ECHS1和PKM2蛋白在膽管癌中的表達(dá)及臨床意義

曾 偉, 高 鵬, 朱小三, 戴益琛, 陳章興, 謝軍培, 詹曉娟, 張 如

解放軍第一七四醫(yī)院 1.消化內(nèi)科; 2.病理科, 福建 廈門 361003

ECHS1和PKM2蛋白在膽管癌中的表達(dá)及臨床意義

曾 偉1, 高 鵬1, 朱小三1, 戴益琛1, 陳章興1, 謝軍培1, 詹曉娟1, 張 如2

解放軍第一七四醫(yī)院 1.消化內(nèi)科; 2.病理科, 福建 廈門 361003

目的 探討ECHS1和PKM2蛋白在膽管癌中的表達(dá)特點(diǎn)與預(yù)后的關(guān)系。方法 采用免疫組化方法檢測(cè)17例膽管癌及其癌旁正常膽管組織中ECHS1和PKM2蛋白的表達(dá)情況，并分析兩種蛋白表達(dá)與膽管癌臨床病理特征及預(yù)后的關(guān)系。結(jié)果 ECHS1和PKM2蛋白在膽管癌組織中的陽性率分別為58.8%和64.7%，高于癌旁組織中的陽性率17.9%和21.4%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；ECHS1和PKM2 蛋白與膽管癌患者性別、年齡及腫瘤直徑無相關(guān)性，而與膽管癌分化程度、TNM分期及生存時(shí)間有相關(guān)性。結(jié)論 ECHS1和PKM2蛋白表達(dá)水平與膽管癌發(fā)生、發(fā)展及轉(zhuǎn)移關(guān)系密切。

膽管癌；ECHS1；PKM2；預(yù)后

膽管癌是膽管常見的惡性腫瘤，起源于膽管上皮細(xì)胞，可以發(fā)生在膽管的任何部位，就發(fā)病率而言，膽管癌的發(fā)病率居第2位[1]。膽管癌起病隱匿，早期檢測(cè)困難；手術(shù)切除率低，難以根治，我國近年的治愈率僅為18.0%～26.2%；且遠(yuǎn)期療效不佳，術(shù)后復(fù)發(fā)率高，病死率高；臨床藥物治療過程中易出現(xiàn)抗藥性[2]。近年報(bào)道在全球范圍內(nèi)，膽管癌，尤其是肝外膽管癌的發(fā)病率及病死率均呈上升趨勢(shì)[3]。建立有效的早期檢測(cè)，尋找有效的藥物作用靶點(diǎn)，開發(fā)出新的藥物并應(yīng)用于臨床的需求比較迫切。雖然目前膽管癌發(fā)生、發(fā)展的研究較為深入，尋找到了一些有價(jià)值的基因和分子，但是尚未發(fā)現(xiàn)藥物相關(guān)的作用靶點(diǎn)，同時(shí)，還有較多基因和分子有待深入了解。我們認(rèn)為，在分子水平上，對(duì)膽管癌的發(fā)生和發(fā)展作進(jìn)一步研究，將有利于膽管癌的早期檢測(cè)和藥物開發(fā)，為臨床治療提供有價(jià)值的信息。ECHS1和PKM2在多種惡性腫瘤組織中高表達(dá)，與腫瘤惡性程度和患者預(yù)后密切相關(guān)。本研究中我們應(yīng)用免疫組化技術(shù)檢測(cè)ECHS1和PKM2蛋白在膽管癌組織中的表達(dá)情況，探討其表達(dá)差異與臨床意義。

1 資料與方法

1.1 標(biāo)本來源 收集2011年1月-2015年5月解放軍第一七四醫(yī)院手術(shù)切除的17例膽管癌患者腫瘤組織及其相應(yīng)癌旁正常膽管黏膜組織(距腫瘤組織5 cm以上)標(biāo)本。所有患者術(shù)前均未行放化療。其中男11例，女6例，年齡40～80歲。標(biāo)本離體后，一部分立即置入液氮罐，儲(chǔ)存于-80 ℃冰箱中備用；另一部分標(biāo)本經(jīng)4%甲醛固定，石蠟包埋，HE染色，病理證實(shí)為膽管細(xì)胞癌。

1.2 隨訪情況 通過門診、電話和信訪等方式進(jìn)行隨訪，記錄性別、年齡、病理類型和臨床分期(以1997年國際抗癌聯(lián)盟的分期為標(biāo)準(zhǔn))。最長隨訪至25個(gè)月，中位隨訪時(shí)間16個(gè)月，隨訪率為98.9%?？偵嫫?overall survival, OS)的計(jì)算為病理確診開始至死于任何疾病、最后隨診日期或截止觀察日期。

1.3 免疫組化檢測(cè)[4]采用SP法檢測(cè)ECHS1和PKM2蛋白表達(dá)，抗原修復(fù)液為枸櫞酸緩沖液(pH 6.0)。染色結(jié)果根據(jù)陽性對(duì)照和陰性對(duì)照情況，按每張切片的陽性細(xì)胞數(shù)比例進(jìn)行定性分析。陽性細(xì)胞<30%為陰性，≥30%為陽性。采用已知有PKM2表達(dá)的膽管癌標(biāo)本作為陽性對(duì)照，在陽性對(duì)照的空白切片中以PBS代替抗PKM2作為陰性對(duì)照。由病理科2名醫(yī)師在不知臨床資料的情況下對(duì)標(biāo)本染色結(jié)果進(jìn)行評(píng)估。ECHS1蛋白在細(xì)胞質(zhì)和(或)細(xì)胞核內(nèi)出現(xiàn)棕黃色顆粒為陽性細(xì)胞，PKM2在細(xì)胞核出現(xiàn)棕黃色顆粒為陽性細(xì)胞。每個(gè)視野計(jì)數(shù)200個(gè)細(xì)胞，共計(jì)5個(gè)高倍視野的陽性細(xì)胞數(shù)，確定陽性細(xì)胞百分率<25%蛋白表達(dá)為(-)，25%～49%為(+)，50%～74%為(++)，>75%為(+++)，陽性細(xì)胞百分率≥25%確定為蛋白表達(dá)陽性。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 18.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，計(jì)數(shù)資料的比較采用卡方檢驗(yàn)，采用Kaplan Meier法進(jìn)行生存分析，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 ECHS1和PKM2蛋白在膽管癌組織中的表達(dá)情況 ECHS1和PKM2蛋白在膽管癌組織中均呈高表達(dá)；ECHS1蛋白表達(dá)定位于細(xì)胞質(zhì)，呈棕色至褐色，PKM2蛋白表達(dá)定位于細(xì)胞漿及細(xì)胞核內(nèi)，均呈棕黃色(見圖1～2)。ECHS1蛋白在膽管癌及正常膽管組織中陽性表達(dá)率分別為58.8%和17.9%，PKM2蛋白在兩組中的陽性表達(dá)率分別為64.7%和21.4%，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

圖1 ECHS1蛋白在膽管癌組織中陽性表達(dá)(400×);圖2 PKM2蛋白在膽管癌組織中陽性表達(dá)(400×)

Fig 1 ECHS1 protein was positive in cholangiocarcinoma(400×); Fig 2 PKM2 protein was positive in cholangiocarcinoma (400×)

2.2 ECHS1和PKM2蛋白與膽管癌臨床病理特征的關(guān)系 膽管癌組織中ECHS1和PKM2蛋白的表達(dá)與患者性別、年齡及腫瘤直徑均無相關(guān)性(P>0.05)，而與膽管癌細(xì)胞分化程度、TNM分期以及生存時(shí)間有相關(guān)性(P<0.05，見表1)。

表1 ECHS1和PKM2蛋白表達(dá)與膽管癌臨床病理特征關(guān)系
Tab 1 Relationship between expressions of ECHS1 and PKM2 proteins and clinicopathological characteristics of cholangiocarcinoma

臨床病理特征例數(shù)ECHS1蛋白[n(%)]陽性陰性χ2值P值PKM2蛋白[n(%)]陽性陰性χ2值P值性別 男116(54.5)5(45.5)2.0710.8047(63.6)4(36.4)2.0460.592 女64(66.7)2(33.3)4(66.7)2(33.3)年齡(歲) <4586(75.0)2(25.0)1.2480.8036(75.0)2(25.0)0.2910.705 ≥4594(44.4)5(55.6)5(55.6)4(44.4)腫瘤直徑(cm) <2.0107(70.0)3(30.0)1.7360.6187(70.0)3(30.0)2.9030.611 ≥2.073(42.9)4(57.1)4(57.1)3(42.9)腫瘤分化程度 中-高分化85(62.5)3(37.5)7.3160.0165(62.5)3(37.5)9.0120.024 低分化95(55.6)4(44.4)6(66.7)3(33.3)TNM分期 Ⅰ～Ⅱ53(60.0)2(40.0)8.0360.0153(60.0)2(40.0)9.3140.016 Ⅲ～Ⅳ127(58.3)5(41.7)8(66.7)4(33.3)生存時(shí)間(月) ≥12106(60.0)4(40.0)7.9810.0236(60.0)4(40.0)9.4830.015 <1274(57.1)3(42.9)5(71.4)2(28.6)

3 討論

即使在有氧條件下，惡性腫瘤細(xì)胞糖酵解代謝仍明顯活躍，也經(jīng)由糖酵解轉(zhuǎn)化大量葡萄糖生成乳酸。這一特殊生化表型，被稱為瓦博格效應(yīng)(Warburg effect)[5]。PKM2及ECHS1分別是催化糖酵解及脂肪酸分解代謝β氧化通路的關(guān)鍵酶，傳統(tǒng)認(rèn)為它們的異常表達(dá)可導(dǎo)致一系列代謝性疾病，如嬰兒猝死綜合征和瑞氏綜合征等[6-7]。但最近研究發(fā)現(xiàn)PKM2及ECHS1表達(dá)異常與多種惡性腫瘤發(fā)生、發(fā)展關(guān)系密切[8-9]。袁素娟等[10]研究發(fā)現(xiàn)特異性沉默PKM2基因表達(dá)能夠增加A549細(xì)胞的放射敏感性，推測(cè)其機(jī)制可能與改變細(xì)胞周期分布及射線誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的作用增強(qiáng)有關(guān)。PKM2基因在肝癌組織中高表達(dá)；在單羧酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白4高表達(dá)的肝癌細(xì)胞中敲除PKM2基因，可以顯著抑制肝癌細(xì)胞生長，提示PKM2通過調(diào)節(jié)糖代謝而影響腫瘤細(xì)胞的生長[11]。在乳腺癌中，PP2能誘導(dǎo)乳腺癌細(xì)胞MCF-7凋亡，并下調(diào)ECHS1和PRDX3表達(dá)，如果上調(diào)ECHS1則可以減少細(xì)胞的凋亡[12]。在胃癌細(xì)胞中研究發(fā)現(xiàn)，過表達(dá)ECHS1能促進(jìn)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，下調(diào)則可以抑制細(xì)胞的侵襲與遷移作用[13]。這些研究顯示，PKM2及ECHS1可能與腫瘤的生長和轉(zhuǎn)移有關(guān)。

目前有關(guān)PKM2及ECHS1在膽管癌中調(diào)控特點(diǎn)的研究甚少，因此本研究進(jìn)行了試驗(yàn)性探索，擬為膽管癌診斷及治療提供新途徑。本研究結(jié)果顯示，在癌旁組織中PKM2蛋白和ECHS1蛋白表達(dá)陽性率分別為21.4%和17.9%，但在膽管癌組織中PKM2蛋白和ECHS1蛋白的表達(dá)陽性率分別為64.7%和58.8%，均顯著高于癌旁組織中的表達(dá)，提示膽管癌的發(fā)生可能與PKM2和ECHS1蛋白的異常高表達(dá)有關(guān)。本研究分析了膽管癌組織中PKM2蛋白和ECHS1蛋白的表達(dá)與其臨床病理特征的關(guān)系，結(jié)果發(fā)現(xiàn)：PKM2蛋白和ECHS1蛋白在膽管癌組織中的表達(dá)與患者性別、年齡及腫瘤大小均無相關(guān)性，而與腫瘤分化程度、TNM分期及患者生存時(shí)間均有關(guān)。PKM2蛋白和ECHS1蛋白在低分化癌中的表達(dá)陽性率最高，中高分化癌次之；在淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移陽性癌組織中表達(dá)陽性率高，而淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移陰性癌組織中表達(dá)陽性率低；在Ⅲ～Ⅳ期膽管癌組織中表達(dá)陽性率高，而Ⅰ～Ⅱ期癌組織中表達(dá)陽性率低。另外，本研究還分析了膽管癌組織中PKM2和ECHS1蛋白表達(dá)與患者生存時(shí)間的關(guān)系，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，PKM2蛋白和ECHS1蛋白表達(dá)高的患者相對(duì)低表達(dá)患者生存期較長。

綜上所述, PKM2和ECHS1蛋白的表達(dá)在膽管癌發(fā)生、發(fā)展過程中發(fā)揮重要作用，其具體作用機(jī)理還需要進(jìn)行大樣本的研究來證實(shí)。

[1]Sribenja S, Natthasirikul N, Vaeteewoottacharn K, et al. Thymosin β10 as a predictive biomarker of response to 5-fluorouracil chemotherapy in cholangiocarcinoma [J]. Ann Hepatol, 2016, 15(4): 577-585.

[2]Wang B, Chen L, Chang HT. Potential diagnostic and prognostic biomarkers for cholangiocarcinoma in serum and bile [J]. Biomark Med, 2016, 10(6): 613-619.

[3]Kaewpitoon SJ, Rujirakul R, Loyd RA, et al. Surveillance of populations at risk of cholangiocarcinoma development in rural communities of thailand using the Korat-CCA verbal screening test [J]. Asian Pac J Cancer Prev, 2016, 17(4): 2205-2209.

[4]Takada K, Toyokawa G, Okamoto T, et al. An immunohistochemical analysis of PP-L1, protein expression in surgically resected small cell lung cancer using different antibodies and criteria [J]. Anticancer Res, 2016, 36(7): 3409-3412.

[5]Vamecq J, Colet JM, Vanden Eynde JJ, et al. PPARs: Interference with Warburg’ effect and clinical anticancer trials [J]. PPAR Res, 2012, 2012: 304760.

[6]Xie JP, Zhu XS, Dai YC, et al. Expression of enoyl coenzyme A hydratase, short chain, 1, in colorectal cancer and its association with clinic pathological characteristics [J]. Mol Clin Oncol, 2014, 2(6): 1081-1084.

[7]Zhang J, Song M, Wang J, et al. Enoyl coenzyme A hydratase 1 is an important factor in the lymphatic metastasis of tumors [J]. Biomed Pharmacother, 2011, 65(3): 157-162.

[8]Dong G, Mao Q, Xia W, et al. PKM2 and cancer: The function of PKM2 beyond glycolysis [J]. Oncol Lett, 2016, 11(3): 1980-1986.

[9]朱小三, 戴益琛, 陳章興, 等. 烯脂酰輔酶A水合酶短鏈1促進(jìn)肝癌HepG2細(xì)胞的增殖[J].腫瘤, 2013, 33(05): 422-427. Zhu XS, Dai YC, Chen ZX, et al. Enoyl-coenzyme A hydratase, short chain 1 involved in promoting the proliferation of hepatocellular carcinoma HepG2 cells [J].Tumor, 2013, 33 (5): 422-427.

[10]袁素娟， 喬田奎， 莊喜兵， 等. PKM2基因沉默對(duì)人肺癌A549細(xì)胞放射敏感性的影響[J]. 中華放射醫(yī)學(xué)與防護(hù)雜志， 2015， 35(6)： 428-432. Yuan SJ, Qiao TK, Zhuang XB, et al. Blockage of PKM2 expression by gene silencing enhances the radiosensitivity of human lung cancer A549 cells [J]. Chin J Radiol Med Prot, 2015, 35(6): 428-432.

[11]Jung Y, Jang YJ, Kang MH, et al. Metabolic signature genes associated with susceptibility to pyruvate kinase, muscle type 2 gene ablation in cancer [J]. Mol Cells, 2013, 35(4): 335-341．

[12]Liu X, Feng R, Du L. The role of enoyl-CoA hydratase short chain 1 and peroxiredoxin 3 in PP2-induced apoptosis in human breast cancer MCF-7 cells [J]. FEBS Lett, 2010, 584(14): 3185-3192.

[13]Zhu XS, Gao P, Dai YC, et al. Attenuation of enoyl coenzyme A hydratase short chain 1 expression in gastric cancer cells inhibits cell proliferation and migration in vitro [J]. Cell Mol Biol Lett, 2014, 19(4): 576-589.

(責(zé)任編輯：李 健)

Expressions of ECHS1 and PKM2 proteins in cholangiocarcinoma and the clinical significance

ZENG Wei1, GAO Peng1, ZHU Xiaosan1, DAI Yichen1, CHEN Zhangxing1, XIE Junpei1, ZHAN Xiaojuan1, ZHAN Ru2

1.Department of Gastroenterology; 2.Department of Pathology, the 174th Hospital of PLA, Xiamen 361003, China

Objective To investigate the expressions and clinical significance of ECHS1 and PKM2 proteins in cholangiocarcinoma.Methods The expressions of ECHS1 and PKM2 in cholangiocarcinoma tissues and paracancerous normal bile duct tissues were detected. The relationship of expressions of ECHS1 and PKM2 proteins with clinical pathology features and prognosis of cholangiocarcinoma were analyzed.Results The positive rates of ECHS1 and PKM2 proteins were significantly higher in cholangiocarcinoma than those in normal tissues (58.8%vs17.9%, 64.7%vs21.4%,P<0.05). The expressions of ECHS1 and PKM2 proteins in cholangiocarcinoma were not related with sex, age and tumor size (P>0.05). However, they were related with the differentiation grade, TNM stage and postoperative survival time (P<0.05)．Conclusion Both ECHS1 and PKM2 poteins may play important roles in the occurrence and development of cholangiocarcinoma．

Cholangiocarcinoma; ECHS1; PKM2; Prognosis

10.3969/j.issn.1006-5709.2017.05.025

2016年廈門市科技計(jì)劃項(xiàng)目(3502Z20164045); 2015年南京軍區(qū)醫(yī)學(xué)科技創(chuàng)新課題(15MS099)

曾偉，醫(yī)學(xué)碩士，主治醫(yī)師，研究方向：膽管癌基因診斷與治療。E-mail: weizeng2166@163.com

戴益琛，醫(yī)學(xué)博士，教授，研究方向：消化系統(tǒng)腫瘤基礎(chǔ)與臨床研究。E-mail: dyichen@sina.com

R735.8

A

1006-5709(2017)05-0570-03

2016-09-13