南極磷蝦來(lái)源酶的研究進(jìn)展

燕夢(mèng)雅,陳雪忠,劉志東,*,劉寶林,黃洪亮,汪一紅, 曲映紅,李 斌,馬慶保,,戚 亭,王 帥,

(1.上海理工大學(xué)醫(yī)療器械與食品學(xué)院,上海 200093; 2.中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)研究院東海水產(chǎn)研究所,上海 200090; 3.上海海洋大學(xué)食品學(xué)院,上海 201306; 4.波頓(上海)香料科技有限公司,上海 200090)

南極磷蝦來(lái)源酶的研究進(jìn)展

燕夢(mèng)雅1,2,陳雪忠2,劉志東2,*,劉寶林1,黃洪亮2,汪一紅2, 曲映紅3,李 斌4,馬慶保2,3,戚 亭1,2,王 帥2,3

(1.上海理工大學(xué)醫(yī)療器械與食品學(xué)院,上海 200093; 2.中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)研究院東海水產(chǎn)研究所,上海 200090; 3.上海海洋大學(xué)食品學(xué)院,上海 201306; 4.波頓(上海)香料科技有限公司,上海 200090)

南極磷蝦是一種生活于南極海域的浮游海洋動(dòng)物。南極海域寒冷、嚴(yán)酷的生存環(huán)境形成了南極磷蝦酶獨(dú)特的生物學(xué)特性,南極磷蝦酶作為一種獨(dú)特、高效的低溫酶系,具有廣闊的應(yīng)用前景。本文綜述了南極磷蝦酶的種類,分離純化,結(jié)構(gòu)特征,酶學(xué)性質(zhì)和應(yīng)用研究進(jìn)展,期望能夠推動(dòng)南極磷蝦資源的深度利用。

南極磷蝦,酶,分離純化,結(jié)構(gòu)特征,酶學(xué)性質(zhì)

南極磷蝦屬于節(jié)肢動(dòng)物門(Arthropoda),甲殼動(dòng)物綱(Crustacea),磷蝦目(Euphausiacea),磷蝦科(Euphausiidae),磷蝦屬(Euphausia),磷蝦種(Euphausiasuperb)。本文所講的南極磷蝦指的是南極大磷蝦(EuphausiaSuperbaDana)[1]。南極海域獨(dú)特的地理和氣候環(huán)境,形成了南極磷蝦適應(yīng)寒冷、嚴(yán)酷環(huán)境的生存能力。南極磷蝦是狹溫性動(dòng)物,長(zhǎng)期生活于接近0 ℃的環(huán)境(其生活環(huán)境的最低溫度是海水的冰點(diǎn),即-1.9 ℃,最高溫度為2 ℃)[1]。

酶作為生物生命活動(dòng)的重要參與者,參與了生物體的新陳代謝。研究表明,南極磷蝦酶主要來(lái)自南極磷蝦自身及共附生微生物產(chǎn)生的酶,具有活性高、耐低溫的特點(diǎn)。盡管南極磷蝦具有高效的酶系統(tǒng),但其活性受到體內(nèi)酶抑制劑的作用;活體南極磷蝦的酶系處于動(dòng)態(tài)平衡狀態(tài);南極磷蝦死后,這種動(dòng)態(tài)平衡被打破,南極磷蝦就會(huì)發(fā)生自溶[2]。

基于南極磷蝦酶的活性高、耐低溫特性,南極磷蝦酶在食品、醫(yī)藥和洗滌等領(lǐng)域具有廣泛的應(yīng)用潛力。本文綜述了南極磷蝦酶的種類,酶學(xué)性質(zhì),結(jié)構(gòu)特征及應(yīng)用研究的進(jìn)展,旨在為促進(jìn)南極磷蝦酶學(xué)及相關(guān)研究提供參考。

1 南極磷蝦酶的種類

表1 南極磷蝦來(lái)源蛋白酶

表2 南極磷蝦來(lái)源非蛋白酶

表3 南極磷蝦酶的分離純化

研究表明,南極磷蝦酶主要分布于南極磷蝦的頭胸部和腹部。目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)的南極磷蝦蛋白酶主要有8種(見(jiàn)表1):3種絲氨酸類胰蛋白酶(TL I,TL II,TL III)、1種絲氨酸類胰凝乳蛋白酶(CL)、2種羧肽酶A和2種羧肽酶B(CPA I和CPA II)。類胰蛋白酶的分子量約為24～33 ku,類胰凝乳蛋白酶分子量約為27～33 ku,羧肽酶A的分子量約為24～28 ku,羧肽酶B的分子量約為24～28 ku。類胰蛋白酶I具有內(nèi)切酶和外切酶的活性,類胰蛋白酶II和III具有內(nèi)切酶活性,羧肽酶A和羧肽酶B均具有外切酶活性。與脊椎動(dòng)物來(lái)源胰蛋白酶不同,南極磷蝦酶不受鈣的影響?；谶@一特征用來(lái)區(qū)分甲殼動(dòng)物來(lái)源絲氨酸蛋白酶與脊椎動(dòng)物來(lái)源絲氨酸蛋白酶[3]。

目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)的南極磷蝦非蛋白酶主要包括葡聚糖酶和幾丁質(zhì)酶:南極磷蝦葡聚糖酶主要包括外切型-(1,3)-/D葡聚糖酶、β-D-葡萄糖苷酶、透明質(zhì)酸酶(內(nèi)切-β-葡萄糖醛酸酶)和-葡萄糖醛酸酶[4-6]。南極磷蝦幾丁質(zhì)酶主要包括N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷酶(NAGase:NAG酶B和NAG酶C)和聚-β-1,4-(2-乙酰氨基-2-脫氧)-D-糖苷-葡聚糖水解酶等[7-8](見(jiàn)表2)。

2 南極磷蝦酶的分離純化

南極磷蝦酶的分離純化主要采用硫酸銨分級(jí)沉淀、色譜法(離子交換色譜,凝膠過(guò)濾色譜和親和色譜等)和電泳法(毛細(xì)管電泳,SDS-PAGE等)等(見(jiàn)表3)。

3 南極磷蝦酶的結(jié)構(gòu)特征

研究表明,南極磷蝦主要以浮游植物(冰藻、硅藻、矽藻等)作為食物。因此,南極磷蝦消化酶的構(gòu)成和活性是確保南極磷蝦在惡劣的食物供應(yīng)環(huán)境快速消化和吸收所攝入食物的先決條件之一。研究表明,南極磷蝦消化酶主要在中腸腺中被合成和分泌,在胃中被匯集。因此,南極磷蝦胃部的酶活性相對(duì)較高。此外,在浮游植物含量較少或南極冬季時(shí),南極磷蝦可以通過(guò)增加消化酶活性和/或增加腸道保留時(shí)間促進(jìn)攝入食物的消化和利用，南極磷蝦也可轉(zhuǎn)變?yōu)槿馐承陨颷25-27]。此外,南極磷蝦酶系中幾丁質(zhì)酶的存在也進(jìn)一步表明南極磷蝦具有利用多種食物的能力,提高了南極磷蝦適應(yīng)極端環(huán)境的能力[28]。

盡管南極磷蝦NAGase B和NAGase C酶催化相同的反應(yīng),但兩者在南極磷蝦新陳代謝過(guò)程中發(fā)揮了不同的作用[20,29]。NAGases B主要位于表皮且其活性模式與蛻皮周期相關(guān),NAGases B參與蛻皮形式的分子特性進(jìn)一步表明蛻皮酶從表皮到蛻皮空間的囊泡運(yùn)輸過(guò)程。因此,NAGases B主要在南極磷蝦蛻皮的過(guò)程中發(fā)揮降解幾丁質(zhì)的作用,這有利于它們通過(guò)表皮吸收用于進(jìn)一步的代謝,即主要合成新的角質(zhì)層[30]。NAGases C主要存在于胃腸道且其活性與蛻皮周期無(wú)關(guān),其主要功能是參與含有甲殼素膳食成分的消化。盡管已經(jīng)開(kāi)展了兩種NAGases在消化道和蛻皮循環(huán)過(guò)程中的活性模式研究[8],但仍然缺乏關(guān)于該酶參與蛻皮過(guò)程是否與消化酶相同的信息[7]。綜上所述,雖然關(guān)于南極磷蝦酶的結(jié)構(gòu)特征研究取得了一定進(jìn)展,但還有許多基礎(chǔ)科學(xué)問(wèn)題尚待闡明,如南極磷蝦酶的低溫適應(yīng)機(jī)制和催化機(jī)理等。

4 南極磷蝦酶的酶學(xué)性質(zhì)

南極磷蝦酶的酶學(xué)性質(zhì)主要包括最適溫度和pH,溫度穩(wěn)定性、pH穩(wěn)定性、反應(yīng)動(dòng)力學(xué)以及抑制劑等[17],但這些性質(zhì)與緩沖液、底物濃度、激活劑、穩(wěn)定劑及時(shí)間等因素密切相關(guān)[23-24,31-32]。

4.1 南極磷蝦蛋白酶的酶學(xué)性質(zhì)

Si等[14]研究南極磷蝦肌肉精氨酸激酶發(fā)現(xiàn)其分子量約為40 ku,最適pH和最適溫度分別為8.0和30 ℃。研究發(fā)現(xiàn),南極磷蝦精氨酸激酶的活性區(qū)域可能比完整的酶分子更“柔韌”。1.0 mmol/L的SDS能夠抑制南極磷蝦精氨酸激酶活性,SDS濃度低于5 mmol/L時(shí),不會(huì)誘導(dǎo)該酶三級(jí)結(jié)構(gòu)發(fā)生明顯的構(gòu)象變化;SDS濃度高于5 mmol/L時(shí),則會(huì)暴露該酶的疏水表面,引起三級(jí)結(jié)構(gòu)構(gòu)象的改變[14]。時(shí)間-間隔評(píng)價(jià)的動(dòng)力學(xué)分析結(jié)果表明,該酶的失活過(guò)程屬于一級(jí)反應(yīng),其動(dòng)力學(xué)過(guò)程隨著SDS濃度的增加,由單向轉(zhuǎn)為雙向。

Bustos等[13]從南極磷蝦解凍液和南極磷蝦機(jī)械剝殼后的副產(chǎn)物中獲得了類胰蛋白酶,該酶具有極高的穩(wěn)定性,45 ℃條件下貯藏60 d后活性仍具有初始活性的約40%。采用親和色譜純化冷凍南極磷蝦解凍液中的類胰蛋白酶,純化140倍的酶在SDS-PAGE中具有一條較寬的條帶,分子量范圍約為3.2～3.3 ku。Wu等[9]采用硫酸銨沉淀、離子交換色譜和凝膠過(guò)濾色譜從南極磷蝦中純化獲得三種適冷性胰蛋白酶,分子量分別為28.7,28.8和29.2 ku;該胰蛋白酶能夠被特異性胰蛋白酶抑制劑抑制,最適反應(yīng)溫度分別為40,45,40 ℃,且三種胰蛋白酶在5～40 ℃范圍內(nèi)活性較穩(wěn)定。Sj?dahl等[12]發(fā)現(xiàn),在37 ℃和1～3 ℃時(shí),類胰蛋白酶的降解效率分別約是牛胰蛋白酶降解效率的12和60倍,這再次證明了南極磷蝦蛋白酶的高活性與適冷性。因此,南極磷蝦類胰蛋白酶也成為表示南極磷蝦蛋白水解活性的高度特異性標(biāo)記物。Bucht等[31]采用親和色譜和離子交換色譜相結(jié)合從南極磷蝦中分離純化三種絲氨酸蛋白酶(I,II,III)。在SDS-聚丙烯酰胺梯度凝膠電泳中,每種酶顯示出單一的蛋白條帶(30 ku),這表明純化酶的純度高且分子量相近。此外,采用兔多克隆抗體對(duì)每種酶進(jìn)行交叉免疫電泳免疫沉淀反應(yīng)(二維瓊脂糖凝膠電泳),確定了高純度的單一酶。雙向免疫擴(kuò)散實(shí)驗(yàn)結(jié)果也表明酶II和酶III的免疫一致性。酶I表現(xiàn)出與酶II、酶III的部分相似性;酶I可以從多肽中釋放自由氨基酸,而酶II和酶III則不能。這些發(fā)現(xiàn)與三種絲氨酸蛋白酶的生物化學(xué)信息密切相關(guān)。

Wang等[15]獲得純化的堿性磷酸酶(62.6 ku;2.62 unit/mg),其在溫度高于30 ℃時(shí)不穩(wěn)定;但即使較高濃度的SDS(300 mmol/L)對(duì)南極磷蝦堿性磷酸酶的活性也不會(huì)產(chǎn)生影響,而鹽酸胍和尿素則分別在2 mol/L和3.5 mol/L時(shí)能夠有效地抑制該酶的活性。南極磷蝦堿性磷酸酶動(dòng)力學(xué)研究表明由鹽酸胍和尿素誘導(dǎo)的酶抑制過(guò)程為單向去折疊過(guò)程的一級(jí)反應(yīng),整體結(jié)構(gòu)變化發(fā)生在臨近的活性位點(diǎn)[14]。研究結(jié)果為了解極端環(huán)境條件南極磷蝦堿性磷酸酶提供了一種新的理解,也有助于深化我們對(duì)酶進(jìn)化和南極磷蝦適應(yīng)南極極端環(huán)境的理解。

Gromek等[33]培養(yǎng)分離自南極大磷蝦消化道的一種海洋細(xì)菌假交替單胞菌屬純菌種(菌株93)。獲得一種堿穩(wěn)定性枯草桿菌蛋白酶類絲氨酸蛋白酶。該蛋白酶的分子量約為45 ku,在Ca2+條件下穩(wěn)定。酶活在天然和合成底物下最適溫度為45 ℃,最適pH10.0,在0～20 ℃保留最大活性的12%～30%;在55 ℃下60 min是穩(wěn)定的,pH11.5條件下仍保持最大活性的約70%。表明該酶具有較好的耐熱性和耐堿性。該酶在30 ℃,以N-SuccAAPFpNA為底物下的Km為2.49 mmol/L,溫度在15～45 ℃時(shí),N-SuccAAPFpNA水解活化能為40.7 kJ×mol-1。表明該酶也能夠作為有機(jī)溶劑生物催化劑。Turkiewicz等[34]培養(yǎng)分離自南極磷蝦胃的海洋細(xì)菌鞘氨醇單胞菌(菌株116),純化和表征其產(chǎn)生的胞外酶,發(fā)現(xiàn)其在5～10 ℃有最大分泌量,低于菌株最適生長(zhǎng)溫度(15 ℃);是一種金屬酶(對(duì)EDTA敏感),20～30 ℃,pH6.5～7.0時(shí)酶活性最大。研究表明,該酶在較寬的溫度范圍(-10～30 ℃)內(nèi)能夠保持酶活相對(duì)穩(wěn)定。

Turkiewicz等[17]發(fā)現(xiàn)南極磷蝦同源異構(gòu)酶具有較高的底物親和力,高NAD抑制作用,10 mmol/L丙酮酸具有較高的抑制作用,乳酸抑制缺乏及較高的熱穩(wěn)定性和類似于北極磷蝦的LDH-A同源異構(gòu)酶;其是四聚體蛋白,但分子量約為160 ku。南極磷蝦同源異構(gòu)酶表現(xiàn)出很強(qiáng)的非特異性離子交換作用,這在北極磷蝦同源異構(gòu)酶中并未發(fā)現(xiàn)。此外,研究還發(fā)現(xiàn),南極磷蝦酶與牛血清白蛋白能夠穩(wěn)定的共存[5]。

表4 南極磷蝦來(lái)源多糖酶[36]

表5 南極磷蝦來(lái)源糖苷酶[36]

4.2 南極磷蝦非蛋白酶的酶學(xué)性質(zhì)

南極磷蝦NAGase C純化濃縮600倍,得率為17%,分子量約為150 ku。NAGase B具有糖蛋白特性,NAGase C對(duì)多克隆抗體具有高度專一性,由此可以判斷兩者不是同源異構(gòu)體,但有可能在南極磷蝦中發(fā)揮不同的作用。它們的同時(shí)出現(xiàn)可能表明南極磷蝦可能利用一種改變同源異構(gòu)酶濃度機(jī)制的生理適應(yīng)性[20]。研究表明,南極磷蝦(1-3)-β-葡聚糖酶主要存在于南極磷蝦消化道內(nèi)容物,其活性主要取決于酶分子的游離巰基基團(tuán)。Hg2+、碘代乙酸和對(duì)氯汞苯甲酸的強(qiáng)烈抑制效應(yīng)表明,半胱氨酸殘基中的巰基基團(tuán)為酶的活性中心,或這些基團(tuán)對(duì)于保持南極磷蝦(1-3)-β-葡聚糖酶分子的構(gòu)象也很重要[17,35]。表4和表5是關(guān)于南極磷蝦粗提物中的多糖酶和糖苷酶的種類及酶學(xué)性質(zhì)的介紹。

生存于低溫環(huán)境的生物通常以極高的代謝速率及耗能較高的生活方式改變其生理適應(yīng)性,這種生理適應(yīng)性可能彌補(bǔ)這些生物低溫生存過(guò)程的新陳代謝限速[37-38]。因此,長(zhǎng)期和短期適應(yīng)過(guò)程的這種調(diào)節(jié)很可能與相關(guān)酶的催化有關(guān)?；诖?開(kāi)展南極磷蝦酶學(xué)性質(zhì)的研究可能為了解無(wú)脊椎動(dòng)物在極端環(huán)境的適應(yīng)機(jī)理提供有價(jià)值的信息。通常,酶活性的調(diào)節(jié)主要通過(guò)改變酶的動(dòng)力學(xué)特性獲得不同的催化率獲得,主要有兩種方式:定性調(diào)節(jié):即通過(guò)調(diào)節(jié)現(xiàn)有的酶效應(yīng)子,誘導(dǎo)酶催化性質(zhì)的改變;定量調(diào)節(jié):即通過(guò)合成和降解改變酶的濃度來(lái)實(shí)現(xiàn)。

5 南極磷蝦酶的應(yīng)用進(jìn)展

南極磷蝦具有“強(qiáng)大、高效”的酶系統(tǒng),這也是決定南極磷蝦適應(yīng)南極極端環(huán)境生存的重要因素。研究已經(jīng)表明,南極磷蝦酶為內(nèi)切酶和外切酶的混合物,兩者協(xié)同作用能夠快速降解生物材料,即使在低溫條件下仍具有較高的活性。南極磷蝦酶的這些獨(dú)特性能已被證明能夠有效降解壞死的組織碎片、纖維蛋白或血痂等。因此,南極磷蝦酶被視為未來(lái)可以用于處理“壞死”創(chuàng)面的重要資源。由于南極磷蝦酶系的“高活性”,其清創(chuàng)效果顯著優(yōu)于現(xiàn)有的單一或幾種酶混合(木瓜蛋白酶、纖溶素、核酸酶等)的酶制劑;此外,研究還證實(shí)南極磷蝦酶具有加快傷口愈合的功效[39]。南極磷蝦酶的清創(chuàng)效果與酶的濃度顯著相關(guān);但單一使用胰蛋白酶的降解能力僅為50%,且與酶濃度關(guān)系不大。此外,南極磷蝦酶可以添加于洗衣粉,用于舊油漆的復(fù)新,扇貝加工副產(chǎn)物的酶解,治療痤瘡、慢性潰瘍的清創(chuàng)、牙斑的清除、角膜堿燒傷、溶解血栓、促進(jìn)消化等領(lǐng)域[40]。隨著對(duì)南極磷蝦酶研究的深入,未來(lái),南極磷蝦酶可能在食品工業(yè)、洗滌工業(yè)、醫(yī)藥工業(yè)等領(lǐng)域獲得更加廣泛的應(yīng)用,為南極磷蝦的高值化利用開(kāi)辟新的道路。

6 結(jié)論與展望

南極磷蝦酶作為一種來(lái)源獨(dú)特、高效的低溫酶系,具有廣泛的應(yīng)用前景。盡管已經(jīng)開(kāi)展了多種南極磷蝦酶的研究,并對(duì)其底物特異性和酶學(xué)特征進(jìn)行了系統(tǒng)分析,但對(duì)南極磷蝦酶的低溫適應(yīng)機(jī)制仍需開(kāi)展深入研究。隨著南極磷蝦酶結(jié)構(gòu)解析與功能挖掘的深入,特別是特定底物選擇性,熱穩(wěn)定性和低溫適應(yīng)性酶的發(fā)現(xiàn)和改造,對(duì)于提高南極磷蝦酶的催化活性具有非常重要的意義。此外,南極磷蝦酶對(duì)天然底物或特定物質(zhì)(如氟)的生物轉(zhuǎn)化也值得深入研究。因此,本文通過(guò)綜述南極磷蝦酶的酶學(xué)特征、作用機(jī)制等,期望能夠?yàn)榈蜏孛傅拈_(kāi)發(fā)利用和南極磷蝦的品質(zhì)控制提供新的線索,也為我國(guó)綜合開(kāi)發(fā)利用南極磷蝦資源提供基礎(chǔ)信息。

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Research progress in enzyme derived from Antarctic krill

YAN Meng-ya1,2,CHEN Xue-zhong2,LIU Zhi-dong2,*,LIU Bao-lin1,HUANG Hong-liang2, WANG Yi-hong2,QU Ying-hong3,LI Bin4,MA Qing-bao2,3,QI Ting1,2,WANG Shuai2,3

(1.School of Medical Instrument and Food Engineering,University of Shanghai for Science and Technology,Shanghai 200093,China; 2.East China Sea Fisheries Research Institute,Chinese Academy of Fishery Sciences,Shanghai 200090,China; 3.College of Food Science and Technology,Shanghai Ocean University,Shanghai 201306,China; 4.Boton(Shanghai)Fragrances Co.,Ltd.,Shanghai 200090,China)

The Antarctic krill(EuphausiaSuperbaDana)is an important zooplankton which lives in Antarctic Ocean. The cold,extreme living environment in Antarctic Ocean cultivates Antarctic krill unique ability to survive. Enzyme,as an important participant of life activities,played a special role in life of livings. As a unique and highly efficient enzyme system in low temperature,enzymes derived from Antarctic krill have a wide application prospect. This article reviews the research progress of enzymes derived from Antarctic krill,and helps to promote comprehensive and deep utilization of Antarctic krill resources.

Antarctic krill(Euphausiasuperba);enzyme;separation and purification;structure identification;enzymatic characteristics

2016-10-21

燕夢(mèng)雅(1992-)，女，在讀碩士研究生，研究方向：食品生物技術(shù)研究，E-mail：zdliu1976@163.com。

*通訊作者:劉志東(1976-)，男，博士，副研究員，研究方向：海洋生物資源利用研究，E-mail：zd-liu@hotmail.com。

中央級(jí)公益性科研院所基本科研業(yè)務(wù)費(fèi)專項(xiàng)資金 (2016HY-ZD0903;2016HY-ZD1003);上海市科技興農(nóng)項(xiàng)目(滬農(nóng)科攻字(2015)第5-5號(hào));國(guó)家自然科學(xué)基金(31471687);公益性行業(yè)(農(nóng)業(yè))科研專項(xiàng)(201203018);上海市自然科學(xué)基金(13ZR1449900)。

TS254.9

A

1002-0306(2017)09-0368-06

10.13386/j.issn1002-0306.2017.09.063