魚類部分白介素研究進展

孫鶴+臧林+王秀利

摘要：白介素是一種由免疫細胞分泌的，能夠參與多種細胞間相互作用，增強機體免疫的細胞因子。近年來為了滿足市場需求，漁業(yè)養(yǎng)殖密度大、品種多，導(dǎo)致病害發(fā)生頻率逐年升高。為了避免抗生素等藥物投放對水環(huán)境和食品安全的影響，學(xué)者們將目光放在了增強魚體自身免疫及天然免疫蛋白產(chǎn)品上。本文綜述了三種重要白介素在魚類方面的研究進展，以期為魚類健康養(yǎng)殖奠定基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞：魚類；白介素1；白介素2；白介素15

白細胞介素（interleukins，IL）是一組多效小分子多肽，具有廣泛的生物活性。早在1960年就有研究者發(fā)現(xiàn)被活化的T淋巴細胞能夠產(chǎn)生一種可溶性的因子，且該因子具有活化B淋巴細胞及促進抗體產(chǎn)生的作用[1]，隨后此類能夠影響細胞免疫應(yīng)答的因子相繼被發(fā)現(xiàn)，也被不同研究者命以不同名字。直至1979年，國際淋巴因子專題討論會將這類由單核巨噬細胞和T淋巴細胞分泌的，非特異性發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)并在炎癥反應(yīng)中發(fā)揮重要作用的細胞因子統(tǒng)一命名為白細胞介素，以阿拉伯?dāng)?shù)字區(qū)分不同的因子[2]。過去認為白介素主要參與白細胞間相互作用，但是許多研究已表明，白細胞介素還參與造血干細胞、血管內(nèi)皮細胞、造血細胞、纖維母細胞、神經(jīng)細胞、成骨和破骨細胞等其它細胞的相互作用[3-4]。除此之外，白介素還參與致炎反應(yīng)、并在免疫系統(tǒng)中起重要調(diào)控作用。其調(diào)控機制主要依靠免疫細胞表面的白介素受體能夠特異地結(jié)合白介素，促進免疫細胞的活化、增殖及分化，從而行使調(diào)控功能[5]。這些功能表明，白介素在機體抵御外界病原的過程中扮演重要的角色。

近年來，世界人口數(shù)量逐漸增加，預(yù)計至2050，世界人口數(shù)目會接近100億之多，而魚類將成為人類食物蛋白來源的重要產(chǎn)品之一[6]。然而，在魚類養(yǎng)殖過程中，高密度和集約化的養(yǎng)殖模式使得病害的發(fā)生頻率逐年增高[7]，長久以來對病害的防治多采用投放藥物的方式，這種做法不僅會影響食品安全，同時也會引起水環(huán)境的污染，水環(huán)境的污染會使養(yǎng)殖狀況更加惡化[8]。因此，安全有效的疾病預(yù)防措施就顯得非常重要。由于白介素的免疫學(xué)功能，許多研究者們都將研究重點放在白介素功能的深入研究及異源表達制備重組蛋白產(chǎn)品上，本文主要介紹魚類中幾種重要的白介素的研究進展。

1白介素1

白介素1是一種可溶性的細胞因子，主要由血液中的單核細胞和組織中的巨噬細胞產(chǎn)生，在增強NK細胞殺傷活性及炎癥反應(yīng)中具有重要作用。

首次發(fā)現(xiàn)白介素1（IL-1）是在1972年Gery等[9]研究老鼠和人類的淋巴細胞時，并將其命名為淋巴細白激活因子（lymphocyte activating factor，LAF）。IL-1家族共包括IL-1α，IL-1β，IL-18三種亞型。其中IL-1β是魚類中第一個被鑒定的白介素，隨后是IL-18[10]。最早在魚類體內(nèi)發(fā)現(xiàn)IL-1是1986年，Sigel等[11]發(fā)現(xiàn)鯰魚外周血淋巴細胞能對人IL-1作出應(yīng)答反應(yīng)，并從鯉魚上皮細胞中分離到了IL-1活性物質(zhì)。1999年Zou等[12]在虹鱒體內(nèi)首次發(fā)現(xiàn)并克隆了IL-1β基因，這也是第一個被克隆的魚類IL-1基因。通過對虹鱒IL-1β基因進行序列分析還發(fā)現(xiàn)該基因cDNA全長1 343 bp，與人類IL-1β氨基酸序列

相似度達49%～56%。僅包括六個外顯子和五個內(nèi)含子，與哺乳動物相比不僅數(shù)目上少而且內(nèi)含子長度也短[13-14]。在此研究基礎(chǔ)上，Zou等人后續(xù)又對IL-1β進行了更加細致的研究。RT-PCR顯示存在兩個額外的IL-1β基因的不完全剪接體，說明其轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物除了包括正常的剪接產(chǎn)物外，還存在兩種保留部分內(nèi)含子的不完全剪接方式。在此之后Pleguezuelos等[15]便得到了虹鱒IL-1β基因的第二個克隆，兩個IL-1β基因之間差異較小，僅在外顯子和內(nèi)含子的大小上有所區(qū)別，兩者都沒有IL-1轉(zhuǎn)換酶切割位點。2012年，楊瑩瑩等[16]利用RACE技術(shù)從大鰭鳠中克隆出IL-1β基因全cDNA序列，共計1 196 bp，其中ORF區(qū)域共計888 bp，編碼296個氨基酸。經(jīng)過信號肽分析軟件分析發(fā)現(xiàn)，大鰭鳠IL-1β基因不存在信號肽序列，也不存在ICE（interleukin-1 convetingenzylne）切割位點。2017年，段薈芹[17]等以齊口裂腹魚脾臟 cDNA為模板成功克隆出了IL-β基因。齊口裂腹魚IL-1β基因全長1252 bp，編碼276個氨基酸，其氨基酸序列與目前報道的鯉的氨基酸同源性最高，達81%左右。信號肽預(yù)測結(jié)果顯示齊口裂腹魚IL-1β基因編碼的蛋白質(zhì)序列未發(fā)現(xiàn)信號肽序列及IL-1轉(zhuǎn)換酶切割位點。組織表達譜結(jié)果顯示，IL-1β在該魚的脾臟、腎臟中表達量最高，在心臟、肌肉和肝臟中次之 ；在腸道中最弱。

除此之外，在斜帶石斑魚（Epinephelus coioides）、黃鰭鯛（Acanthopagrus latus）、黑石斑魚（Sebastes schlegeli）及斑點叉尾鮰中均被克隆出了IL-1β基因[18-21]，其中斑點叉尾鮰中成功克隆出了兩種IL-1β基因。

這些魚類IL-1β基因被成功克隆后，有學(xué)者對IL-1β表達調(diào)控進行研究，結(jié)果顯示，IL-1β在機體免疫中是一把雙刃劍，在含量極微的狀況下能夠增強機體免疫，但是在表達量增加后就會損傷以神經(jīng)細胞為最顯著的許多細胞[22]?？偟膩碚f這些研究均極大地促進了魚類分子免疫學(xué)的發(fā)展。

2白介素2

白介素2（interleukins-2，IL-2）是在研究T細胞長時間生長的條件下發(fā)現(xiàn)的一類能夠在免疫細胞和白細胞之間相互作用的細胞因子[23]，主要由活化的T淋巴細胞分泌。研究表明IL-2與含有α，β，γ三條鏈的復(fù)雜受體IL-2R結(jié)合后觸發(fā)胞內(nèi)信號反應(yīng)，從而在T淋巴細胞、B淋巴細胞和自然殺傷細胞的復(fù)制與分化過程中發(fā)揮重要作用[24-25]。由于白介素2在機體免疫和獲得性免疫中的重要地位，使其倍受研究者們重視[26]。白介素-2最初是由Morgan等于1976年在外周淋巴血細胞內(nèi)發(fā)現(xiàn)的[27]，由于當(dāng)時發(fā)現(xiàn)其具有促進T細胞分泌并維持其分裂的作用，便將其命名為T細胞生長因子（TCGF）[28]。直至日內(nèi)瓦免疫學(xué)大會上才將其正式命名為白細胞介素-2[29]。經(jīng)過一系列研究發(fā)現(xiàn)，白介素-2在免疫系統(tǒng)中扮演重要角色，其主要作用為：促進CD4+T細胞，CD8+T細胞，B淋巴細胞和NK細胞的增殖與分化，增強抗原呈遞作用；活化自然殺傷細胞和淋巴因子激活的殺傷細胞；以及促進其他細胞因子釋放等[30]。1984年Caspire等[31]在經(jīng)過PHA刺激的鯉魚外周血淋巴細胞培養(yǎng)液中發(fā)現(xiàn)了淋巴細胞生長促進因子，這也是首次在魚類中發(fā)現(xiàn)IL-2。1993年Xia等[32]證實了在經(jīng)過PHA刺激的日本鰻鱺魚外周血淋巴細胞培養(yǎng)液中同樣存在IL-2活性物質(zhì)。陸續(xù)至2001年，研究者們在草魚等魚類體內(nèi)均發(fā)現(xiàn)了IL-2活性物質(zhì)[33]。但是人們對魚類IL-2在分子水平上的研究仍然相對滯后。直至2005年，紅鰭東方鲀IL-2基因成為世界上第一個被克隆出的IL-2基因，其基因組包括四個外顯子和三個內(nèi)含子，編碼149個氨基酸。該基因二級結(jié)構(gòu)包含三個α螺旋，其中含有由兩個半胱氨酸形成的二硫鍵。紅鰭東方鲀IL-2基因序列與其他已知的IL-2基因序列的同源性僅24%～34%[25]。從此開始，魚類IL-2基因水平上的研究才正式起步。2008年，王建平等[34]在國內(nèi)首次克隆了紅鰭東方鲀IL-2基因。2009年，P.D az-Rosales等成功克隆了虹鱒魚IL-2基因，并將該基因在大腸桿菌中進行表達制備出重組IL-2蛋白，重組蛋白免疫魚體結(jié)果表明，該蛋白能夠誘導(dǎo)STAT5和Blimp-1兩個轉(zhuǎn)錄因子的表達，這兩個轉(zhuǎn)錄因子參與IL-2信號轉(zhuǎn)導(dǎo)（在哺乳動物中已被證實）。該結(jié)果是迄今為止第一份關(guān)于魚體中驗證魚類重組IL-2蛋白的活性的報告[35]。

綜合上述研究結(jié)果可知，至今已有多種魚類IL-2基因被克隆，這些序列為今后利用異源表達系統(tǒng)制備具有活性的天然免疫蛋白產(chǎn)品奠定了基礎(chǔ)。

3白介素15

白介素15（IL-15）最初是由Grabstei等[36]從猿的腎細胞條件培養(yǎng)上清液中發(fā)現(xiàn)的分子質(zhì)量約14～15 KD，能夠維持CTLL-2細胞增殖的細胞因子。該功能與IL-2頗為相似，對比兩序列發(fā)現(xiàn)，它們同屬于四螺旋細胞因子家族，并共有相同的受體組成元件。根據(jù)這一相似處，研究者們參照IL-2的結(jié)構(gòu)利用轉(zhuǎn)角構(gòu)建出了IL-15的三級結(jié)構(gòu)模型，IL-15的三級結(jié)構(gòu)顯示共包含兩個二硫鍵，且其中一個（cys44-cys88）與IL-2的唯一二硫鍵類似[37]。雖然在體外實驗中IL-2與IL-15有著諸多相似之處，但是Kennedy等[38]在小鼠中利用基因敲除實驗證明：敲除IL-2基因后，小鼠免疫能力下降，但NK細胞數(shù)目不受影響；敲除IL-15基因后NK細胞缺失，記憶CD8+T細胞減少。因此說明， IL-15在機體內(nèi)部免疫系統(tǒng)中具有獨立的功能，其作用也是不可替代的。

魚類是同時具有先天性免疫和獲得性免疫的較低等的脊椎動物，雖然在生物進化造成了魚類與其他高等脊椎動物的差別，使其獲得性免疫系統(tǒng)變得并不完善，但是也仍然具備了一定水平的獲得性免疫系統(tǒng)。 IL-15及其他四螺旋細胞因子可能在魚類中參與了免疫功能調(diào)控。2006年，Bei等[39]成功的克隆了紅鰭東方鲀IL-15基因。在此研究的基礎(chǔ)上，馬普等[40]按照已有的成熟肽序列設(shè)計引物，成功克隆并用PET系列載體進行了表達，并對表達產(chǎn)物進行了活性驗證，結(jié)果證實該種方法獲得的重組紅鰭東方鲀IL-15蛋白是具有生物活性的，今后可用于紅鰭東方鲀健康養(yǎng)殖中。除此之外，方瑋等[41]采用Race的方法成功克隆了黑青斑河豚IL-15基因的cDNA全長，共計1 046 bp，同樣將其克隆到PET系列表達載體進行表達并得到了純化的重組黑青斑河豚IL-15蛋白。后續(xù)的組織表達譜結(jié)果表明魚類IL-15可由多種細胞產(chǎn)生，組織分布較為廣泛。

對魚類等低等脊椎動物中IL-15等具有四螺旋的細胞因子的研究有助于我們更加全面更為透徹的理解四螺旋細胞因子家族起源和進化過程，以及具有該結(jié)構(gòu)的脊椎動物類似基因和功能分化。

4展望

隨著研究的不斷深入以及基因工程技術(shù)、分子生物學(xué)技術(shù)的不斷完善，魚類白介素微觀世界的面紗已被慢慢揭開， 除了上述幾種白介素在不同種魚類中的研究外，還將會在新品種魚類中發(fā)現(xiàn)已知或未知的新型白介素，形成一個系統(tǒng)并完善的魚類白介素體系。這將為今后魚類的健康養(yǎng)殖、綠色養(yǎng)殖、低成本養(yǎng)殖提供更多有價值的參考信息。

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（收稿日期：2017-03-01）