雙波輔助提取結(jié)合雙水相萃取分離純化龍須菜多糖研究

顏曉琳，劉 楊

（汕頭大學(xué)理學(xué)院生物系，廣東省海洋生物技術(shù)重點實驗室，廣東 汕頭 515063）

雙波輔助提取結(jié)合雙水相萃取分離純化龍須菜多糖研究

顏曉琳，劉 楊

（汕頭大學(xué)理學(xué)院生物系，廣東省海洋生物技術(shù)重點實驗室，廣東 汕頭 515063）

對龍須菜多糖雙波輔助提取工藝進(jìn)行響應(yīng)面法優(yōu)化，最佳條件為：超聲波50 W，提取時間31.7 min、微波溫度87℃、料液比1∶60.7，在此條件下龍須菜多糖提取率為34.84%。篩選雙水相體系獲得一種可較好去除蛋白的乙醇/（NH4）2SO4雙水相體系.結(jié)果表明：雙水相系線長度為50時，中間相龍須菜粗多糖回收率最高可達(dá)81.1%，證實雙波輔助提取結(jié)合雙水相萃取可成為一種龍須菜粗多糖提取的有效技術(shù)手段.

雙波提?。缓Ｔ宥嗵?；雙水相體系

龍須菜[1-2]（Gracilaria lamaneiformis）又名海發(fā)菜，屬紅藻門、真紅藻綱、杉藻目、江蘺科，龍須菜多糖（GLP）是從龍須菜中提取分離出來的一類具有免疫調(diào)節(jié)活性、抗腫瘤、抗病毒、抗氧化等功能的重要天然生物活性物質(zhì)[3-8].

龍須菜多糖傳統(tǒng)提取工藝[9-10]主要為熱水浸提，而近年來超聲波[11]、微波提取法[12-15]被應(yīng)用于中藥化學(xué)成分的提取，其主要特點是快速、節(jié)能、節(jié)省溶劑、污染小而且有利于萃取熱不穩(wěn)定的物質(zhì)，可避免長時間的高溫引起的物質(zhì)分解.雙水相系統(tǒng)（Aqueous Two-Phase Systems，ATPS）由水溶性的不同化合物混合，并在其臨界濃度以上形成的具有清晰界面，熱力學(xué)穩(wěn)定的兩個不相溶的液相.雙水相系統(tǒng)優(yōu)勢為：溫和液相環(huán)境；能進(jìn)行連續(xù)分離操作；易于產(chǎn)業(yè)化和擴(kuò)大化等[16].由于其兩相都是水溶液，可作為萃取體系用于生物活性物質(zhì)的萃取分離及分析，其最大的優(yōu)勢在于可為生物活性物質(zhì)提供一個溫和的分離環(huán)境.在應(yīng)用雙水相萃取分離技術(shù)過程中，不同系線長度下的上、下相成相組分濃度不同，而不同的成相組分濃度對目標(biāo)產(chǎn)物的分離效果有很大影響[17-18].

本課題以龍須菜為研究對象，采用雙波輔助提取龍須菜粗多糖，將雙水相系統(tǒng)應(yīng)用于龍須菜多糖物質(zhì)的分離和富集，篩選出合適的雙水相體系，能夠同時除去龍須菜中的雜蛋白并富集龍須菜活性多糖.

1 材料與儀器

龍須菜采自汕頭市南澳島（5月份），原料除盡雜砂，洗凈后于60℃下烘干，粉碎過40目篩，置于試劑瓶中密閉保存?zhèn)溆?，使用時在105℃下干燥至恒重.

實驗用的試劑均為分析純.

UV-1800PC掃描型紫外可見分光光度計購買于上海MAPADA公司；JA100電子分析天平購買于上海精密科學(xué)儀器有限公司；RE-52AA型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀購買于上海亞榮生化儀器廠；TDL-5M臺式大容量冷凍離心機(jī)購買于長沙湘儀離心機(jī)有限公司；BCD-188T容聲冰箱購買于廣東容聲股份有限公司；CW-2000超聲-微波協(xié)同萃取儀購買于上海新拓分析科技有限公司.

2 實驗方法

2.1 龍須菜多糖提取工藝

稱取龍須菜粉末進(jìn)行微波超聲提取，提取液離心，上清液于-40℃條件下冷凍過夜，然后置于4℃中溶化，溶化液離心，上清液濃縮后用3倍量無水乙醇沉淀多糖，離心去除上清液，將沉淀物溶于適量蒸餾水中制備粗多糖提取液備用.

2.2 多糖的測定

采用苯酚-硫酸比色法.準(zhǔn)確稱取在105℃干燥至恒重的葡萄糖10 mg，溶于100 mL容量瓶中，定容至刻度，得到濃度為0.1 mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)溶液.準(zhǔn)確吸取0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液，用去離子水補(bǔ)齊到1.0 mL，加入5%苯酚溶液1.0 mL，混勻后靜置2 min左右使之充分反應(yīng)，加入5.0 mL濃硫酸溶液，充分混勻后室溫放置.以去離子水為空白管，在490 nm處分別測定吸光度，以葡萄糖濃度（mg/mL）為橫坐標(biāo)，吸光度為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線并進(jìn)行線性回歸.

2.3 多糖的提取

取干粉分別以不同的提取時間、浸提溫度、料液比在50 W超聲波和500 W微波條件下進(jìn)行單因素試驗，選取提取溫度5～40 min，浸提溫度50～95℃，料液比1∶40～1∶100（w/v）等條件，以多糖得率為考察指標(biāo)，考察各因素對多糖提取得率的影響，為響應(yīng)面法優(yōu)化多糖提取工藝提供依據(jù).提取得率計算公式（1）如下：

式中Y為多糖提取得率，m為所得多糖質(zhì)量，M為樣品質(zhì)量.

在單因素實驗基礎(chǔ)上，根據(jù)實驗結(jié)果設(shè)定響應(yīng)面實驗因素與水平，以多糖提取得率作為響應(yīng)值，通過Minitab軟件設(shè)計及響應(yīng)面優(yōu)化進(jìn)行分析，響應(yīng)面實驗因素與水平設(shè)計如表1.

2.4 雙水相體系篩選

按照上述實驗方法提取龍須菜粗多糖，然后根據(jù)相圖配制成雙水相體系（ATPS）并混勻30 min；將雙水相富集的龍須菜粗多糖體系靜置分相，分別測定上下相體積，利用苯酚-硫酸法測定兩相中多糖濃度；根據(jù)多糖濃度計算出GLP在下相中的收率（Y）及分配系數(shù)（K）.

式中cb和ct分別代表多糖在上下相中濃度，Vt和Vb分別代表上下相體積，K為分配系數(shù)，Yb為收率.

表1 響應(yīng)面分析實驗設(shè)計

3 結(jié)果與討論

3.1 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線

根據(jù)苯酚-硫酸法測定并繪制葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線如圖1，該實驗重復(fù)3次，所得結(jié)果R2＝0.9988，y＝4.7457x－0.0068，該實驗重復(fù)性好，數(shù)據(jù)擬合度高.

圖1 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線

3.2 龍須菜多糖提取的單因素實驗

由圖2可知，龍須菜粗多糖得率隨著提取時間的增加而升高；當(dāng)提取時間從5 min增加到30 min時，龍須菜粗多糖得率顯著增加；從30 min增加到40 min時，多糖提取率變化不大.這是因為隨著提取時間的延長，多糖逐漸溶解于水中，但時間增加到一定程度時，多糖基本已經(jīng)完全溶出，因此增加緩慢，且多糖長時間在高溫下也會有一定程度的降解和失活，因此選擇提取時間為30 min.龍須菜粗多糖得率隨著溫度升高而升高；提升至一定溫度后得率趨于穩(wěn)定不變，這是因為隨著溫度升高多糖在水中溶解度也隨著升高，此時蛋白易變性離心后沉淀下來，進(jìn)一步增加了多糖含量及純度，但溫度過高會增加能量消耗，但多糖溶出增加量少，因此水浴溫度不宜過高，選擇提取溫度為80℃.龍須菜粗多糖得率隨著料液比的增加變化不明顯，逐漸趨向平緩，考慮到溶液體積過大不利于后續(xù)的濃縮操作且增加提取成本，選擇多糖提取的料液比為1:50.

圖2 不同提取條件對多糖提取得率的影響

3.3 龍須菜多糖提取響應(yīng)面優(yōu)化結(jié)果

根據(jù)單因素實驗結(jié)果，以A、B和C為實驗中自變量，以粗多糖得率（Y）為響應(yīng)值，進(jìn)行響應(yīng)面實驗，結(jié)果如表2.

表2 響應(yīng)面分析實驗結(jié)果

對所得數(shù)據(jù)采用Minitab進(jìn)行回歸分析.得到模型回歸方程的方差分析如表3所示.

根據(jù)表3回歸模型方差實驗結(jié)果，回歸模型（P＜0.01）極其顯著，線性（P＜0.01），平方（P＜0.01），這些數(shù)據(jù)表明回歸模型可以很好地反映多糖得率與單因素的關(guān)系.此外，模型回歸（P＜0.01）極其顯著，失擬（P＞0.05）不顯著，說明回歸模型與預(yù)測值之間有良好的擬合度，因此該模型可以用于預(yù)測龍須菜多糖得率的實際情況.

由表4可知，自變量A、B、C對多糖得率的影響大小關(guān)系為C＞B＞A，即：料液比＞溫度＞提取時間；此外，因素B、C、A2、C2的P值均小于0.01，即對多糖提取得率的線性效應(yīng)均極顯著，因素B2對多糖得率Y影響顯著，而其他因素不顯著.

各因素回歸擬合后得到如下回歸方程：

當(dāng)參數(shù)A＝31.7 min，B＝87℃，C＝1:60.7時，在此最佳工藝條件下進(jìn)行驗證實驗（n＝3），結(jié)果表明，多糖提取得率為34.84%，與模型所得理論值34.96%相近，偏差較小.表明Box-Benhnken實驗設(shè)計所得到的模型擬合度高，能較真實反映各實驗因素對龍須菜多糖提取得率的影響，可用于優(yōu)化龍須菜多糖的提取工藝.

圖3為響應(yīng)面分析的曲面圖和等值線圖，這些圖可以直接看出各個因素及水平對多糖得率的直觀影響.

表3 方差分析

表4 回歸方程系數(shù)檢驗

3.4 雙水相純化龍須菜多糖

雙水相體系對龍須菜多糖分配系數(shù)的影響結(jié)果如圖4，從圖中可以看出不同體系對GLP的分配系數(shù)不同，隨著TLL增加，PEG1000/（NH4）2SO4分配系數(shù)表現(xiàn)為先增加后減小，這是由于PEG隨著濃度增加，其對多糖分子的粘性增加，但由于PEG1000分子量偏小，繼續(xù)增加濃度時，其對多糖的粘性變化較小，而（NH4）2SO4對多糖的滯留效果開始展現(xiàn)出來，因此隨后出現(xiàn)了后減小的趨勢；PEG1000，PEG2000，PEG4000/（NH4）2SO4的K表現(xiàn)為逐漸減小，表明多糖隨著PEG分子量的增大逐漸分配到下相，PEG對多糖的粘性變化較小，而（NH4）2SO4對多糖的滯留效果開始展現(xiàn)出來；而乙醇/（NH4）2SO4體系中，下相比上相更多富集多糖，但是在乙醇-硫酸銨體系中出現(xiàn)明顯中間相，多糖更多的被富集于中間相.這是因為乙醇為小分子有機(jī)物，可以對多糖起到排斥沉淀的作用.

圖3 為響應(yīng)面分析的曲面圖和等值線圖

乙醇/（NH4）2SO4體系中不同TLL下GLP在各相的回收率如下圖5，從圖中可以看出，隨著TLL增加，GLP回收率逐漸增加，TLL＝55時下相會有一部分鹽析出影響實驗結(jié)果，因此選擇TLL＝50，此時多糖大量富集在中間相，GLP回收率Y＝81.1%.

圖4 不同雙水相體系對多糖的分配系數(shù)

圖5 乙醇/（NH4）2SO4體系中不同TLL下多糖在各相的回收率

4 小結(jié)

通過雙波輔助提取龍須菜粗多糖，并對此工藝過程進(jìn)行響應(yīng)面實驗設(shè)計優(yōu)化，優(yōu)化的最佳工藝參數(shù)為：提取時間為31.7 min，微波溫度87℃，提取過程料液比W/V為1：60.7，在此最佳工藝條件下龍須菜粗多糖提取得率為34.84%.隨后，通過對不同類型的雙水相體系進(jìn)行篩選，獲得一種可較好去除雜蛋白的雙水相體系——乙醇/（NH4）2SO4雙水相體系，此雙水相體系可以在有效去除雜蛋白的同時，獲得較高的粗多糖提取率，且所用試劑廉價并對環(huán)境污染低，證實了雙波輔助提取結(jié)合雙水相萃取的方法對龍須菜粗多糖的分離純化開辟了一條簡潔、綠色的提取工藝.

[1]安鑫龍，李雪梅，齊遵利，等.大型海藻龍須菜的生態(tài)特征[J].水產(chǎn)科學(xué)，2009，28（2）：109-112.

[2]何清，馬曉宇，峙苗.東海紅藻龍須菜的營養(yǎng)成分分析及評價[J].食品科學(xué)，2010，31（9）：284-287.

[3]陳美珍，王欣，余杰.龍須菜多糖的提取、分離及抗氧化活性的研究[J].汕頭大學(xué)學(xué)報（自然科學(xué)版），2005，20（2）：37-41.

[4]陳美珍，龍梓潔，余杰，等.龍須菜多糖抗突變和清除自由基作用的研究[J].食品科學(xué)，2005，26 （7）：219-222.

[5]陳美珍，廖灶輝，余杰，等.龍須菜多糖抑瘤活性及對荷瘤小鼠抗氧化作用的研究[J].中國海洋藥物雜志，2008，27（2）：46-49.

[6]陳美珍，陳鴻霖，廖灶輝.龍須菜多糖硫酸基含量對抗流感病毒活性的影響[J].食品科學(xué)，2008，29 （8）：587-590.

[7]陳美珍，余杰，楊拉維，等.龍須菜多糖硫酸化對免疫活性的影響[J].食品科學(xué)，2010，31（15）：278-282.

[8]FAN Y L，SONG W，WANG W H，et al.Partial characterization and anti-tumor activity of an acidic polysaccharide from Gracilaria lemaneiformis[J].Carbohydrate Polymers，2012，88（4）：1313-1318.

[9]潘迎，唐慶九，朱地琴，等.不同提取水溫對龍須菜多糖的得率、組成和免疫活性的影響[J].浙江海洋學(xué)院學(xué)報，2012，31（5）：365-401.

[10]郭守軍，施楚彬，楊永利，等.龍須菜多糖提取工藝優(yōu)化[J].中國釀造，2008，24：80-81.

[11]楊華.采用超聲波技術(shù)提取臺灣種龍須菜多糖的工藝研究[J].食品科技，2008（9）：158-161.

[12]楊華，楊震峰.微波技術(shù)提取臺灣種龍須菜多糖的工藝研究[J].中國食品學(xué)報，2008，8（6）：53-57.

[13]楊華，莊陳豐.響應(yīng)面法優(yōu)化微波輔助提取龍須菜多糖工藝及其抗氧化活性研究[J].食品科學(xué)，2011，32（20）：79-83.

[14]MUSSATTO S I，PASTRANA L，RODRIGUEZ-JASSO R M，et al.Microwave-assisted extraction ofsulfated polysaccharides（fucoidan）frombrown seaweed[J].Carbohydrate Polymers，2011，86（3）：1137-1144.

[15]GAO H，ZHANG Z，ZENG W C，et al.Characterization ofantioxidant polysaccharides from Auricularia auricular using microwave-assisted extraction[J].Carbohydrate Polymers，2012，89（2）：694-700.

[16]DIAMOMD A D，HSU J T.Aqueous two-phase systems for biomolecule separation[J].Advances in Biochemical Engineering/biotechnology，1992，47（16）：89-135.

[17]陳美欣，馮元琦，劉楊，等.乙醇/硫酸銨雙水相體系萃取螺旋藻多糖的研究[J].化學(xué)研究與應(yīng)用，2012，24（12）：1781-1785.

[18]金婷.雙水相萃取芡實多糖工藝研究[J].中國食物與營養(yǎng)，2015，21（2）：61-64.

Extraction of Polysaccharides from Gracilaria lamaneiformis by Ultrasonic-microwave-assisted Aqueous Two-phase System

YAN Xiaolin,LIU Yang
（Department of Biology,College of Science,Shantou University,Shantou 515063,Guangdong,China）

The ultrasonic-microwave-assisted extraction of polysaccharides from Gracilaria lamaneiformis was optimized by response surface methodology.The results showed that the optimumconditions for polysaccharides extraction were ultrasonic wave power of50 W,extraction time of 31.7 min,microwave temperature of 87℃and solid-liquid ratio of 1:60.7.Under the optimum conditions,the extraction yield of polysaccharides was 34.84%.Ethanol/（NH4）2SO4aqueous two-phase system can be better to remove the protein.The results showed that when the aqueous two-phase systemline length is 50,the recoveries of polysaccharides in the intermediate phase up to81.1%.The double-wave assisted extraction combined aqueous two-phase purification could be an effective technique for extraction ofpolysaccharides from Gracilaria lamaneiformis.

ultrasonic-microwave-assistedextraction;seaweedpolysaccharides;aqueoustwo-phase

Q5

A

2016-06-12

顏曉琳（1991—），女，研究生，碩士，主要研究方向：生物分離技術(shù)，E-mail：14xlyan@stu.edu.cn

劉 楊（1978—），女，教授，博士，主要研究方向：生物分離技術(shù).E-mail：liuyanglft@stu.edu.cn

廣東省高等學(xué)校優(yōu)秀青年教師培養(yǎng)計劃（Yq2013076）；汕頭科技計劃項目（46）.

1001-4217（2017）02-0010-08