, RUSSO N, TOSCANO M. Catalytic mechanism of the arylsulfatase promiscuous enzyme from Pseudomonas aeruginosa[J]. Chemistry, 2013, 19(6): 2185-2192. DOI:10.1002/chem.201201943.

    [19] HENDERSON M J, MILAZZO F H. Arylsulfatase in Salmonella typhimurium: detection and influence of carbon source and tyramine on its synthesis[J]. Journal of Bacteriology, 1979, 139(1): 80-87.

    [20] MUROOKA Y, YIM M H, HARADA T. Formation and purification of Serratia marcescens arylsulfatase[J]. Applied and Environmental Microbiology, 1980, 39(4): 812-817.

    [21] KIM J H, BYUN D S, GODBER J S, et al. Purification and characterization of arylsulf atase from Sphingomonas sp. AS6330[J]. Applied Microbiology and Biotechnology, 2004, 63(5): 553-559. DOI:10.1007/s00253-003-1463-8.

    [22] UEKI T, SAWADA Y, FUKAGAWA Y, et al. A new type of st reptomycete arylsulfatase with high affinity to the sulfuryl moiety of the substrate[J]. Bioscience, Biotechnology, and Biochemistry, 1995, 59(6): 1069-1075. DOI:10.1271/bbb.59.1069.

    [23] LEE D G, SHIN J G, JEON M J, et al. Heterologous expression and characterization of a recombinant thermophilic arylsulfatase from Thermotoga maritima[J]. Biotechnology and Bioprocess Engineering, 2013, 18(5): 897-902. DOI:10.1007/s12257-013-0094-x.

    [24] SHUKLA M K, KUMAR M, PRASAD K, et al. Partial characterization of sulfohydrolase from Gracilaria dura and evaluation of its potential application in improvement of the agar quality[J]. Carbohydrate Polymers, 2011, 85(1): 157-163. DOI:10.1016/ j.carbpol.2011.02.009.

    [25] BRADFORD M M. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of proteindye binding[J]. Analytical Biochemistry, 1976, 72(1/2): 248-254. DOI:10.1016/0003-2697(76)90527-3.

    [26] MABROUK S B, AYADI D Z, HLIMA H B, et al. Thermostability improvement of maltogenic amylase MAUS149 by error prone PCR[J]. Journal of Biotechnology, 2013, 168(4): 601-606. DOI:10.1016/ j.jbiotec.2013.08.026.

    [27] LIN L, FU C G, HUANG W Q. Improving the activity of the endoglucanase, Cel8M from Escherichia coli by error-prone PCR[J]. Enzyme and Microbial Technology, 2016, 86: 52-58. DOI:10.1016/ j.enzmictec.2016.01.011.

    [28] GUISELEY K B, KIRKPATRICK F H, PROVONCHEE R B, et al. A further fractionation of agarose[J]. Hydrobiologia, 1993, 260(1): 505-511. DOI:10.1007/BF00049063.

    Screening and Characterization of Mutant with Improved Thermostability from a Random Mutant Library of Pseudoalteromonas carrageenovora Arylsulfatase

    QIAO Chaochao1, WANG Xinxia1, LI Hebin2, NI Hui1, XIAO Anfeng1, ZHU Yanbing1,*
    (1. College of Food and Biological Engineering, Jimei University, Xiamen 361021, China; 2. Department of Pharmacy, Xiamen Medical College, Xiamen 361023, China)

    A library of Pseudoalteromonas carrageenovora arylsulfatase mutants was constructed by random mutagenesis using error-prone PCR. After screening, one mutant strain named 4-153 was obtained whose arylsulfatase had improved thermal stability. It was found that there were two amino acid substitutions in the mutant, including D84A and H260L. When p-nitrophenyl sulfate was used as a substrate, the optimal reaction temperature for the mutant enzyme was 55 ℃. Mutant arylsulfatase 4-153 (M4-153) retained 85%, 83%, 48%, and 13% of its initial activity after incubation at 45, 50, 55 and 60 ℃for 30 min, respectively. Meanwhile, wild-type arylsulfatase (WT) retained 79%, 68%, 21%, and 1% of its initial activity after incubation at 45, 50, 55 and 60 ℃ for 30 min, respectively. These results showed that M4-153 had a better thermal stability than WT. M4-153 had an optimum pH of 8.0, and it was stable over the pH range of 5.09.0. Inhibition assay with EDTA indicated that metal ions played an important role in the catalytic process of the mutant enzyme. The recombinant arylsulfatase 4-153 showed a relatively strong tolerance to some detected detergents including Triton X-100, Tween 20, Tween 80, and Chaps. The desulfuration ratio of the crude polysaccharides from Gracilaria lemaneiformis by M4-153 was 79.5%.

    arylesterase; error-prone PCR; improved thermostability; mutant property

    10.7506/spkx1002-6630-201710004

    Q814.9

    A

    1002-6630(2017)10-0018-06

    喬超超, 王新俠, 李鶴賓, 等. Pseudoalteromonas carrageenovora芳香基硫酸酯酶突變文庫熱穩(wěn)定性提高突變體的篩選及鑒定[J]. 食品科學(xué), 2017, 38(10): 18-23. DOI:10.7506/spkx1002-6630-201710004. http://www.spkx.net.cn

    QIAO Chaochao, WANG Xinxia, LI Hebin, et al. Screening and characterization of mutant with improved thermostability from a random mutant library of Pseudoalteromonas carrageenovora arylsulfatase[J]. Food Science, 2017, 38(10): 18-23. (in Chinese with English abstract)

    10.7506/spkx1002-6630-201710004. http://www.spkx.net.cn

    2016-09-02

    國家自然科學(xué)基金青年科學(xué)基金項目(31401632);福建省高校新世紀優(yōu)秀人才支持計劃項目(B15139)

    喬超超(1991—),男,碩士研究生,主要從事食品科學(xué)研究。E-mail:451028523@qq.com

    *通信作者:朱艷冰(1976—),女,副教授,博士,主要從事食品科學(xué)研究。E-mail:yanbingzhu@163.com

    猜你喜歡
    龍須菜熱穩(wěn)定性基團
    海洋科學(xué)(2022年12期)2022-03-01 00:48:32
    R基團篩選技術(shù)用于HDACIs的分子設(shè)計
    芳烴ArCOR的構(gòu)象分析和基團對親電取代反應(yīng)的定位作用
    PVC用酪氨酸鑭的合成、復(fù)配及熱穩(wěn)定性能研究
    中國塑料(2016年7期)2016-04-16 05:25:52
    提高有機過氧化物熱穩(wěn)定性的方法
    可聚合松香衍生物的合成、表征和熱穩(wěn)定性?
    內(nèi)含雙二氯均三嗪基團的真絲織物抗皺劑的合成
    龍須菜寡糖分離純化和抗食物過敏功效的研究
    對羥基安息香醛苯甲酰腙的合成、表征及熱穩(wěn)定性
    兩個含雙磺酸基團化合物的合成、晶體結(jié)構(gòu)及熒光性質(zhì)
    免费av不卡在线播放| 国产视频一区二区在线看| 国产成人啪精品午夜网站| 听说在线观看完整版免费高清| 国产私拍福利视频在线观看| 国产精品香港三级国产av潘金莲| 精品一区二区三区视频在线观看免费| 又黄又粗又硬又大视频| 午夜福利成人在线免费观看| 精品久久久久久成人av| 99热这里只有精品一区 | 欧美黄色淫秽网站| aaaaa片日本免费| 男插女下体视频免费在线播放| 色综合站精品国产| 99在线人妻在线中文字幕| 午夜免费成人在线视频| 日本一本二区三区精品| 99久久综合精品五月天人人| 最新美女视频免费是黄的| 波多野结衣巨乳人妻| 人人妻人人看人人澡| 午夜精品一区二区三区免费看| 蜜桃久久精品国产亚洲av| 99久久综合精品五月天人人| 亚洲第一欧美日韩一区二区三区| 三级毛片av免费| 欧美成人一区二区免费高清观看 | 国产成人av激情在线播放| 国产毛片a区久久久久| 久久人人精品亚洲av| 久久婷婷人人爽人人干人人爱| 久久久成人免费电影| 国产精品免费一区二区三区在线| 午夜影院日韩av| 欧美日韩瑟瑟在线播放| 成人国产综合亚洲| 99国产精品一区二区三区| 一本精品99久久精品77| 久久午夜综合久久蜜桃| 白带黄色成豆腐渣| 色噜噜av男人的天堂激情| 国产精品,欧美在线| 久久精品国产清高在天天线| ponron亚洲| 老熟妇乱子伦视频在线观看| 久久国产精品影院| 国产激情欧美一区二区| 免费观看精品视频网站| 日本在线视频免费播放| 国产单亲对白刺激| 少妇熟女aⅴ在线视频| 精品一区二区三区视频在线观看免费| 日本黄大片高清| 757午夜福利合集在线观看| 窝窝影院91人妻| 天堂av国产一区二区熟女人妻| 黄色片一级片一级黄色片| 一本一本综合久久| 久9热在线精品视频| 亚洲人成伊人成综合网2020| 中文字幕精品亚洲无线码一区| 午夜激情欧美在线| 在线观看免费午夜福利视频| 国产精华一区二区三区| 床上黄色一级片| 19禁男女啪啪无遮挡网站| 国产高清视频在线观看网站| 91麻豆精品激情在线观看国产| 成人三级黄色视频| 日韩欧美 国产精品| 成人国产一区最新在线观看| 亚洲国产看品久久| 国产精品免费一区二区三区在线| 88av欧美| 天天躁狠狠躁夜夜躁狠狠躁| 久久国产乱子伦精品免费另类| 久久国产乱子伦精品免费另类| 国产高清视频在线播放一区| 999久久久国产精品视频| 久久精品91蜜桃| 国产午夜福利久久久久久| 国产免费av片在线观看野外av| 丝袜人妻中文字幕| 真人做人爱边吃奶动态| 巨乳人妻的诱惑在线观看| 亚洲精品美女久久av网站| 偷拍熟女少妇极品色| 嫩草影院入口| 日日干狠狠操夜夜爽| 免费观看人在逋| 18禁美女被吸乳视频| 岛国在线免费视频观看| 欧美黑人巨大hd| 中国美女看黄片| 久99久视频精品免费| 国产av麻豆久久久久久久| 欧美日韩黄片免| 亚洲片人在线观看| 哪里可以看免费的av片| 99国产精品一区二区蜜桃av| 精品国产乱码久久久久久男人| 99国产综合亚洲精品| 亚洲黑人精品在线| 午夜精品在线福利| 在线看三级毛片| 久久伊人香网站| 国产成人av激情在线播放| 黑人操中国人逼视频| 国内精品美女久久久久久| 村上凉子中文字幕在线| 国产蜜桃级精品一区二区三区| 亚洲欧美日韩无卡精品| 国产精品香港三级国产av潘金莲| 日韩欧美精品v在线| 最新中文字幕久久久久 | 日韩三级视频一区二区三区| 久久中文字幕一级| 一本一本综合久久| 两人在一起打扑克的视频| 成人无遮挡网站| 亚洲精品久久国产高清桃花| 亚洲人成电影免费在线| 青草久久国产| 久9热在线精品视频| 97超级碰碰碰精品色视频在线观看| 欧美日韩亚洲国产一区二区在线观看| 国产在线精品亚洲第一网站| 国产1区2区3区精品| 亚洲国产欧美网| 午夜福利在线观看免费完整高清在 | 国模一区二区三区四区视频 | 小说图片视频综合网站| 999久久久国产精品视频| 91字幕亚洲| 国产精品久久久av美女十八| 国产高清激情床上av| 波多野结衣高清作品| 国产一区二区激情短视频| 亚洲五月天丁香| 亚洲成人久久爱视频| 免费观看的影片在线观看| 午夜精品久久久久久毛片777| xxxwww97欧美| 国产1区2区3区精品| 在线十欧美十亚洲十日本专区| 久久精品91蜜桃| av中文乱码字幕在线| 在线永久观看黄色视频| 亚洲狠狠婷婷综合久久图片| 免费大片18禁| 男女之事视频高清在线观看| 欧美激情在线99| 最近在线观看免费完整版| 这个男人来自地球电影免费观看| 国产成人av教育| 女人被狂操c到高潮| 亚洲欧洲精品一区二区精品久久久| 国产av麻豆久久久久久久| 久久热在线av| 不卡av一区二区三区| 国产精品一区二区精品视频观看| 欧美日韩国产亚洲二区| 人妻夜夜爽99麻豆av| 深夜精品福利| 搡老妇女老女人老熟妇| 亚洲精品粉嫩美女一区| 国产亚洲av嫩草精品影院| 国产69精品久久久久777片 | 亚洲成人免费电影在线观看| 日韩精品青青久久久久久| 国产精品日韩av在线免费观看| 久久久久久久精品吃奶| 亚洲欧美激情综合另类| 深夜精品福利| 岛国在线免费视频观看| 亚洲精品456在线播放app | 欧洲精品卡2卡3卡4卡5卡区| 亚洲av成人一区二区三| 99国产精品一区二区三区| 伊人久久大香线蕉亚洲五| 十八禁网站免费在线| 麻豆成人午夜福利视频| av黄色大香蕉| 午夜两性在线视频| 少妇丰满av| 深夜精品福利| 亚洲九九香蕉| 这个男人来自地球电影免费观看| 99riav亚洲国产免费| 日本黄色片子视频| 亚洲第一欧美日韩一区二区三区| 欧美高清成人免费视频www| 99国产精品99久久久久| 久久久久国产精品人妻aⅴ院| 18禁观看日本| 亚洲精品美女久久久久99蜜臀| 精品欧美国产一区二区三| 蜜桃久久精品国产亚洲av| 最新美女视频免费是黄的| 岛国在线观看网站| 午夜福利18| 天天添夜夜摸| 欧美3d第一页| 日本在线视频免费播放| 一级毛片精品| 人妻夜夜爽99麻豆av| 日本黄大片高清| 亚洲成人精品中文字幕电影| 五月伊人婷婷丁香| 黄频高清免费视频| 久9热在线精品视频| 国产又黄又爽又无遮挡在线| 香蕉久久夜色| 亚洲人成网站在线播放欧美日韩| 一区福利在线观看| 国产亚洲欧美98| 婷婷亚洲欧美| 国产欧美日韩一区二区三| 桃红色精品国产亚洲av| 丰满人妻熟妇乱又伦精品不卡| 国产精品99久久99久久久不卡| 免费在线观看影片大全网站| 久久精品夜夜夜夜夜久久蜜豆| 日本免费a在线| 久久久国产成人免费| 两个人看的免费小视频| 又黄又爽又免费观看的视频| 三级国产精品欧美在线观看 | 色播亚洲综合网| 免费观看的影片在线观看| 欧美3d第一页| 欧美在线一区亚洲| bbb黄色大片| 99热精品在线国产| 午夜福利高清视频| 亚洲av成人av| 嫁个100分男人电影在线观看| 亚洲人成伊人成综合网2020| 久久国产精品人妻蜜桃| 亚洲va日本ⅴa欧美va伊人久久| 每晚都被弄得嗷嗷叫到高潮| 18禁国产床啪视频网站| 色精品久久人妻99蜜桃| 高清在线国产一区| 久久香蕉精品热| 最新中文字幕久久久久 | 黄频高清免费视频| 在线免费观看不下载黄p国产 | 99久久99久久久精品蜜桃| 免费av不卡在线播放| 欧美av亚洲av综合av国产av| 亚洲狠狠婷婷综合久久图片| 老司机午夜十八禁免费视频| 国产日本99.免费观看| 天堂影院成人在线观看| 激情在线观看视频在线高清| 久久久久久九九精品二区国产| 日韩 欧美 亚洲 中文字幕| 在线观看美女被高潮喷水网站 | 天堂av国产一区二区熟女人妻| 神马国产精品三级电影在线观看| 日本免费a在线| 久久草成人影院| 看免费av毛片| 好男人电影高清在线观看| 五月玫瑰六月丁香| 一进一出好大好爽视频| 欧美性猛交╳xxx乱大交人| 男人的好看免费观看在线视频| www.精华液| 国产毛片a区久久久久| av欧美777| 亚洲精品中文字幕一二三四区| 很黄的视频免费| 欧美高清成人免费视频www| 三级国产精品欧美在线观看 | 午夜激情福利司机影院| 午夜精品一区二区三区免费看| 国产亚洲av高清不卡| 日韩欧美一区二区三区在线观看| 男女视频在线观看网站免费| 熟女少妇亚洲综合色aaa.| 久久精品国产综合久久久| 国产一级毛片七仙女欲春2| 久久精品国产清高在天天线| cao死你这个sao货| 亚洲精品乱码久久久v下载方式 | 欧美不卡视频在线免费观看| 一进一出抽搐gif免费好疼| 精品乱码久久久久久99久播| 久久久久九九精品影院| 欧美中文综合在线视频| 中文字幕av在线有码专区| 亚洲专区中文字幕在线| 99在线人妻在线中文字幕| 一本久久中文字幕| 窝窝影院91人妻| 亚洲成人免费电影在线观看| 久久99热这里只有精品18| 天天躁日日操中文字幕| 天堂影院成人在线观看| 动漫黄色视频在线观看| 久久精品影院6| 亚洲精品久久国产高清桃花| 狂野欧美白嫩少妇大欣赏| 国产成人av激情在线播放| 久久久久免费精品人妻一区二区| 亚洲中文字幕一区二区三区有码在线看 | 日韩成人在线观看一区二区三区| 亚洲av成人av| 日韩欧美国产在线观看| 999久久久国产精品视频| 一夜夜www| 亚洲国产中文字幕在线视频| 久久精品国产综合久久久| 日韩成人在线观看一区二区三区| 变态另类丝袜制服| 久久久色成人| 高潮久久久久久久久久久不卡| 不卡一级毛片| 国产精品一区二区三区四区久久| 很黄的视频免费| av天堂中文字幕网| 成人特级av手机在线观看| 色综合欧美亚洲国产小说| 国产精品1区2区在线观看.| 国产一区在线观看成人免费| 亚洲无线在线观看| www国产在线视频色| 国语自产精品视频在线第100页| 在线观看一区二区三区| 亚洲av日韩精品久久久久久密| 中文字幕精品亚洲无线码一区| 日本三级黄在线观看| 亚洲午夜精品一区,二区,三区| 久久精品国产亚洲av香蕉五月| 热99re8久久精品国产| 亚洲av五月六月丁香网| 国产蜜桃级精品一区二区三区| 啪啪无遮挡十八禁网站| 国产亚洲欧美98| 欧美绝顶高潮抽搐喷水| 少妇丰满av| 俄罗斯特黄特色一大片| 久久这里只有精品19| 少妇的逼水好多| 成人特级黄色片久久久久久久| 亚洲av成人av| 国产成人一区二区三区免费视频网站| 国产成人精品久久二区二区免费| ponron亚洲| 观看美女的网站| 夜夜夜夜夜久久久久| 成人国产综合亚洲| 国产野战对白在线观看| 黄频高清免费视频| xxx96com| 欧美一区二区精品小视频在线| 亚洲狠狠婷婷综合久久图片| 丰满人妻熟妇乱又伦精品不卡| 99国产极品粉嫩在线观看| 黄片大片在线免费观看| 国产伦在线观看视频一区| 99久久精品热视频| 后天国语完整版免费观看| 在线观看舔阴道视频| 天天躁狠狠躁夜夜躁狠狠躁| 极品教师在线免费播放| 国产成人欧美在线观看| 在线a可以看的网站| 十八禁网站免费在线| 狂野欧美白嫩少妇大欣赏| 亚洲自偷自拍图片 自拍| 日本黄大片高清| 最近视频中文字幕2019在线8| 婷婷丁香在线五月| 久久国产精品影院| 中文字幕熟女人妻在线| 国产日本99.免费观看| 无限看片的www在线观看| 久久精品夜夜夜夜夜久久蜜豆| 99在线视频只有这里精品首页| 观看免费一级毛片| 国内少妇人妻偷人精品xxx网站 | 国产精品亚洲av一区麻豆| 亚洲av五月六月丁香网| 香蕉av资源在线| 久久草成人影院| 欧美+亚洲+日韩+国产| 久久久久国内视频| 日本一本二区三区精品| 三级国产精品欧美在线观看 | 观看免费一级毛片| 国内少妇人妻偷人精品xxx网站 | 国内精品久久久久精免费| 每晚都被弄得嗷嗷叫到高潮| 亚洲av第一区精品v没综合| 精品午夜福利视频在线观看一区| 免费av不卡在线播放| 国产精品一区二区三区四区久久| 国产高清videossex| 宅男免费午夜| 美女被艹到高潮喷水动态| 成人特级av手机在线观看| 黑人操中国人逼视频| 国产av不卡久久| 九色国产91popny在线| 黄色 视频免费看| 国内毛片毛片毛片毛片毛片| 最新美女视频免费是黄的| 国产99白浆流出| av在线天堂中文字幕| 欧美大码av| 亚洲专区中文字幕在线| 国产精品av久久久久免费| 久久久久国产一级毛片高清牌| 亚洲午夜精品一区,二区,三区| 老汉色av国产亚洲站长工具| 亚洲成a人片在线一区二区| av天堂中文字幕网| tocl精华| 国产av在哪里看| 亚洲精品456在线播放app | 18禁观看日本| 欧美激情在线99| 国产av一区在线观看免费| 美女午夜性视频免费| 丰满人妻一区二区三区视频av | 亚洲精品美女久久久久99蜜臀| 美女高潮的动态| 我的老师免费观看完整版| 免费看十八禁软件| 欧美一级a爱片免费观看看| 国产男靠女视频免费网站| 国产成人影院久久av| 免费在线观看视频国产中文字幕亚洲| 18禁国产床啪视频网站| 性欧美人与动物交配| 嫩草影视91久久| 国产69精品久久久久777片 | 久久久国产成人精品二区| 国产乱人视频| 亚洲精华国产精华精| 91九色精品人成在线观看| 亚洲精品美女久久av网站| 国产av一区在线观看免费| 成人av一区二区三区在线看| 18禁美女被吸乳视频| svipshipincom国产片| 日韩欧美国产一区二区入口| 1024手机看黄色片| 黑人操中国人逼视频| 中文字幕人妻丝袜一区二区| 久久久久国产一级毛片高清牌| 亚洲电影在线观看av| 亚洲黑人精品在线| 免费看光身美女| 欧美成人性av电影在线观看| 在线观看免费视频日本深夜| 亚洲成人久久爱视频| 久久久国产欧美日韩av| 99久久精品国产亚洲精品| 大型黄色视频在线免费观看| 黄片大片在线免费观看| 成年版毛片免费区| 国产黄a三级三级三级人| 欧美日韩亚洲国产一区二区在线观看| 亚洲av成人不卡在线观看播放网| 亚洲五月天丁香| 在线观看舔阴道视频| 亚洲熟妇熟女久久| 色av中文字幕| 亚洲精品一区av在线观看| 男人的好看免费观看在线视频| 欧美绝顶高潮抽搐喷水| 极品教师在线免费播放| 在线国产一区二区在线| 亚洲国产精品成人综合色| 午夜福利在线观看免费完整高清在 | 国产一区二区激情短视频| 中文字幕最新亚洲高清| 村上凉子中文字幕在线| 国产美女午夜福利| ponron亚洲| 99riav亚洲国产免费| 又黄又爽又免费观看的视频| 一夜夜www| 久久人妻av系列| 一a级毛片在线观看| 欧美黄色淫秽网站| 97人妻精品一区二区三区麻豆| 欧美国产日韩亚洲一区| 琪琪午夜伦伦电影理论片6080| 亚洲最大成人中文| 亚洲色图 男人天堂 中文字幕| 久久久久亚洲av毛片大全| 亚洲国产中文字幕在线视频| 日韩三级视频一区二区三区| 亚洲最大成人中文| 1024手机看黄色片| 在线视频色国产色| 精品一区二区三区av网在线观看| 中文字幕人妻丝袜一区二区| 免费观看精品视频网站| 亚洲精品美女久久av网站| 精品久久久久久久久久免费视频| 国产精品免费一区二区三区在线| 亚洲天堂国产精品一区在线| 欧美日韩黄片免| 丝袜人妻中文字幕| 又黄又爽又免费观看的视频| 90打野战视频偷拍视频| 中文字幕高清在线视频| 午夜福利免费观看在线| 精品久久久久久久久久免费视频| 九九久久精品国产亚洲av麻豆 | 一级毛片女人18水好多| 国产欧美日韩精品亚洲av| 久久久精品大字幕| 视频区欧美日本亚洲| 老熟妇乱子伦视频在线观看| 亚洲人成电影免费在线| 亚洲片人在线观看| 一级毛片高清免费大全| 久久天躁狠狠躁夜夜2o2o| 久久精品人妻少妇| 精品日产1卡2卡| 精品国产三级普通话版| svipshipincom国产片| 香蕉av资源在线| av黄色大香蕉| 18禁观看日本| 精品一区二区三区视频在线 | 国产精品国产高清国产av| 亚洲七黄色美女视频| 国产伦一二天堂av在线观看| 综合色av麻豆| 天堂av国产一区二区熟女人妻| 亚洲无线在线观看| 久久久久久久久中文| 琪琪午夜伦伦电影理论片6080| 熟女少妇亚洲综合色aaa.| 色吧在线观看| 一级毛片精品| 国产精品爽爽va在线观看网站| 搡老熟女国产l中国老女人| 中文字幕熟女人妻在线| 麻豆一二三区av精品| 亚洲熟妇中文字幕五十中出| 啦啦啦韩国在线观看视频| 麻豆国产97在线/欧美| 欧美三级亚洲精品| 亚洲性夜色夜夜综合| 在线观看舔阴道视频| 国产精品自产拍在线观看55亚洲| 国产午夜精品论理片| 黄频高清免费视频| 欧美日韩瑟瑟在线播放| 色精品久久人妻99蜜桃| 一区二区三区激情视频| 给我免费播放毛片高清在线观看| 麻豆久久精品国产亚洲av| 91九色精品人成在线观看| 18禁观看日本| 成年人黄色毛片网站| 午夜福利在线观看免费完整高清在 | 久久99热这里只有精品18| 国内久久婷婷六月综合欲色啪| 亚洲精品粉嫩美女一区| 国产免费男女视频| 别揉我奶头~嗯~啊~动态视频| 一a级毛片在线观看| 成人精品一区二区免费| 麻豆av在线久日| 亚洲美女黄片视频| 国产又黄又爽又无遮挡在线| 国产黄a三级三级三级人| 国产午夜精品论理片| 一个人观看的视频www高清免费观看 | 在线观看舔阴道视频| av在线天堂中文字幕| 香蕉久久夜色| 亚洲人成伊人成综合网2020| 日本免费一区二区三区高清不卡| 99在线视频只有这里精品首页| 欧美+亚洲+日韩+国产| 少妇的丰满在线观看| 日韩欧美一区二区三区在线观看| 午夜精品一区二区三区免费看| 国产成人精品久久二区二区91| 成人国产一区最新在线观看| 高清在线国产一区| 黄频高清免费视频| 男人舔女人的私密视频| 制服人妻中文乱码| 岛国在线免费视频观看| 日韩欧美国产一区二区入口| 蜜桃久久精品国产亚洲av| 亚洲熟妇中文字幕五十中出| 好看av亚洲va欧美ⅴa在| 母亲3免费完整高清在线观看| 欧美日韩综合久久久久久 | 美女午夜性视频免费| www国产在线视频色| 热99在线观看视频| 国产成人av激情在线播放| 男女床上黄色一级片免费看| 成人精品一区二区免费| 我要搜黄色片| av福利片在线观看| 真人一进一出gif抽搐免费| 日韩欧美 国产精品| e午夜精品久久久久久久| 欧美乱码精品一区二区三区|