抗脫氧雪腐鐮刀菌烯醇納米抗體隨機突變與篩選

吳紅靜，曹冬梅，許 楊,，付金衡，涂 追,*

抗脫氧雪腐鐮刀菌烯醇納米抗體隨機突變與篩選

吳紅靜1,2，曹冬梅1，許 楊1,3，付金衡3，涂 追1,*

（ 1.南昌大學(xué) 食品科學(xué)與技術(shù)國家重點實驗室，江西 南昌 330047；2.南昌大學(xué)科學(xué)技術(shù)學(xué)院，江西 南昌 330029；3.南昌大學(xué)中德聯(lián)合研究院，江西 南昌 330047）

采用易錯聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)技術(shù)，對來源于天然納米抗體文庫的抗脫氧雪腐鐮刀菌烯醇（deoxynivalenol，DON）納米抗體進行隨機突變，通過優(yōu)化和比較突變條件，構(gòu)建了突變分布均勻的突變文庫。噬菌體展示技術(shù)對突變文庫進行了6 輪篩選，獲得了8 種突變序列，其檢測信號為野生型2.1 倍。多序列比對及三維結(jié)構(gòu)建模分析表明，突變序列的突變位點集中于互補決定區(qū)與框架區(qū)連接的區(qū)域，并且部分序列出現(xiàn)了可以形成二硫鍵的氨基酸殘基。研究結(jié)果為抗DON納米抗體進一步的深度突變和改造提供了線索，同時可為其他抗小分子納米抗體的改造提供借鑒。

納米抗體；脫氧雪腐鐮刀菌烯醇；易錯聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)；噬菌體展示

納米抗體是由天然缺失輕鏈的重鏈抗體（heavychain antibodies，HCAbs）可變區(qū)構(gòu)成，又稱為VHH（variable domain of heavy chain of heavy-chain）抗體[1]。納米抗體具有分子質(zhì)量小、易于表達以及穩(wěn)定性好等優(yōu)點，現(xiàn)已廣泛應(yīng)用于生物醫(yī)學(xué)研究、診斷及食品安全等領(lǐng)域[2-5]。近年來，在食品安全檢測領(lǐng)域，納米抗體已成功用于抗原模擬、傳統(tǒng)抗體替代等方面的應(yīng)用[6-9]。雖然如此，目前針對小分子的高親和力納米抗體報道較少，有學(xué)者指出基于納米抗體本身的結(jié)構(gòu)特點，動物免疫系統(tǒng)可能并不適合產(chǎn)生高親和力的抗小分子納米抗體[10]。因此，采用體外突變和分子改造技術(shù)可為提高納米抗體的親和力、穩(wěn)定性等特性提供有效途徑[11-14]。

脫氧雪腐鐮刀菌烯醇（deoxynivalenol，DON）屬于B類單端孢霉烯族真菌毒素，是一種由真菌產(chǎn)生的次級代謝產(chǎn)物[15]。前期研究從天然納米抗體噬菌體展示文庫中篩選獲得了可特異結(jié)合DON的納米抗體，命名為DONIV2[16]。本研究采用易錯聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（error prone polymerase chain reaction，epPCR）對DONIV2進行隨機突變，通過噬菌體展示技術(shù)對突變文庫進行淘選，比較突變序列氨基酸殘基變化以及突變位點三維結(jié)構(gòu)的位置，分析抗DON納米抗體與DON相互作用的機制和特點，為定向改造研究提供線索。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株與質(zhì)粒

大腸桿菌（Escherichia coli）TG1，含有抗DON納米抗體編碼基因的質(zhì)粒pRX2-DONIV2，噬菌粒pHEN1和輔助噬菌體KM13均為實驗室保藏[16]。

1.1.2 試劑

限制性內(nèi)切酶、Taq DNA聚合酶、TA克隆載體（pMD18-T）及各種DNA試劑盒 TaKaRa公司；T4連接酶 New England Biolab公司；酵母膏、蛋白胨英國Oxoid公司；辣根過氧化物酶偶聯(lián)的抗M13單克隆抗體（HRP/Anti-M13 Monoclonal Conjugate） 美國GE Healthcare公司；氨芐青霉素、卡那霉素、四甲基聯(lián)苯胺、牛血清白蛋白（bovine serum albumin，BSA）、卵清白蛋白（ovalbumin，OVA）、脫脂乳 上海生物工程有限公司；其他化學(xué)試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.1.3 引物

表 1 隨機突變及鑒定所用的引物Table 1 Primers used for epPCR

隨機突變以及突變文庫鑒定所用的引物見表1。引物T7prom和T7term為載體pRX2的通用引物，分別位于抗DON納米抗體編碼基因兩側(cè)；引物M13和pHEN-R為載體pHEN1通用引物。PCR引物合成和DNA測序委托上海英俊生物技術(shù)有限公司。

1.2 方法

1.2.1 易錯PCR

常規(guī)PCR體系（25 μL）中含有模板DNA（pRX2-DONIV2）10 ng、引物各10 pmol、10×PCR緩沖液（不含Mg2+）、TritonX-100 0.01%、MgCl21.5 mmol/L、dNTP各0.16 mmol/L、Taq聚合酶1.25 U。PCR擴增條件：94 ℃預(yù)變性3 min；94 ℃、30 s，60 ℃、30 s，72 ℃、1 min，10 個循環(huán)；94 ℃、30 s，55 ℃、30 s，72 ℃、1 min，25 個循環(huán)；72 ℃延伸10 min。

易錯PCR體系在常規(guī)PCR體系的基礎(chǔ)上進行，擴增條件相同，對Mg2+濃度、Mn2+濃度、TritonX-100濃度進行單因素試驗。單因素優(yōu)化后的條件下，設(shè)置Ⅰ和Ⅱ兩組不同的dNTP濃度，Ⅰ組的4 種dNTP濃度均為0.16 mmol/L，Ⅱ組dATP和dGTP濃度均為0.16 mmol/L、dTTP和dCTP濃度均為1 mmol/L。

Ⅰ和Ⅱ兩組易錯PCR條件下的產(chǎn)物分別以1.2%的瓊脂糖凝膠電泳分離，DNA凝膠回收試劑盒回收目的條帶，然后按照TA克隆試劑盒說明，分別將兩種純化的易錯PCR產(chǎn)物克隆到pMD18-T載體，氯化鈣法轉(zhuǎn)化大腸桿菌TG1感受態(tài)細(xì)胞，分別隨機挑選10 個克隆進行測序。對兩組易錯PCR產(chǎn)物的突變位點、突變率以及突變類型等指標(biāo)進行比較分析，選擇適當(dāng)突變率、突變分布均勻的易錯PCR產(chǎn)物構(gòu)建文庫。

1.2.2 易錯PCR文庫的構(gòu)建與鑒定

將易錯PCR產(chǎn)物與噬菌粒pHEN1分別用限制性內(nèi)切酶SfiⅠ和NotⅠ雙酶切，經(jīng)瓊脂糖凝膠回收、定量后，以物質(zhì)的量比3∶1，16 ℃條件下過夜連接。連接產(chǎn)物經(jīng)乙醇沉淀后，溶于10 μL無菌水，電穿孔轉(zhuǎn)化大腸桿菌TG1，感受態(tài)細(xì)胞的制備與轉(zhuǎn)化，按照參考文獻[18]進行。取10 μL電擊、培養(yǎng)后的菌液倍比稀釋，涂布LB（含100 μg/mL氨芐青霉素）培養(yǎng)板，計算庫容。其余部分全部涂布于24 cm×24 cm LB（含100 μg/mL氨芐青霉素）培養(yǎng)板，37 ℃條件下倒置培養(yǎng)16 h。用5 mL LB培養(yǎng)基將培養(yǎng)板上的菌苔刮洗后，加入終含量25%甘油，分裝，－80 ℃條件下保存?zhèn)溆?。從計算庫容的平板上隨機挑取10 個克隆，采用通用引物M13-R和pHEN-R進行菌落PCR驗證，計算有效庫容量。

接種至少10 倍庫容量的活細(xì)胞于5 mL的LB（含2%葡萄糖，100 μg/mL氨芐青霉素），30 ℃、220 r/min振搖培養(yǎng)至OD600nm達0.5，按感染復(fù)數(shù)20∶1加入輔助噬菌體，37℃、220 r/min振搖培養(yǎng)60 min。將培養(yǎng)物離心，用50 mL LB（含100 μg/mL 氨芐青霉素、50 μg/mL卡那霉素）重懸沉淀，30 ℃、220 r/min振搖培養(yǎng)過夜后，3 000×g離心取上清液，按標(biāo)準(zhǔn)的聚乙二醇/NaCl法純化噬菌體[18]，即得到噬菌體抗體文庫，取10 μL測定滴度，其余分裝于－80 ℃條件下保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3 噬菌體擴增、純化和滴度測定

[18]進行測定。

1.2.4 易錯PCR文庫的淘選

以甲基化牛血清白蛋白（methylated BSA，MBSA）為載體，參考文獻[17]制備DON人工抗原DON-MBSA。采用競爭洗脫法對突變文庫進行淘選，方法參見文獻[19]，人工抗原DON-MBSA（100 μg/mL）包被酶標(biāo)板，每輪3% BSA和3% OVA交替封閉，競爭洗脫采用50 ng/mL的DON溶液孵育1 h。

1.2.5 間接phage-ELISA

采用phage-ELISA法對淘選后的克隆進行親和力鑒定[20]。酶標(biāo)板中包被磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered saline，PBS）稀釋的人工抗原DON-MBSA（1 μg/mL），3%脫脂乳封閉后，分別加入淘選后的噬菌體克隆和未突變的原始噬菌體克隆DONIV2，PBST（含0.5%吐溫20的PBS溶液）洗板后，以HRP/Anti-M13（用3%脫脂乳，按1∶5 000（V/V）稀釋）檢測吸附的噬菌體。

1.2.6 三維結(jié)構(gòu)模擬與對比

采用I-TASSER4.4軟件建立納米抗體的三維結(jié)構(gòu)[21-22]。預(yù)測結(jié)果采用軟件UCSF Chimera進行顯示和編輯[23]。

2 結(jié)果與分析

2.1 隨機突變文庫的構(gòu)建與鑒定

2.1.1 易錯PCR條件的優(yōu)化

圖 1 不同Mg2＋濃度條件下易錯PCR電泳圖Fig. 1 Effects of Mg2+concentration on the epPCR

為了獲得隨機突變的編碼基因，同時保證擴增產(chǎn)物特異性和產(chǎn)量，在普通PCR的基礎(chǔ)上，首先對Mg2+、Mn2+濃度、TritonX-100濃度進行了單因素優(yōu)化試驗。如圖1所示，隨著Mg2+濃度的增加，擴增產(chǎn)物濃度下降，當(dāng)Mg2+濃度大于6 mmol/L時，凝膠電泳未檢測到擴增產(chǎn)物。高濃度的Mg2+能穩(wěn)定錯配的堿基對，因此選擇較高的Mg2+濃度6 mmol/L。

圖 2 不同Mn2＋濃度條件下易錯PCR電泳圖Fig. 2 Effects of Mn2+concentration on the epPCR

反應(yīng)體系中加入Mn2+可以降低聚合酶對模板的特異性，提高錯配率。Mn2+濃度優(yōu)化結(jié)果如圖2所示，當(dāng)Mn2+濃度降至0.2 mmol/L時，凝膠電泳出現(xiàn)特異性目的條帶，選擇Mn2+適宜濃度為0.2 mmol/L。

圖 3 不同TritonX-100體積分?jǐn)?shù)條件下易錯PCR電泳圖Fig. 3 Effects of TritonX-100 concentration on the epPCR

反應(yīng)體系中TritonX-100體積分?jǐn)?shù)對易錯PCR的影響結(jié)果如圖3所示，PCR產(chǎn)物的量隨著TritonX-100體積的提高而增加，當(dāng)體積分?jǐn)?shù)達到0.04%時，PCR產(chǎn)物產(chǎn)量最大（泳道4）。

2.1.2 易錯PCR產(chǎn)物突變分析

表 2 突變產(chǎn)物序列分析Table 2 Mutation spectrum of random mutagenesis

分別隨機挑取10 個兩組不同dNTP組分條件下的易錯PCR產(chǎn)物進行序列分析，突變條件Ⅰ的總突變率為1.16%，突變條件Ⅱ的總突變率為0.86%，發(fā)生的突變絕大多數(shù)為點突變，缺失和插入較少（表2）。突變條件Ⅱ的轉(zhuǎn)換比例（A∶T→G∶C/G∶C→A∶T）較突變條件Ⅰ小，即轉(zhuǎn)換的偏好性更低，同時條件Ⅱ產(chǎn)物突變點的分布比條件Ⅰ突變點的分布更為均勻，綜合考慮，采用突變條件Ⅱ的產(chǎn)物進行文庫構(gòu)建，平均每個克隆突變3～4 個核苷酸位點。

2.2 隨機突變文庫的構(gòu)建、淘選與鑒定

2.2.1 文庫的構(gòu)建與淘選

將易錯PCR產(chǎn)物用SfiⅠ和NotⅠ雙酶切，凝膠電泳回收純化，連接至噬菌粒載體pHEN1，連接產(chǎn)物電轉(zhuǎn)化大腸桿菌TG1感受態(tài)細(xì)胞，菌落計數(shù)結(jié)果顯示，獲得約6×106個獨立克隆，輔助噬菌體救援后得到噬菌體展示文庫滴度約為2.7×1013CFU/mL。

圖 4 間接phage-ELISA測定每輪擴增產(chǎn)物Fig. 4 Indirect phage-ELISA of amplified phages from each round of panning

采用固相篩選的方法，對隨機突變文庫進行了6 輪篩選，phage-ELISA檢測擴增后的每輪競爭洗脫物，結(jié)果顯示在同樣的實驗條件下，OD450nm隨著淘選的進行而升高，提示親和力提高的突變得到了富集（圖4）。

2.2.2 phage-ELISA鑒定陽性克隆

圖 5 陽性克隆多序列比對結(jié)果Fig. 5 Multi-sequence alignment of mutants

從第6輪淘選競爭洗脫產(chǎn)物測定滴度的平板上，隨機挑取96 個克隆，經(jīng)輔助噬菌體救援后，進行phage-ELISA檢測。以未突變的野生型克隆DONIV2作為對照，設(shè)置OD450nm為對照的2.1 倍為陽性標(biāo)準(zhǔn)，測定的96 個克隆中，共有30 個克隆為陽性，陽性率達31.3%。陽性克隆測序分析結(jié)果顯示，共獲得了8 條不同的突變序列（圖5）。

2.3 三維結(jié)構(gòu)模擬與分析

圖 6 抗DON納米抗體三維結(jié)構(gòu)模擬與對比Fig. 6 Three-dimensional structure modeling

采用蛋白建模軟件I-TASSER4.4，對突變前野生型抗DON納米抗體DONIV2和2 個出現(xiàn)頻率最高的突變子6A-B5和6A-D12進行三維結(jié)構(gòu)建模，結(jié)果如圖6A～C所示。通過結(jié)構(gòu)對比發(fā)現(xiàn)，突變子的CDR3區(qū)域的結(jié)構(gòu)與突變前的CDR3區(qū)域結(jié)構(gòu)差異較大，其他部分主鏈結(jié)構(gòu)基本一致（圖6D）。

3 結(jié) 論

突變方法及反應(yīng)條件對目的序列的突變率、突變位點等結(jié)果具有明顯的影響。Rasila等[24]對易錯PCR、化學(xué)突變和高突變菌株3 種突變方法的效果進行了詳細(xì)的比較研究，發(fā)現(xiàn)易錯PCR的突變率高和突變范圍更廣。本研究對易錯PCR突變的條件進行了優(yōu)化和比較，選擇突變率適宜、突變位點分布均勻的突變條件，為鑒定影響結(jié)合活性的關(guān)鍵區(qū)域提供了基礎(chǔ)。

通過比較突變前后氨基酸序列的變化，發(fā)現(xiàn)突變位點明顯集中在CDR與FR連接的區(qū)域（圖5），而CDR形成loop結(jié)構(gòu)的位置發(fā)生突變較少，說明抗原結(jié)合表位可能直接由CDR-loop組成，這與分子對接結(jié)果吻合[25]。Min等[12]通過酵母展示系統(tǒng)對抗黃曲霉毒素B1的親和力成熟的研究中，也發(fā)現(xiàn)大多數(shù)發(fā)生突變的位點不在CDR區(qū)域。值得注意的是，部分突變子（6A-D12和6A-H8）同時突變得到2 個半胱氨酸殘基，三維結(jié)構(gòu)模型顯示，2 個半胱氨酸殘基空間位置相鄰（圖6C），可形成新的二硫鍵，穩(wěn)定蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)，提示在蛋白質(zhì)的設(shè)計和改造中，引入二硫鍵有利于穩(wěn)定分子結(jié)構(gòu)。

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Random Mutation and Mutant Screening of Anti-Deoxynivalenol Nanobody

WU Hongjing1,2, CAO Dongmei1, XU Yang1,3, FU Jinheng3, TU Zhui1,*
(1. State Key Laboratory of Food Science and Technology, Nanchang University, Nanchang 330047, China; 2. College of Science and Technology, Nanchang University, Nanchang 330029, China; 3. Jiangxi-OAI Joint Research Institution, Nanchang University, Nanchang 330047, China)

In this work, an anti-deoxynivalenol nanobody isolated from a naive phage display library was adopted to investigate the relationship between bioactivity and the composition of amino acid residues using error prone polymerase chain reaction (epPCR) and phage display. The epPCR was firstly optimized to produce a phage display library with balanced distribution of mutation. After six rounds of panning of the mutant library, 30 out of 96 picked clones exhibited 8 different mutations, whose signal was 2.1 folds higher than that of the wild-type clone. Multi-sequence alignment analysis showed that mutant sites were prone to be found in the junction region between complementarity determining regions (CDRs) and framework regions (FRs). Three-dimensional structure modeling results indicated that some mutants were capable of forming an intramolecular disulphide bond, which benefits to stabilize the molecular structure. These data can provide a clue for further mutation and modification of anti-deoxynivalenol nanobody and also provide a guideline for the design of nanobody recognizing other low molecular weight compounds.

nanobody; deoxynivalenol; error prone PCR; phage display

10.7506/spkx1002-6630-201710001

TS201.6

A

1002-6630（2017）10-0001-05

吳紅靜, 曹冬梅, 許楊, 等. 抗脫氧雪腐鐮刀菌烯醇納米抗體隨機突變與篩選[J]. 食品科學(xué), 2017, 38(10): 1-5. DOI:10.7506/spkx1002-6630-201710001. http://www.spkx.net.cn

WU Hongjing, CAO Dongmei, XU Yang, et al. Random mutation and mutant screening of anti-deoxynivalenol nanobody[J]. Food Science, 2017, 38(10): 1-5. (in Chinese with English abstract)

10.7506/spkx1002-6630-201710001. http://www.spkx.net.cn

2016-06-12

國家自然科學(xué)基金青年科學(xué)基金項目（31301479）；江西省教育廳科學(xué)技術(shù)研究項目（GJJ151502）；南昌大學(xué)科學(xué)技術(shù)學(xué)院自然科學(xué)基金項目（2013-ZR-05）

吳紅靜（1981—），女，講師，碩士，研究方向為食品安全與營養(yǎng)。E-mail：51531843@qq.com

*通信作者：涂追（1982—），男，副研究員，博士，研究方向為食品安全與生物技術(shù)。E-mail：tuzhui@ncu.edu.cn