槲皮素逆轉(zhuǎn)結(jié)腸癌耐藥細(xì)胞SW480/OXP耐藥性研究

李彩麗，成 丹，孫澤群，劉 岳

湖北醫(yī)藥學(xué)院附屬人民醫(yī)院食管腫瘤研究所，湖北 十堰 442000

槲皮素逆轉(zhuǎn)結(jié)腸癌耐藥細(xì)胞SW480/OXP耐藥性研究

李彩麗，成 丹，孫澤群，劉 岳

湖北醫(yī)藥學(xué)院附屬人民醫(yī)院食管腫瘤研究所，湖北 十堰 442000

目的 觀察槲皮素(Quercetin,Que)對結(jié)腸癌耐藥細(xì)胞SW480/OXP耐藥性的逆轉(zhuǎn)，并探討其可能的機制。方法 體外誘導(dǎo)結(jié)腸癌耐藥細(xì)胞SW480/OXP，用10 μg/ml、20 μg/ml的Que處理SW480/OXP細(xì)胞，CCK8法檢測對其耐藥性的影響，羅丹明123檢測細(xì)胞膜泵功能，實時熒光定量PCR檢測MDR1及E-cadherin mRNA的表達(dá)，Western blotting檢測P-gp和E-cadherin蛋白的表達(dá)。結(jié)果 10 μg/ml Que及20 μg/ml Que對SW480/OXP的逆轉(zhuǎn)倍數(shù)分別為2.25和3.08。經(jīng)Que處理的SW480/OXP細(xì)胞中羅丹明123殘余熒光強度大于SW480/OXP細(xì)胞。以10μg/ml和20μg/ml Que處理后，MDR1/P-gp mRNA及蛋白的相對表達(dá)量均下降，E-cadherin mRNA和蛋白相對表達(dá)量則上升。結(jié)論 Que可逆轉(zhuǎn)SW480/OXP的耐藥，可影響P-gp的功能，降低MDR1/P-gp mRNA及蛋白的表達(dá)，并可誘導(dǎo)耐藥細(xì)胞E-cadherin mRNA和蛋白表達(dá)上升。

槲皮素；耐藥；奧沙利鉑

目前大腸癌是主要的致死性腫瘤之一，化療仍是臨床治療大腸癌的重要手段，預(yù)防和逆轉(zhuǎn)大腸癌耐藥性的產(chǎn)生，是提高大腸癌治療效果的重要手段，我們誘導(dǎo)了奧沙利鉑(Oxaliplatin, OXP)耐藥的大腸癌細(xì)胞系SW480/OXP，觀察槲皮素(Quercetin, Que)對SW480/OXP細(xì)胞耐藥的逆轉(zhuǎn)情況，并探討其可能的機制。

1 材料與方法

1.1 藥品與試劑 OXP購自江蘇恒瑞藥業(yè)，CCK8試劑盒購自日本同仁化學(xué)研究所，Que和羅丹明123購自美國Sigma公司，抗P-gp抗體購自德國Merck公司，抗E-cadherin抗體購自美國Bioworld Technology公司。Trizol購自美國Invitrogen公司，逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購自瑞士Rhoche公司。熒光Mix購自北京天根生化科技有限公司，所需引物委托南京金斯瑞生物科技有限公司合成。

1.2 結(jié)腸癌耐OXP細(xì)胞的誘導(dǎo) 人結(jié)直腸癌SW480細(xì)胞系保存于本研究所細(xì)胞中心。細(xì)胞在含100 g/L新生牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)液中貼壁生長，置于37 ℃、體積分?jǐn)?shù)5% CO2飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，0.25%胰蛋白酶消化傳代。按照公式計算OXP峰值血漿濃度(peak plasma concentration, PPC)為4.5 μg/ml [PPC (μg/ml) =50×D×2×103/500，其中D 指的是臨床應(yīng)用劑量(mg·kg-1·d-1)][1]。采取低濃度長時間誘導(dǎo)的方式誘導(dǎo)SW480對OXP耐藥。SW480細(xì)胞貼壁后，換用含0.1×PPC濃度的OXP完全培養(yǎng)基，使OXP與SW480細(xì)胞持續(xù)接觸24 h后，棄培養(yǎng)液，換用不含OXP的完全培養(yǎng)基，逐漸去除死亡細(xì)胞，待其恢復(fù)生長后，再次換用含0.1×PPC濃度的OXP培養(yǎng)液，24 h后撤藥換用完全培養(yǎng)基，待其恢復(fù)生長后換用含有0.125×PPC的OXP培養(yǎng)基，并重復(fù)1次。如此反復(fù)換液、傳代，以1.25～1.5倍的梯度逐步提高OXP濃度，直至其能耐受1×PPC濃度的OXP，將其維持培養(yǎng)在含1 μg/ml OXP的培養(yǎng)基中，命名為SW480/OXP。

1.3 SW480/OXP的耐藥性檢測 取對數(shù)生長期的SW480細(xì)胞及SW480/OXP細(xì)胞，常規(guī)消化，制成1×105個/ml濃度的細(xì)胞懸液，在96孔板中接種90 μl的細(xì)胞懸液，培養(yǎng)過夜，向孔中加入OXP，使培養(yǎng)液中OXP的濃度為分別為0.5 μg/ml、5 μg/ml、25 μg/ml、50 μg/ml、100 μg/ml、200 μg/ml、400 μg/ml，每種濃度設(shè)3個復(fù)孔，同時設(shè)立無細(xì)胞僅有培養(yǎng)液的調(diào)零組和未加藥物的空白組，培養(yǎng)24 h，棄去孔中培養(yǎng)液，加入含10% CCK-8溶液的培養(yǎng)液100 μl，37 ℃孵育2 h，用酶標(biāo)儀測定在450 nm處的吸光度值。細(xì)胞抑制率(%)= (OD空白孔-OD待測孔)/(OD空白孔-OD調(diào)零孔)×100%。實驗重復(fù)3次，SPSS軟件計算半數(shù)抑制濃度(half maximal inhibitory oncentration，IC50)，耐藥指數(shù)(resistance index, RI)=IC50(耐藥細(xì)胞)/IC50(親本細(xì)胞)。

1.4 Que對SW480/OXP細(xì)胞的耐藥逆轉(zhuǎn)作用10 μg/ml、20 μg/ml 的Que預(yù)處理SW480/OXP細(xì)胞24 h，對照組加入溶媒(1‰ DMSO)常規(guī)消化，制成1×105個/ml細(xì)胞懸液，在96孔板中接種90 μl的細(xì)胞懸液，培養(yǎng)過夜，向孔中加入OXP，按照1.2的方法計算IC50及RI，Que對SW480/OXP的逆轉(zhuǎn)倍數(shù)為使用Que前 IC50/使用Que后 IC50)。

1.5 羅丹明123排出實驗 制備SW480/OXP單細(xì)胞懸液，以1×106個/ml的濃度接種24孔板，分別加入10 μg/ml、20 μg/ml的Que處理24 h，對照孔加入溶媒，換用含200 ng/ml羅丹明123的新鮮培養(yǎng)液，37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)孵育30 min，洗滌3次，換用正常培養(yǎng)液繼續(xù)孵育60 min，熒光顯微鏡下觀察。

1.6 實時熒光定量PCR 10 μg/ml、20 μg/ml Que干預(yù)SW480/OXP細(xì)胞24 h，等量的溶媒處理對照組24 h，Trizol試劑盒提取總RNA，按照Rhoche逆轉(zhuǎn)錄和天根熒光Mix說明書逆轉(zhuǎn)錄和PCR擴增反應(yīng)。以β-actin作為內(nèi)參照。以2-ΔΔCt法處理數(shù)據(jù)，進(jìn)行相對定量分析，所用PCR反應(yīng)所用引物序列如下：MDR1上游序列5′-ATATCAGCAGCCCACATCAT-3′，下游序列5′-GAAGCACTGGGATGTCCGGT-3′；E-cadherin上游序列5′-TGATTCTGCTGCTCTTGCTGTT-3′，下游序列5′-CAAAGTCCTGGTCCTCTTCTCC-3′；β-actin上游序列5′- CAAGATCATTGCTCCTCCTGA-3′，下游序列5′-AGTCCGCCTAGAAGCATTTG-3′。

1.7 Western blotting檢測P-gp和E-cadherin水平 10 μg/ml、20 μg/ml Que干預(yù)SW480/OXP細(xì)胞24 h，溶媒處理對照組24 h，收集對數(shù)生長期的3種細(xì)胞，冰PBS洗2次, 加入含有蛋白酶抑制劑的細(xì)胞裂解液，冰上裂解30 min，4 ℃離心，取上清; 蛋白上樣量20 μg，10%的SDS-PAGE凝膠電泳分離蛋白，電流12～15 mA，濕轉(zhuǎn)120 min，電壓70 V；1% BSA室溫封閉1 h；加小鼠抗P-gp(1∶100)和兔抗E-cadherin(1∶1 000)，4 ℃過夜，分別以羊抗小鼠和羊抗兔二抗(1∶5 000)反應(yīng)2 h，ECL顯色，BIO-RAD凝膠成像系統(tǒng)掃描、分析。

2 結(jié)果

2.1 Que對SW480/OXP 耐藥性的逆轉(zhuǎn) 如圖1所示，低濃度(0.5 μg/ml)OXP聯(lián)合Que后對SW480/OXP細(xì)胞的抑制率并無明顯影響(P>0.05)，5 μg/ml以上的OXP聯(lián)合Que后對SW480/OXP細(xì)胞的抑制率大于單用OXP(P<0.05)，SW480細(xì)胞、SW480/OXP、SW480/OXP聯(lián)合10 μg/ml Que及20 μg/ml Que的OXP IC50分別為9.92±1.23、107.65±3.24、47.81±0.83、34.90±4.26，SW480/OXP、SW480/OXP聯(lián)合10 μg/ml Que及20 μg/ml Que對OXP的耐藥指數(shù)分別10.85、4.82和3.52。10 μg/ml Que及20 μg/ml Que對SW480/OXP的逆轉(zhuǎn)倍數(shù)分別為2.25和3.08。

圖1 Que對SW480/OXP細(xì)胞OXP耐藥性的影響Fig 1 Effect of the Que on drug resistance for SW480/OXP cells

2.2 羅丹明123熒光排出實驗 如圖2所示，羅丹明123可進(jìn)入SW480/OXP細(xì)胞，積聚在核膜和胞漿周圍，發(fā)出明亮的綠色熒光，洗去羅丹明123并換液孵育60 min后，SW480/OXP熒光明顯減弱，Que處理的和SW480/OXP細(xì)胞中殘存的熒光強度要大于SW480/OXP細(xì)胞。

2.3 MDR1和E-cadherin mRNA的水平 如圖3所示，SW480/OXP細(xì)胞為對照組，經(jīng)10 μg/ml和20 μg/ml Que處理后，MDR1 mRNA相對表達(dá)量分別為0.55±0.05和0.35±0.05，E-cadherin mRNA相對表達(dá)量分別為1.39±0.11和2.61±0.32，經(jīng)Que處理后，MDR1、E-cadherin mRNA表達(dá)與SW480/OXP組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。

圖2 Que對SW480/OXP細(xì)胞羅丹明123排出的影響(100×) 羅丹明123可聚集在SW480/OXP細(xì)胞中(a，b，c)，發(fā)出黃綠色熒光，60 min后SW480/OXP細(xì)胞可排出大部分羅丹明123，細(xì)胞內(nèi)熒光強度明顯減弱(d)，而用Que處理過的SW480/OXP細(xì)胞(e，f)中熒光排出延緩。熒光強度強于正常SW480/OXP細(xì)胞

Fig 2 Effect of the outflow of Rhodamine 123 for SW480/OXP cells(100×)

2.4 P-gp和E-cadherin 的蛋白表達(dá) 如圖4所示，以SW480/OXP細(xì)胞為對照組，經(jīng)10 μg/ml 和20 μg/ml Que處理后，P-gp蛋白相對表達(dá)量分別為0.79±0.03和0.82±0.12，E-cadherin 相對蛋白表達(dá)量分別為1.22±0.10和1.56±0.12，給予Que處理后，P-gp、E-cadherin蛋白表達(dá)與對照組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。

注：與SW480/OXP組比較，*P<0.05，與SW480/OXP+10 μg/ml Que組比較，**P<0.05 。

圖3 MDR1和E-cadherin mRNA的相對表達(dá)量
Fig 3 Relative expression of MDR1 and E-cadherin mRNA

注：與SW480/OXP組比較，* P<0.05；與SW480/OXP+10 μg/ml Que組比較，** P<0.05 。

3 討論

我國結(jié)腸癌患病率、病死率逐年上升，2011年病死率已達(dá)到7.7/10萬人[2]，盡管治療手段在不斷更新，但結(jié)腸癌的耐藥，依舊是結(jié)腸癌治療面臨的嚴(yán)峻問題之一。天然的藥物成分對腫瘤耐藥的逆轉(zhuǎn)作用引起了廣泛的關(guān)注，Que是一種天然的黃酮類化合物, 可從多種植物中提取，具有很強抗氧化自由基活性而具有抗炎癥、抗衰老及抗腫瘤生物學(xué)特性，可逆轉(zhuǎn)卵巢癌等腫瘤細(xì)胞的耐藥[3]。我們以具有一定的天然耐藥性SW480細(xì)胞為親本細(xì)胞[1，4]，進(jìn)一步誘導(dǎo)其獲得性耐藥，觀察Que對SW480/OXP耐藥的逆轉(zhuǎn)效果，及對P-gp和E-cadherin表達(dá)的影響。研究發(fā)現(xiàn)，Que可逆轉(zhuǎn)SW480/OXP對OXP的耐藥，且這種逆轉(zhuǎn)作用有一定濃度依賴性，10 μg/ml及20 μg/ml Que對SW480/OXP的逆轉(zhuǎn)倍數(shù)分別為2.25和3.08。

P-gp由MDR1編碼，是能量依賴性的細(xì)胞膜外排泵，也是重要的耐藥基因。在結(jié)直腸癌中，P-gp的過量表達(dá)，可引起化療藥物的外排，從而影響患者的化療效果[5]，羅丹明123是P-gp的作用底物，可通過羅丹明123熒光的表達(dá)，評價P-gp的泵功能。E-cadherin是一類主要介導(dǎo)同質(zhì)細(xì)胞間黏附的鈣依賴性跨膜糖蛋白，是腫瘤進(jìn)展的關(guān)鍵蛋白，是上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial-mesenchymal transition, EMT)的重要標(biāo)志物[6]。E-cadherin表達(dá)降低及其與許多腫瘤的惡性過程密切相關(guān)，如侵襲、轉(zhuǎn)移、耐藥等。P-gp與EMT在某種程度上有一定的關(guān)聯(lián)性，且受某些共同的通路調(diào)節(jié)[7-8]。

我們在前期研究中[9]，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了SW480/OXP在誘導(dǎo)產(chǎn)生耐藥性的過程中，出現(xiàn)P-gp升高及E-cadherin下降的情況。已有研究證實，EMT現(xiàn)象與腫瘤耐藥相關(guān)[10]，而在使用Que處理SW480/OXP時也發(fā)現(xiàn)羅丹明123熒光排出延緩，并伴有P-gp和MDR1 mRNA和蛋白的表達(dá)下調(diào)及E-cadherin的表達(dá)上調(diào)。這提示Que可能通過抑制耐藥腫瘤細(xì)胞P-gp的功能和表達(dá)，減少藥物的外排作用，E-cadherin的升高提示，Que可能逆轉(zhuǎn)SW480在耐藥過程中產(chǎn)生EMT，降低腫瘤細(xì)胞的“干細(xì)胞性”，從而逆轉(zhuǎn)耐藥腫瘤細(xì)胞的耐藥。

綜上所述，Que 可以逆轉(zhuǎn)SW480/OXP的耐藥，影響P-gp的功能，降低MDR1/P-gp基因和蛋白的表達(dá)，并引起耐藥細(xì)胞有E-cadherin基因和蛋白表達(dá)上升。但是，因為Que溶解性等其他原因，我們沒有進(jìn)行更高濃度Que逆轉(zhuǎn)效果的觀察，進(jìn)一步深入研究Que在耐藥逆轉(zhuǎn)中所起的作用將有較大的臨床應(yīng)用價值。

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(責(zé)任編輯：馬 軍)

Study of drug resistance by the Quercetin in human colorectal cancer SW480/OXP cells

LI Caili, CHENG Dan, SUN Zequn, LIU Yue

Institute of Esophageal Tumor, Renmin Hospital, Hubei University of Medicine, Shiyan 442000, China

Objective To observe the effects of Quercetin (Que) on SW480/OXP colorectal cancer cells and to investigate the possible mechanism of action.Methods The oxaliplatin (OXP) resistant colorectal cancer cell line SW480/OXP were induced， SW480/OXP were treated with 10 μg/ml and 20 μg/ml by Que，the chemosensitivities and resistance indexes were tested by CCK8 assay, the function of P-gp was determined by Rhodamine 123, the expressions of MDR1/P-gp and E-cadherin were determined by real-time PCR and Western blotting.Results The reversal indexes of 10 μg/ml and 20 μg/ml Que on SW480/OXP were 2.25 and 3.08, respectively. After treated with 10 μg/ml and 20 μg/ml Que, the fluorescence outflow of Rhodamine 123 were delayed, and the expressions of MDR1/P-gp mRNA and protein were decreased, but the expressions of E-cadherin mRNA and protein were upregulated.Conclusion The drug resistance of SW480/OXP can be reversed by Que and influence the expressions of MDR1/P-gp and E-cadherin.

Quercetin; Drug resistance; Oxaliplatin

10.3969/j.issn.1006-5709.2017.05.019

湖北省教育廳科研計劃支持(B20122425)

李彩麗，碩士，研究方向：消化道疾病基礎(chǔ)。E-mail:licailili@163.com

劉岳，博士，副教授，研究方向：腫瘤臨床。E-mail:liuyue_119@163.com

R735.3+5

A

1006-5709(2017)05-0551-04

2016-01-08