不同氮源組成麥汁對(duì)釀酒酵母發(fā)酵性能的影響

周永婧,盧 敏,陽輝蓉,涂京霞,趙海鋒,*

(1.華南理工大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院,廣東廣州 510640; 2.廣州珠江啤酒股份有限公司,廣東廣州 510308)

不同氮源組成麥汁對(duì)釀酒酵母發(fā)酵性能的影響

周永婧1,盧 敏1,陽輝蓉1,涂京霞2,趙海鋒1,*

(1.華南理工大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院,廣東廣州 510640; 2.廣州珠江啤酒股份有限公司,廣東廣州 510308)

研究了釀酒酵母Saccharomycespastorianus(FBY0095)在六種不同氮源組成麥汁(20 °P)中生物量、表觀發(fā)酵度、乙醇濃度以及游離氨基氮(FAN)消耗量等指標(biāo)的差異。結(jié)果表明,在20 °P超高濃麥汁發(fā)酵中,麥汁氮源含量和組成對(duì)酵母發(fā)酵性能具有顯著影響。隨著麥汁中可同化氮量的提高,加速了酵母對(duì)糖的吸收利用,提高了酵母穩(wěn)定期生物量和乙醇產(chǎn)量,發(fā)酵時(shí)間縮短了20%。當(dāng)?shù)磪T乏(約為FAN=124.59 mg/L)時(shí),補(bǔ)充適量大豆分離蛋白水解物(SPIH)于超高濃麥汁中,增加了麥汁氮源的多樣性,使菌體增長量提高8.3%,乙醇產(chǎn)量提高4.43%,是酵母生長的有效氮源。

釀酒酵母,氮源,超高濃麥汁,發(fā)酵性能,大豆分離蛋白水解物

在啤酒釀造過程中,氮是酵母細(xì)胞生長和代謝的必需營養(yǎng)元素。麥汁中酵母可利用的含氮物質(zhì)稱為游離氨基氮(FAN)[1],主要包括游離氨基酸、銨離子、二肽和三肽等小分子肽,其在酵母細(xì)胞代謝過程中并不能被全部利用。發(fā)酵初期,酵母的增殖伴隨著對(duì)氮源的快速吸收利用,發(fā)酵后期,酵母細(xì)胞對(duì)氮源的利用也隨之降低甚至終止。

適當(dāng)?shù)牡春亢投鄻有允怯绊懝I(yè)發(fā)酵和產(chǎn)品質(zhì)量的重要因素[2]。啤酒發(fā)酵所需的最佳氮源水平隨著麥汁濃度和菌種而有所差異[3-4],氮源匱乏是發(fā)酵延緩或停滯的主要原因之一[5-6]。因此,適量的 FAN 水平是維持酵母正常生長和發(fā)酵的基本保障[7]。Piddocke等[3]發(fā)現(xiàn)酵母菌株在高濃釀造中需要更多的 FAN 來抵抗?jié)B透壓和其它環(huán)境脅迫。在乙醇發(fā)酵中,蛋白胨等復(fù)雜氮源的存在則可以提高酵母生物量和乙醇產(chǎn)量[2,8-10]。近年來,隨著人們對(duì)肽類物質(zhì)的深入了解,發(fā)現(xiàn)有部分肽對(duì)生物機(jī)體具有一定生理功能,在生物機(jī)體的細(xì)胞生理及代謝調(diào)節(jié)上具有非常重要的作用[11]。萬春艷等[12]研究發(fā)現(xiàn),在啤酒發(fā)酵培養(yǎng)基中加入大豆蛋白水解物,可以增加氮源的復(fù)雜性從而具有促進(jìn)啤酒發(fā)酵的作用。

因此,探明適合啤酒超高濃釀造的氮源組成和含量至關(guān)重要。本研究通過對(duì)比六種不同氮源組成的超高濃度麥汁對(duì)釀酒酵母增殖和發(fā)酵性能的影響,以期確定適合于供試酵母菌株超高濃麥汁發(fā)酵的最佳氮源組成,提高酵母的發(fā)酵性能,縮短發(fā)酵周期。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

釀酒酵母FBY0095(Saccharomycespastorianus) 由華南理工大學(xué)食品生物技術(shù)研究室篩選并保藏;大豆分離蛋白 蛋白含量85.12%,廣州合誠實(shí)業(yè)有限公司;Protamex蛋白酶 酶活力8.5×104U/g,諾維信公司;大麥芽、糖漿 廣州珠江啤酒股份有限公司;實(shí)驗(yàn)所用試劑 均為分析純。

表1 六種麥汁組成成分表

全自動(dòng)糖化儀 杭州博日科技有限公司;低溫培養(yǎng)箱 上海一恒科技有限公司;UV2100 紫外可見分光光度計(jì) 上海尤尼柯儀器有限公司;Waters 600型高效液相色譜儀 美國Waters公司;3-18K型高速冷凍離心機(jī) 德國Sigma公司;SW-CJ-2FD超凈工作臺(tái) 上海浦東悅新科學(xué)儀器廠;A300全自動(dòng)氨基酸分析儀 德國MenbraPure公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 大豆蛋白水解物(SPIH)的制備方法 大豆分離蛋白按1∶15(m/v)溶于水,均質(zhì),調(diào)pH至7.0,加入Protamex蛋白酶([E]/[S]=1%),于50 ℃恒溫酶解9 h。然后沸水浴滅酶10 min,離心(4 ℃,8000 r/min,15 min),上清液冷凍干燥,即得大豆蛋白酶解物(SPIH),按下式計(jì)算水解度(DH)[13]。

DH(%)=(水解液氨態(tài)氮含量/水解液總氮含量)×100

式(1)

式(1)中:上清液的總氮含量采用凱氏定氮法,氨態(tài)氮含量采用甲醛滴定法[14]。

1.2.2 麥汁制備及發(fā)酵 將一定量的麥芽粉碎,以1∶4(g∶mL)的料水比進(jìn)行糖化,過濾后105 ℃煮沸1.5 h并以3∶4∶3的比例分三次加入0.6‰的酒花,過濾得到麥汁。將麥汁與糖漿以不同的比例調(diào)制成不同F(xiàn)AN水平的超高濃麥汁,見表1,121 ℃滅菌15 min。使用1000 mL三角瓶,分別裝入麥汁300 mL,用橡皮塞和裝有去離子水的發(fā)酵栓封口。接種量為6.8 g(酵母泥)/L,于12 ℃下靜置發(fā)酵,每天搖瓶1次。

1.2.3 發(fā)酵過程指標(biāo)的測定

1.2.3.1 細(xì)胞干重(DCW) 準(zhǔn)確量取25 mL發(fā)酵液,4 ℃條件下8000 r/min離心15 min,收集菌體,用生理鹽水洗滌兩次后,將菌體轉(zhuǎn)移到干燥皿中,于105 ℃條件下烘干至恒重。

1.2.3.2 表觀濃度 準(zhǔn)確量取50 mL發(fā)酵液,4 ℃條件下8000 r/min離心15 min,收集上清液,用密度瓶法測定其浸出物含量。

表觀發(fā)酵度(%)=(1-時(shí)刻表觀濃度/原麥汁表觀濃度)×100

式(2)

式(2)中，表觀濃度的單位是°P,表示100 mL液體中含有浸出物的質(zhì)量(g)。

1.2.3.3 乙醇濃度 準(zhǔn)確量取發(fā)酵液50 mL,將其轉(zhuǎn)移到蒸餾燒瓶中,并加入100 mL去離子水。連接好蒸餾裝置,加熱蒸餾直至收集到的溜出液體積為45 mL左右時(shí),停止蒸餾。用去離子水將餾出液定容至50 mL,密度瓶法測定乙醇濃度。

1.2.3.4 FAN含量 茚三酮比色法[15]。

1.2.4 SPIH游離氨基酸組成 采用氨基酸分析儀A300測定,iControl and iPeak軟件進(jìn)行氨基酸分析。將SPIH稀釋至適當(dāng)倍數(shù),加入 1 mL 15%磺基水楊酸到4 mL樣品中,4 ℃靜置1 h后離心(4 ℃,10000 r/min,15 min)。上清液再次離心后用鋰離子稀釋液稀釋,然后過0.22 μm膜備用。氨基酸通過陽離子交換柱分離,柱后茚三酮衍生可見光于570 nm測定其吸光值(脯氨酸除外,于440 nm處),外標(biāo)法定量。

1.2.5 SPIH分子量分布 采用高效液相色譜法。色譜條件:a.色譜柱:TSK gel 2000SXL凝膠柱,7.8 mm×300 mm,預(yù)柱:C18,柱溫:30 ℃;b.流動(dòng)相:100%磷酸鹽緩沖液(pH7.2);流速:1.0 mL/min;進(jìn)樣量:20 μL;洗脫時(shí)間:20 min;c.檢測波長:214 nm。

1.3 數(shù)據(jù)處理

實(shí)驗(yàn)中每個(gè)處理重復(fù)三次,應(yīng)用Origin 8.0軟件作圖。

表2 大豆分離蛋白水解物中肽的分子量分布

表4 六組不同麥汁對(duì)釀酒酵母增殖的影響

2 結(jié)果與分析

2.1 大豆分離蛋白水解物(SPIH)的組成

本文所述條件下制備的SPIH的水解度為9.86%,分子量分布如表2所示。由表2可知,SPIH分子量集中在3 kDa以下,占73.5%,主要是小分子肽類和氨基酸的混合物。由于釀酒酵母細(xì)胞能轉(zhuǎn)運(yùn)氨基酸與二肽、三肽等小分子肽,因此,SPIH可以為酵母提供可同化氮源,對(duì)酵母的生長具有促進(jìn)作用。

SPIH中游離氨基酸的組成和含量如表3所示,Lei等[26]根據(jù)Lager酵母細(xì)胞對(duì)氨基酸的同化速率,可將SPIH中的游離氨基酸分成四類(表3)。由表3可知,SPIH含有豐富的一類和二類氨基酸,占游離氨基酸總量的62.3%,可供酵母細(xì)胞快速利用及抑制相應(yīng)高級(jí)醇的產(chǎn)生。Lei等[16]發(fā)現(xiàn)賴氨酸和組氨酸的添加可顯著促進(jìn)酵母生長和風(fēng)味物質(zhì)的形成,提高麥汁發(fā)酵度和乙醇產(chǎn)量。此外,發(fā)酵培養(yǎng)基中氨基酸的存在還會(huì)影響酵母細(xì)胞對(duì)肽類物質(zhì)的同化,其中亮氨酸能高效調(diào)節(jié)酵母對(duì)肽類的吸收[17],而一些氨基酸如精氨酸等則是酵母細(xì)胞優(yōu)先利用的氮源,它們的存在則會(huì)抑制細(xì)胞對(duì)小分子肽的吸收[18]。

表3 大豆分離蛋白水解物的游離氨基酸組成

2.2 不同氮源組成麥汁對(duì)釀酒酵母增殖的影響

釀酒酵母在六種麥汁中的增殖情況如圖1,其凈增長量和凈增長率見表4。由圖1可知,A組酵母在前10 d迅速生長,其余組均在前12 d迅速生長,之后生物量逐漸下降。六組高濃麥汁中酵母的最大生物量為7.64～8.60 mg/mL,凈增長率為48.69%～65.93%(表4)。向麥汁中補(bǔ)充適量的SPIH均能提高酵母的增殖量,其中A組加入SPIH后菌體增長量提高8.3%。這是由于SPIH含有豐富的一、二類氨基酸和小分子肽,在麥汁氮源水平較低時(shí),增加了氮源的多樣性,從而促進(jìn)了酵母增殖,是酵母可以利用的有效外加氮源。以前的研究也表明大豆蛋白酶解物能為微生物生長代謝提供氮源,具有促進(jìn)微生物生長繁殖和代謝的作用[19-20]。

圖 1 六組不同麥汁對(duì)釀酒酵母增殖的影響Fig.1 Effects of different worts on the propagation of brewer’s yeast

2.3 不同氮源組成的麥汁對(duì)釀酒酵母發(fā)酵性能的影響

如圖2所示,向麥汁中補(bǔ)充SPIH后,各組初始表觀濃度均有提高。發(fā)酵前12 d,各組降糖迅速,生物量的增長促進(jìn)了降糖,而后,由于麥汁中糖濃度的下降以及乙醇的積累,發(fā)酵變緩。通常當(dāng)表觀發(fā)酵度達(dá)到80%時(shí),可認(rèn)為啤酒發(fā)酵已經(jīng)結(jié)束。如圖3所示,第12 d時(shí),B、B+、C、C+發(fā)酵結(jié)束,而A、A+于第15 d發(fā)酵結(jié)束。A+、B+相對(duì)于A、B來說,發(fā)酵度均有所提高,但C+組在發(fā)酵前期發(fā)酵度高于C組,發(fā)酵結(jié)束時(shí)發(fā)酵度卻低于C組,這可能是由于發(fā)酵后期過高的乙醇濃度抑制酵母細(xì)胞繁殖的緣故。莫芬等[21]發(fā)現(xiàn)小麥面筋蛋白水解物在氮源匱乏條件下能夠促進(jìn)酵母的增殖,提高其活性,是酵母生長的有效氮源,在氮源充足條件下并不能被充分利用,也不能發(fā)揮促發(fā)酵效果。這說明,C組的初始氮源水平(即FAN=193.18 mg/L)并不是該酵母菌株的氮源匱乏水平,所以沒有顯著的促發(fā)酵效果。

圖2 六種不同麥汁對(duì)釀酒酵母糖代謝的影響Fig.2 Effects of different worts on the sugar consumption of brewer’s yeast

圖3 六種不同麥汁對(duì)發(fā)酵度的影響Fig.3 Effects of different worts on the apparent attenuation of brewer’s yeast

麥汁發(fā)酵過程中,乙醇是酵母代謝可發(fā)酵糖的重要產(chǎn)物。A、A+、B、B+、C、C+發(fā)酵結(jié)束時(shí),終乙醇濃度為分別為8.8%、9.19%、8.545%、8.705%、8.96%、9.025%,添加了SPIH后均能得到更高的乙醇濃度,A、B、C三組終乙醇濃度分別提高了4.43%、1.87%、0.73%，其中A組乙醇濃度提高地更多。麥汁中SPIH的添加,在一定程度上增加了氮源的復(fù)雜性,其中小分子肽段參與改善胞內(nèi)代謝,從而促進(jìn)了酵母對(duì)糖的代謝能力,大分子肽段可吸附在細(xì)胞表面,提高酵母細(xì)胞的耐乙醇和耐滲透壓能力,因而產(chǎn)生了更高的乙醇濃度。

表5 六組不同麥汁在發(fā)酵過程中酵母對(duì)FAN的利用情況

圖4 六組不同麥汁對(duì)釀酒酵母乙醇生成的影響Fig.4 Effects of different worts on the ethanol yield of brewer’s yeast

2.4 釀酒酵母對(duì)不同氮源組成麥汁FAN的利用情況

FAN通常被認(rèn)為是啤酒釀造中反映酵母可同化氮水平的一個(gè)重要指標(biāo)[22]。酵母細(xì)胞在六組麥汁中FAN的利用情況如圖5和表5所示。就麥汁A、B、C而言,在發(fā)酵過程中FAN的利用量隨著初始FAN的增加而增加。同樣,就補(bǔ)充了SPIH的麥汁A+、B+、C+而言,在發(fā)酵過程中FAN的利用量也隨著初始FAN的增加而增加。酵母對(duì)空白對(duì)照組FAN的同化量要略大于相應(yīng)的SPIH添加組,但其降糖、生物量及乙醇生成量等指標(biāo)則低于相應(yīng)的實(shí)驗(yàn)組。這可能是由于麥汁中的氮源已基本滿足啤酒發(fā)酵中酵母細(xì)胞的增殖,同時(shí)酵母細(xì)胞在發(fā)酵過程中也會(huì)分泌少量胞外蛋白酶,這些蛋白酶可以將大分子的肽和蛋白質(zhì)分解成小分子物質(zhì),為酵母細(xì)胞增殖提供了可同化氮源物質(zhì)[23],而這部分小分子物質(zhì)的量無法得知。此外,從表5也可以看出,初始FAN水平越低,利用率越高,這些可能與麥汁的組成有關(guān),氮源的數(shù)量與多樣性是影響發(fā)酵的重要因素。有研究表明,麥芽汁中含有近400種二肽和近8000種三肽[24]。在啤酒發(fā)酵過程中,酵母會(huì)轉(zhuǎn)運(yùn)麥汁中40%的寡肽。雖然添加了SPIH,但由于水解物中含有相對(duì)較多的大分子肽且并未進(jìn)一步分離純化,其中促發(fā)酵肽含量較低,所以其氮源組成不如成分復(fù)雜且含有大量小分子肽的麥汁,但其可作為麥汁氮源匱乏時(shí)的有效補(bǔ)充。

圖5 六組不同麥汁對(duì)釀酒酵母利用FAN的影響Fig.5 Effects of different worts on the FAN utilization rate of brewer’s yeast

3 結(jié)論

啤酒發(fā)酵中,麥汁氮源組成對(duì)啤酒發(fā)酵具有顯著影響。一般來說,隨著麥汁中可同化氮源數(shù)量和氮源多樣性的提高,釀酒酵母表現(xiàn)出更加優(yōu)異的發(fā)酵性能。

將大豆分離蛋白水解物應(yīng)用于啤酒超高濃發(fā)酵中,能夠促進(jìn)酵母的增殖和發(fā)酵,是酵母生長的有效氮源。

本研究實(shí)驗(yàn)菌株在20°P超高濃發(fā)酵時(shí)的氮源匱乏條件約為FAN=124.59 mg/L。

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Effect of worts with different nitrogen compositions on fermentation performance of brewer’s yeast

ZHOU Yong-jing1,LU Min1,YANG Hui-rong1,TU Jing-xia2,ZHAO Hai-feng1，*

(1.School of Food Science and Engineering,South China University of Technology,Guangzhou 510640,China; 2.Guangzhou Zhujiang Brewery Co.,Ltd,Guangzhou 510308,China)

Six kinds of very high gravity worts(20 °P)with different nitrogen compositions were used to examine their effects on the biomass accumulation,degree of fermentation,ethanol yield and FAN consumption of brewer’s yeast(FBY0095)in this study. Results showed that fermentation performance of yeast was strongly affected by both of the level and the composition of nitrogen during very high gravity fermentation(20 °P). With the increases of sugars consumption rates,biomass,ethanol yield and the decrease of fermentation time by 20% were observed with the increase of the amounts of nitrogenous compounds in wort. When the nitrogen source was insufficient(about FAN=124.59 mg/L),wort supplemented with appropriate soy protein isolate hydrolysates(SPIH)induced the increases of biomass and ethanol yield by 5.03% and 4.43%,respectively,and the diversity of nitrogen sourch was increased which indicated that SPIH was an effective nitrogen source for yeast growth with a more complex nitrogen composition.

brewer’s yeast;nitrogen source;very high gravity wort;fermentation performance;soy protein isolate hydrolysates(SPIH)

2016-11-11

周永婧(1995-)，女，碩士研究生，研究方向：食品生物技術(shù)，E-mail:yongjingzhou@sina.cn。

*通訊作者:趙海鋒(1977-)，男，博士，副研究員，主要從事食品生物技術(shù)方面研究，E-mail:hfzhao@scut.edu.cn。

國家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(31571821)；廣東省自然科學(xué)基金(2014A030313227)；廣東省科技計(jì)劃項(xiàng)目(2016A010105003) 。

TS201.3

A

1002-0306(2017)09-0119-05

10.13386/j.issn1002-0306.2017.09.014