腸易激綜合征患者腸道中難辨梭狀芽胞桿菌的變化

鄭 潔，賈彥彬,2，黨 彤

1.包頭醫(yī)學(xué)院第二附屬醫(yī)院內(nèi)蒙古消化病研究所，內(nèi)蒙古 包頭 014030； 2.包頭醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)與法醫(yī)學(xué)院病原生物學(xué)教研室

腸易激綜合征患者腸道中難辨梭狀芽胞桿菌的變化

鄭 潔1，賈彥彬1,2，黨 彤1

1.包頭醫(yī)學(xué)院第二附屬醫(yī)院內(nèi)蒙古消化病研究所，內(nèi)蒙古 包頭 014030； 2.包頭醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)與法醫(yī)學(xué)院病原生物學(xué)教研室

目的 觀察腸易激綜合征(irritable bowel syndrome, IBS)患者腸道中難辨梭狀芽胞桿菌(Clostridium difficile,C.difficile)含量的變化，探討IBS與C.difficile的相關(guān)性。方法 根據(jù)羅馬Ⅲ標(biāo)準(zhǔn)，收集包頭醫(yī)學(xué)院第二附屬醫(yī)院消化科收治的IBS患者30例，同時(shí)選取30名健康體檢者作為對照組，利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法檢測研究對象糞便中C.difficile含量。結(jié)果 與對照組比較， IBS患者及各亞型患者腸道C.difficile含量差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。結(jié)論 IBS可能與C.difficile無相關(guān)性。

腸易激綜合征；難辨梭狀芽胞桿菌；實(shí)時(shí)熒光定量PCR

近年來，由于患病率逐漸增加，腸易激綜合征(irritable bowel syndrome, IBS)受到廣泛關(guān)注。根據(jù)糞便的性狀不同，IBS分為腹瀉型(IBS-D)、便秘型(IBS-C)、混合型(IBS-M)、不定型(IBS-U)[1]。目前，IBS發(fā)病機(jī)制尚不明確，有研究表明，IBS與腸道菌群有著密切關(guān)系[2]。

難辨梭狀芽胞桿菌(C.difficile)是厭氧革蘭陽性桿菌，可引起C.difficile相關(guān)性腹瀉[3]，一般是由服用抗生素或感染引起。本研究利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法，觀察IBS患者腸道C.difficile的變化，為臨床指導(dǎo)抗生素對IBS的治療有一定的意義。

1 資料與方法

1.1 一般資料 收集2015年1月-2015年7月在包頭醫(yī)學(xué)院第二附屬醫(yī)院消化科就診的IBS患者共30例，另選取健康體檢者30名作為對照組。

1.2 納入標(biāo)準(zhǔn) 根據(jù)羅馬Ⅲ診斷標(biāo)準(zhǔn)[4],IBS組：反復(fù)出現(xiàn)腹痛或腹部不適，診斷時(shí)，癥狀已出現(xiàn)≥6個(gè)月，最近3個(gè)月內(nèi)每個(gè)月典型癥狀發(fā)作≥3 d，同時(shí)伴有以下2種或2種以上癥狀：(1)排便后癥狀緩解；(2)發(fā)作時(shí)排便頻率發(fā)生變化；(3)發(fā)作時(shí)排便的形狀改變，此外，腹部不適是指無法用疼痛來形容的不適感。支持診斷：(1)異常頻率變化：每周排便次數(shù)<3次或每天排便次數(shù)>3次；(2)糞便性狀的變化：塊狀便/硬便或松散便/稀水便；(3)排便費(fèi)力，下墜感，排便急迫感或排便不盡感，排出黏液及腹脹。排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)患者行相關(guān)輔助檢查，如血、尿、便常規(guī)、生化常規(guī)、腹部超聲及電子結(jié)腸鏡等，有腸道器質(zhì)性病變；(2)年齡<18歲；(3)有心血管、呼吸、腎臟等其他系統(tǒng)的嚴(yán)重疾病者；(4)有腹部手術(shù)史者；(5)懷孕期或哺乳期者；(6)患者近2周內(nèi)使用過膨脹劑、止瀉藥、抗菌藥物、解痙藥、益生菌制劑藥物。

健康對照組的選?。簛碜越】刁w檢者，除外病例組選取標(biāo)準(zhǔn)及其排除因素，同時(shí)性別、年齡、民族、生活環(huán)境等基本情況均與病例組相匹配。

1.3 方法

1.3.1 糞便標(biāo)本收集、DNA提取及總DNA純度、濃度的檢測：所有研究對象在自然排便后，迅速用無菌棉簽取適量中段新鮮的糞便(至少2 g)，放置無菌便盒內(nèi)，2 h內(nèi)將糞便標(biāo)本于-80 ℃冰箱保存?zhèn)溆?。利用TIANamp Stool DNA Kit(DP328)試劑盒(TIANGEN 公司)提取糞便DNA，并于-20 ℃冰箱保存。使用紫外分光光度計(jì)(Thermo scientific 公司)檢測總DNA濃度及OD260/OD280比值。

1.3.2 引物的設(shè)計(jì)與合成：根據(jù)所查閱文獻(xiàn)設(shè)計(jì)PCR引物[5-6]，在NCBI數(shù)據(jù)庫中使用BLAST軟件比對引物的特異性，并送至上海生工試劑公司合成。C.difficile的引物為F:5′-TTGAGCGATTTACTTCGGTAAAGA-3′，R:5′-CCATCCTGTACTGGCTCAC CT-3′。

1.3.3 標(biāo)準(zhǔn)品制備：以提取對照組的糞便DNA為模板，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，反應(yīng)體系(50 μl)(杭州BIO SCI 公司)：Taq PCR Master Mix (2×) 25 μl，F(xiàn)orword primer(10 μmol/L) 1 μl，Reverse primer (10 μmol/L)1 μl，DNA模板(2.5～50 ng) 2 μl，ddH2O 21 μl；反應(yīng)條件：預(yù)變性94 ℃，2 min，變性94 ℃，30 s，Tm為58 ℃，3 min,共30個(gè)循環(huán)。PCR產(chǎn)物用0.8%瓊脂糖凝膠電泳，在紫外燈下切膠，將切下的目的條帶用普通瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒DP209(TIANGEN 公司)純化回收。將標(biāo)準(zhǔn)品按照公式換算為1 μl所含拷貝為8.73×1013copies。

1.3.4 實(shí)時(shí)熒光定量PCR：將稀釋的標(biāo)準(zhǔn)品、待測樣本細(xì)菌DNA進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR，反應(yīng)體系(20 μl)(日本TAKARA 公司)：SYBR Premix Ex Taq Ⅱ (2×) 10 μl，PCR Forward Primer (10 μmol/L) 0.8 μl，PCR Reverse Primer (10 μmol/L) 0.8 μl，ROX Reference Dye Ⅱ (50×) 0.4 μl，DNA模板(<100 ng)2 μl, ddH2O(滅菌) 6 μl；反應(yīng)條件：預(yù)變性95 ℃，30 s，變性95 ℃，5 s，Tm 60 ℃，34 s，共40個(gè)循環(huán)。所有待測樣本均有3個(gè)平行復(fù)孔，反應(yīng)結(jié)束后分析實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀(美國ABI公司)產(chǎn)生的擴(kuò)增曲線、溶解曲線，以檢測產(chǎn)物的特異性，同時(shí)可根據(jù)不同稀釋梯度DNA的Ct值制作標(biāo)準(zhǔn)曲線。

2 結(jié)果

2.1 臨床資料 IBS患者30例，男12例，女18例，年齡(46.77±10.77)歲，其中IBS-C型患者12例，IBS-D型患者12例，IBS-M型患者6例。對照組30名，男18名，女12名，年齡(46.26±10.01)歲，IBS組與對照組性別和年齡比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

2.2 總DNA純度、濃度測定結(jié)果 分光光度計(jì)檢測糞便樣本提取的總DNA，濃度為240～300 μg/ml，OD260/OD280比值結(jié)果1.7～1.9。

2.3 標(biāo)準(zhǔn)品標(biāo)準(zhǔn)曲線分析 以不同拷貝數(shù)的標(biāo)準(zhǔn)品的對數(shù)為縱坐標(biāo)，實(shí)時(shí)熒光定量PCR反應(yīng)中達(dá)熒光閾值時(shí)循環(huán)數(shù)(CT值)為橫坐標(biāo)，得到標(biāo)準(zhǔn)品的標(biāo)準(zhǔn)曲線(見圖1)。

圖1 標(biāo)準(zhǔn)曲線

2.4 溶解曲線 實(shí)時(shí)熒光定量PCR后產(chǎn)生的溶解曲線為單峰，擴(kuò)增產(chǎn)物單一(見圖2)。

圖2 溶解曲線

2.5 IBS患者腸道C.difficile定量結(jié)果 與對照組比較，IBS患者腸道C.difficile定量差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。此外，各亞型IBS患者腸道C.difficile與對照組比較，差異也無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05，見表1)。

3 討論

目前，IBS是常見的胃腸道功能紊亂的消化系統(tǒng)疾病，發(fā)病機(jī)制尚不明確，近幾年有研究表明腸道感染可引起IBS的發(fā)生[7]。對于感染后IBS(PI-IBS)這一概念的提出，首先是1950年英國學(xué)者 Stewart首次描述了在患者感染阿米巴痢疾后出現(xiàn)腸道癥狀，后于1997年Neal等學(xué)者通過研究發(fā)現(xiàn)部分患者急性胃腸感染6個(gè)月后仍出現(xiàn)腸道癥狀[8-9]。PI-IBS主要診斷是在胃腸道感染恢復(fù)后出現(xiàn)IBS癥狀，并且符合羅馬Ⅲ標(biāo)準(zhǔn)，其主要癥狀為IBS-D癥狀[10]，主要表現(xiàn)為腹痛、腹瀉、排便次數(shù)增加等。

組別例數(shù)難辨梭狀芽孢桿菌t值P值對照組306.43±0.01IBS組306.26±0.511.623>0.05 IBS-D組126.37±0.340.430>0.05 IBS-C組126.29±0.241.101>0.05 IBS-M組66.30±0.250.826>0.05

注：表中t值和P值均為與對照組比較。

C.difficile是1935年在嬰兒的大便中分離出來，因培養(yǎng)分離都比較困難而得名[11]，作為正常菌群大量存在于嬰兒的腸道內(nèi)，但在成人的腸道內(nèi)含量很低，僅約5%的成人攜帶[12]。當(dāng)感染或服用抗生素等引起腸道黏膜被破壞時(shí)，就會(huì)導(dǎo)致C.difficile相關(guān)的腹瀉(CDAD)[13]，如抗生素相關(guān)腹瀉、偽膜性腸炎等。C.difficile的致病力主要是腸毒素A和細(xì)胞毒素B，可引起上皮組織的損傷和炎癥反應(yīng)，導(dǎo)致腹部不適和腹瀉[14]。使CDAD癥狀輕者與IBS-D和IBS-M型患者的癥狀十分相似。

目前關(guān)于C.difficile在IBS患者腸道中有怎樣的變化研究報(bào)道有限。我們研究結(jié)果顯示，與對照組比較，C.difficile在IBS患者以及各亞型患者腸道中無明顯改變。Piche等[15]研究發(fā)現(xiàn)，在C.difficile急性感染后，一過性腸道功能紊亂發(fā)生率較高(34.7%)，3個(gè)月后PI-IBS發(fā)生率僅為4.3%。 鐘嵐等[16]通過酶聯(lián)熒光測定技術(shù)，檢測研究對象糞便中的C.difficile毒素A，發(fā)現(xiàn)在IBS-D和IBS-M患者中，無致病性C.difficile感染或攜帶C.difficile，與本研究結(jié)果相符。

本研究利用的PCR技術(shù)，相對于傳統(tǒng)的培養(yǎng)細(xì)菌的方法，減少了很多繁瑣程序，省時(shí)省力。目前實(shí)驗(yàn)室常用的方法是酶聯(lián)免疫吸附方法，價(jià)格便宜，周期短，但缺乏敏感性，PCR技術(shù)具有很高的敏感性和特異性。Kvach等[17]通過PCR技術(shù)、細(xì)胞毒反應(yīng)、酶聯(lián)免疫法分別對糞便樣本中C.difficile進(jìn)行檢測，發(fā)現(xiàn)PCR技術(shù)的敏感性、特異性、陽性預(yù)測率、陰性預(yù)測率均明顯高于另兩種方法。

本研究結(jié)果提示，C.difficile在IBS患者腸道無明顯變化，但本研究樣本量較小，還需擴(kuò)大樣本量進(jìn)一步研究。

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(責(zé)任編輯：陳香宇)

The change of intestinal Clostridium difficile in patients with irritable bowel syndrome

ZHENG Jie1, JIA Yanbin1,2, DANG Tong1

1.Inner Mongolia Institute of Digestive Diseases, the Second Affiliated Hospital of Baotou Medical College, Baotou 014030; 2.Department of Pathogenic Biology, School of Basic Medicine and Forensic Medicine, Baotou Medical College, China

Objective To observe the change of intestinal Clostridium difficile (C.difficile) in patients with irritable bowel syndrome (IBS), and to investigate the correlation between IBS andC.difficile.Methods According to the Rome Ⅲ criteria, 30 patients diagnosed as IBS were recruited in the Department of Gastroenterology, the Second Affiliated Hospital of Baotou Medical College, and 30 health subjects were selected as control group. The contents ofC.difficilein subjects’ feces were measured by real-time quantitative PCR method. The contents ofC.difficilebetween IBS and controls were compared.Results Compared with the control group, the contents of intestinalC.difficilein patients with IBS as well as in each subtype of IBS had no significant changes (P>0.05).Conclusion IBS may not be associated withC.difficile.

Irritable bowel syndrome; Clostridium difficile; Real-time quantitative PCR

10.3969/j.issn.1006-5709.2017.05.010

鄭潔，醫(yī)師，研究方向：胃腸疾病。E-mail:ywtk45@sina.com

黨彤，主任醫(yī)師，研究方向：消化系統(tǒng)疾病。E-mail:dtong999@sina.com

R574.4

A

1006-5709(2017)05-0518-03

2016-10-16