催化槲皮素生成異鼠李素的重組菌構(gòu)建及其轉(zhuǎn)化條件優(yōu)化

裴建軍，董萍△，徐菲，趙東霞，趙林果*,丁崗，蕭偉

(1.南京林業(yè)大學(xué)化學(xué)工程學(xué)院，江蘇省生物質(zhì)綠色燃料與化學(xué)品重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，南京210037；2.江蘇康緣藥業(yè)股份有限公司，江蘇連云港222001)

催化槲皮素生成異鼠李素的重組菌構(gòu)建及其轉(zhuǎn)化條件優(yōu)化

裴建軍1，董萍1△，徐菲1，趙東霞1，趙林果1*,丁崗2，蕭偉2

(1.南京林業(yè)大學(xué)化學(xué)工程學(xué)院，江蘇省生物質(zhì)綠色燃料與化學(xué)品重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，南京210037；2.江蘇康緣藥業(yè)股份有限公司，江蘇連云港222001)

異鼠李素是一種黃酮類化合物，廣泛存在于銀杏、沙棘、旱柳和枸杞等植物中，具有多種藥理作用。植物來源的O-甲基化酶能對槲皮素羥基進(jìn)行甲基化，因而構(gòu)建重組菌高效表達(dá)O-甲基化酶可應(yīng)用于催化槲皮素生成異鼠李素。筆者對大豆來源的O-甲基化酶SOMT-9編碼基因進(jìn)行了密碼子優(yōu)化，其密碼子適應(yīng)指數(shù)(CAI)從優(yōu)化前的0.59，提高為0.87。將優(yōu)化后的基因SysOMT-9插入表達(dá)載體pGEX-2T，構(gòu)建獲得重組質(zhì)粒pGEX-SysOMT。將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21(DE3)，通過改變誘導(dǎo)溫度及誘導(dǎo)劑濃度，實(shí)現(xiàn)了SOMT-9可溶性表達(dá)。在此基礎(chǔ)上對其轉(zhuǎn)化條件進(jìn)行了優(yōu)化，其最佳轉(zhuǎn)化條件為：起始菌量OD600為10，轉(zhuǎn)化溫度為30℃，誘導(dǎo)劑IPTG用量為0.01 mmol/L，助溶劑DMSO質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1%，1%甘油，40 μmol/L的S-腺苷基甲硫氨酸和1 mmol/L槲皮素。在此條件下，重組菌在12 h內(nèi)，可將127 mg/L的槲皮素，轉(zhuǎn)化生成133 mg/L異鼠李素，摩爾轉(zhuǎn)化率為42%，是優(yōu)化前的7.8倍。

槲皮素；異鼠李素；O-甲基化酶；重組菌；轉(zhuǎn)化條件

異鼠李素是一種黃酮類化合物，廣泛存在于銀杏、沙棘、旱柳和枸杞等多種植物中[1]。異鼠李素是銀杏葉提取物(GBE)重要的功能性化合物，也是其質(zhì)量控制的標(biāo)志性化合物之一[2-3]。異鼠李素具有抑制脂質(zhì)過氧化反應(yīng)、擴(kuò)張冠狀動脈、抗血栓及抑制血小板聚集等藥理作用，因此可用于治療心血管系統(tǒng)的疾病[4-6]。近年研究還發(fā)現(xiàn)，異鼠李素也具有抗氧化、抗腫瘤、抗炎、抗病毒、抗過敏及調(diào)節(jié)免疫功能等多種生物活性[7-8]。

雖然異鼠李素在植物中分布廣泛，但其在植物中的含量較低，同時植物中含有多種黃酮類化合物成分復(fù)雜，為高純度異鼠李素的制備帶來了困難[1-3]。另一方面，異鼠李素屬脂溶性化合物，極性低，在提取過程需要使用高濃度的醇水溶液，這進(jìn)一步導(dǎo)致了提取成本的增加[9]。目前，高純度的異鼠李素價格昂貴。異鼠李素與槲皮素在結(jié)構(gòu)上具有相似性，通過對槲皮素3′位羥基進(jìn)行甲基化就可得到異鼠李素,且槲皮素可通過水解蘆丁大量制備，價格便宜。由此可見，通過對槲皮素3′位羥基進(jìn)行特異性甲基化生產(chǎn)異鼠李素在一定程度上具有可行性。

在植物體內(nèi)，黃酮類化合物O-甲基化反應(yīng)主要是由O-甲基化酶(O-methyltransferase, OMT)來完成，其中S-腺苷基甲硫氨酸(SAM)為反應(yīng)提供甲基，轉(zhuǎn)移到黃酮類化合物上，生成各種黃酮的甲基化衍生物[10]。植物來源的O-甲基化酶根據(jù)分子質(zhì)量和底物特異性可分為兩類[11]：1)分子質(zhì)量為23～25 ku的O-甲基化酶，主要參與木質(zhì)素的合成，其催化作用需要Mg2+的參與[12-13]；2)分子質(zhì)量為38～43 ku的O-甲基化酶，主要參與咖啡酸、黃酮及其他酚類化合物的甲基化，其催化活性不需要金屬離子存在[14]。最近又有一類分子質(zhì)量為29 ku的O-甲基化酶被報道，雖然該酶的分子質(zhì)量與第一類甲基化酶相似，但該酶主要參與黃酮類化合物的甲基化[15]。目前，一些植物來源O-甲基化酶基因被報道。如大豆(Glycinemax)來源的SOMT-9甲基化酶可對槲皮素的3′位羥基進(jìn)行甲基化[15]，生成異鼠李素；而SOMT-2甲基化酶只可對槲皮素的4′位羥基進(jìn)行甲基化[16]。擬南芥(Arabidopsisthaliana)來源的AtOMT1甲基化酶可對黃酮類化合物的3′位羥基進(jìn)行甲基化[17]。長春花(Catharanthusroseus)來源的CrOMT2甲基化酶可對黃酮類化合物的3′和5′位羥基進(jìn)行甲基化[14]。

雖然一些植物來源的O-甲基化酶已經(jīng)被克隆、表達(dá)及定性，但對于利用O-甲基化酶構(gòu)建重組菌，轉(zhuǎn)化槲皮素生產(chǎn)異鼠李素還沒有相關(guān)報道。筆者將對大豆來源的SOMT-9甲基化酶基因按照大腸桿菌的優(yōu)勢密碼子進(jìn)行全基因優(yōu)化，并對其可溶性表達(dá)進(jìn)行研究。在此基礎(chǔ)上對重組菌轉(zhuǎn)化槲皮素生產(chǎn)異鼠李素的關(guān)鍵因子進(jìn)行研究。

1 材料與方法

1.1 菌種及質(zhì)粒

pGEX-2T購于GE公司，重組質(zhì)粒pGEX-SysOMT由本次實(shí)驗(yàn)構(gòu)建。大腸桿菌JM109和BL21(DE3)本實(shí)驗(yàn)室保存。重組菌BL21-SysOMT是由重組質(zhì)粒pGEX-SysOMT轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21(DE3)而獲得，由本研究構(gòu)建。

1.2 酶和化學(xué)試劑

Ex-Taq DNA聚合酶、限制性內(nèi)切酶、T4 DNA連接酶、DNA標(biāo)準(zhǔn)分子量Marker均購自大連TaKaRa生物公司；實(shí)驗(yàn)所使用的酵母粉(yeast extract)和蛋白胨(Tryptone)購自O(shè)xoid公司；蛋白質(zhì)分子量標(biāo)準(zhǔn)購自Promega公司；瓊脂糖購自BBST公司；其他常規(guī)試劑均為國產(chǎn)分析純，購自大光明生物試劑有限公司。全基因合成由上海捷瑞生物工程有限公司合成，引物由上海生工生物工程有限公司合成。

1.3 基因操作

質(zhì)粒的提取，DNA片段的分離純化，感受態(tài)細(xì)胞的制備等均按照分子克隆技術(shù)[18]。優(yōu)勢密碼子采用在線分析軟件(http:∥gcua.schoedl.de/)進(jìn)行相關(guān)分析。

1.4 重組質(zhì)粒pGEX-SysOMT的構(gòu)建

以全基因優(yōu)化后的SysOMT-9基因序列為模板，設(shè)計(jì)引物如下：SysOMT-1：CCC GGATCCATGGCGAACGAAGAAGAAC，SysOMT-2：CCCGAATTCTTAGATGATACGA CGGCACAGAG，下劃線分別表示BamH I和EcoR I的限制性酶切位點(diǎn)。以全基因合成的序列(pUC-18-SysOMT-9)為模板，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR產(chǎn)物割膠回收后用BamH I/EcoR I雙酶切克隆到pGEX-2T，得到重組質(zhì)粒pGEX-SysOMT。

1.5 培養(yǎng)基

LB培養(yǎng)基：蛋白胨 10 g/L，酵母粉5 g/L，NaCl 10 g/L。培養(yǎng)時添加100 μg/mL氨芐青霉素(Amp)。

轉(zhuǎn)化培養(yǎng)基：M9培養(yǎng)基(NH4Cl 0.5 g/L，Na2HPO43 g/L，KH2PO41.5 g/L，1 mmol/L MgSO4，50 mmol/L CaCl2，1%葡萄糖)。培養(yǎng)時按照要求添加100 μg/mL氨芐青霉素、誘導(dǎo)劑和底物。

1.6 SOMT-9可溶性表達(dá)研究

挑重組菌BL21-SysOMT的單菌落到5 mL LB試管(100 μg/mL Amp)，37℃培養(yǎng)至OD600=0.8左右，添加不同濃度的誘導(dǎo)劑(0，0.01，0.05，0.1，0.2，0.5 mmol/L IPTG)在不同溫度下誘導(dǎo)(20，30，37℃)12 h，收集菌體，超聲波破碎細(xì)胞。以超聲破碎后的細(xì)胞樣品為全細(xì)胞蛋白，10 000 g離心后取上清的樣品為可溶性蛋白。通過SDS-PAGE分析SOMT-9在大腸桿菌中的可溶性表達(dá)情況。

1.7 SOMT-9酶活測定

100 μL反應(yīng)體系為：1 μmol/L槲皮素，5 mmol/L維生素C，1 mmol/L二硫蘇糖醇，150 μmol/L MgCl2，100 μmol/L的S-腺苷甲硫氨酸，50 mmol/L檸檬酸-磷酸氫二鈉(pH 7.0)，加入適量的酶液，35℃反應(yīng)1 h后加300 μL甲醇終止反應(yīng)，過0.22 μm的濾膜，HPLC分析其轉(zhuǎn)化產(chǎn)物[15]。

1.8 轉(zhuǎn)化條件的研究

挑重組菌BL21-SysOMT的單菌落到5 mL LB試管(100 μg/mL Amp)，37℃培養(yǎng)過夜，轉(zhuǎn)接至100 mL LB培養(yǎng)基(100 μg/mL Amp)中，37℃培養(yǎng)至OD600=0.8左右，添加0.1 mmol/L IPTG，30℃培養(yǎng)12 h，收集菌體待用。

1.8.1 起始菌量對轉(zhuǎn)化的影響

將收集的菌體按照OD600為1，2，3，4，5，10，15的起始菌量，利用M9培養(yǎng)基(20 mL)，添加1.5 mmol/L槲皮素，0.1 mmol/L誘導(dǎo)劑(IPTG)，30℃轉(zhuǎn)化24 h，轉(zhuǎn)化結(jié)束后取0.5 mL轉(zhuǎn)化液并添加0.5 mL甲醇，離心取上清進(jìn)行HPLC檢測。

1.8.2 轉(zhuǎn)化溫度對轉(zhuǎn)化的影響

將收集的菌體按照OD600為10的起始菌量，利用M9培養(yǎng)基(20 mL)，添加1.5 mmol/L槲皮素，0.1 mmol/L誘導(dǎo)劑(IPTG)，分別20，25，30，37，40℃轉(zhuǎn)化24 h，轉(zhuǎn)化結(jié)束后取0.5 mL轉(zhuǎn)化液并添加0.5 mL甲醇，離心取上清進(jìn)行HPLC檢測。

1.8.3 IPTG濃度對轉(zhuǎn)化的影響

將收集的菌體按照OD600為10的起始菌量，利用M9培養(yǎng)基(20 mL)，添加1.5 mmol/L槲皮素，0至0.2 mmol/L誘導(dǎo)劑(IPTG)，30℃轉(zhuǎn)化24 h，轉(zhuǎn)化結(jié)束后取0.5 mL轉(zhuǎn)化液并添加0.5 mL甲醇，離心取上清進(jìn)行HPLC檢測。

1.8.4 二甲基亞砜(DMSO)對轉(zhuǎn)化的影響

將收集的菌體按照OD600為10的起始菌量，利用M9培養(yǎng)基(20 mL)，添加1.5 mmol/L槲皮素，0.01 mmol/L誘導(dǎo)劑(IPTG)，并分別添加0.3%，0.5%，1%，1.5%，2%的DMSO，30℃轉(zhuǎn)化24 h，轉(zhuǎn)化結(jié)束后取0.5 mL轉(zhuǎn)化液并添加0.5 mL甲醇，離心取上清進(jìn)行HPLC檢測。

1.8.5 不同碳源及添加量對轉(zhuǎn)化的影響

將收集的菌體按照OD600為10的起始菌量，利用M9培養(yǎng)基(20 mL)，添加1.5 mmol/L槲皮素，0.01 mmol/L誘導(dǎo)劑(IPTG)，1% DMSO，并分別添加0.5，1，2，5，10 g/L葡萄糖或甘油，30℃轉(zhuǎn)化24 h，轉(zhuǎn)化結(jié)束后取0.5 mL轉(zhuǎn)化液并添加0.5 mL甲醇，離心取上清進(jìn)行HPLC檢測。

1.8.6 槲皮素及S-腺苷基甲硫氨酸對轉(zhuǎn)化的影響

將收集的菌體按照OD600為10的起始菌量，利用M9培養(yǎng)基(20 mL)，葡萄糖為碳源，分別添加0.5，0.8，1.0，1.2和1.5 mmol/L槲皮素，0.01 mmol/L誘導(dǎo)劑(IPTG)，30℃轉(zhuǎn)化24 h，轉(zhuǎn)化結(jié)束后取0.5 mL轉(zhuǎn)化液并添加0.5 mL甲醇，離心取上清進(jìn)行HPLC檢測。

將收集的菌體按照OD600為10的起始菌量，利用M9培養(yǎng)基(20 mL)，葡萄糖為碳源，添加1.5 mmol/L槲皮素，0.01 mmol/L IPTG，并分別添加0，20，40，60，80 μmol/L的S-腺苷基甲硫氨酸，30℃轉(zhuǎn)化24 h，轉(zhuǎn)化結(jié)束后取0.5 mL轉(zhuǎn)化液并添加0.5 mL甲醇，離心取上清進(jìn)行HPLC檢測。

1.9 HPLC測定槲皮素及異鼠李素條件

槲皮素及異鼠李素的測定采用HPLC法測定[3]，HPLC測定的條件為：Agilent 1260 Infinity；DAD檢測器檢測波長為368 nm，柱溫為40℃，流動相流速為0.8 mL/min[A(甲醇)∶B(1%甲酸水)=55∶45；20 min]。

2 結(jié)果與分析

2.1 大豆SOMT-9基因的分析、優(yōu)化及重組質(zhì)粒構(gòu)建

目前報道的能對槲皮素3′位羥基進(jìn)行特異性甲基化的O-甲基化酶主要有，Glycinemax的SOMT-9基因[15]、Oryzasativa的SOMT-9基因[19]及Mesembryanthemumcrystallinum的PFOMT基因[20]等。根據(jù)已經(jīng)報道的催化特性進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)Glycinemax來源的SOMT-9對槲皮素的催化能力最優(yōu)(表1)，米氏常數(shù)(Km)和最大反應(yīng)速率(Vmax)分別為72 μmol/L和300 nmol/(mg·min)，酶的催化性能越強(qiáng)，單位時間能生成的產(chǎn)物就越多。因此本研究以Glycinemax的O-甲基化酶SOMT-9為研究對象。Glycinemax的SOMT-9基因全長741，編碼246個氨基酸，分子質(zhì)量為27 ku，能對黃酮類化合物3′位羥基進(jìn)行甲基化，且該酶對Mg2+沒有依賴性。

表1 不同植物來源的O-甲基化酶催化特性比較Table 1 Comparison of the properties of O-methyltransferases from different plants

以SOMT-9基因?yàn)檠芯繉ο?，?gòu)建重組大腸桿菌催化槲皮素生成異鼠李素，需要實(shí)現(xiàn)SOMT-9基因的異源高效表達(dá)。植物來源的外源基因由于其密碼子偏好性等與大腸桿菌差異較大，難以獲得高效表達(dá)。因此本研究將對Glycinemax的SOMT-9基因的密碼子進(jìn)行優(yōu)化，并由生物技術(shù)公司進(jìn)行全基因合成，優(yōu)化后的基因序列與原基因序列的比對如圖1所示。原基因序列相對于大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)的密碼子適應(yīng)指數(shù)(CAI)0.59，而優(yōu)化后基因序列的CAI值為0.87。由此可見，優(yōu)化后基因的密碼子能有效適應(yīng)大腸桿菌的表達(dá)系統(tǒng)。

注：SOMT-9表示原基因；SysOMT表示優(yōu)化后的基因。圖1 優(yōu)化后的基因序列與原基因序列的比對Fig. 1 Comparison between the optimized gene and the original gene

另一方面，植物來源的基因在大腸桿菌中表達(dá)時，經(jīng)常形成包涵體而無法得到可溶性表達(dá)，因此本研究選擇pGEX-2T為表達(dá)載體，該載體在N端融合了谷胱甘肽轉(zhuǎn)移酶(GST)標(biāo)簽，GST標(biāo)簽有助于植物蛋白在大腸桿菌中的可溶性表達(dá)。以合成的序列為模板，擴(kuò)增獲得優(yōu)化后的O-甲基化酶基因SysOMT-9，并將其克隆到pGEX-2T獲得重組質(zhì)粒pGEX-SysOMT。

2.2SOMT-9的可溶性表達(dá)及酶活分析

將重組質(zhì)粒pGEX-SysOMT轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21(DE3)，獲得重組菌BL21-SysOMT。重組菌BL21-SysOMT在37℃、0.1 mmol/L IPTG誘導(dǎo)條件下實(shí)現(xiàn)了表達(dá)，因重組蛋白融合了GTS標(biāo)簽，所以其理論分子質(zhì)量為53 ku，但表達(dá)的蛋白基本都以包涵體形式存在，在上清中幾乎沒有可溶性表達(dá)的蛋白，如圖2所示。植物來源的外源基因在大腸桿菌中表達(dá)經(jīng)常形成包涵體，無法獲得可溶性表達(dá)。形成包涵體的主要因素有：1)蛋白在大腸桿菌中無法正確折疊；2)大腸桿菌缺少合適的分子伴侶；3)無法糖基化導(dǎo)致蛋白形成包涵體等[21]。目前解決大腸桿菌包涵體的主要方法是通過改變誘導(dǎo)溫度和IPTG的濃度使重組蛋白以合適的表達(dá)速度進(jìn)行表達(dá)，使其能有效地進(jìn)行折疊，從而達(dá)到目的蛋白的可溶性表達(dá)。研究發(fā)現(xiàn)在0.1 mmol/L IPTG誘導(dǎo)條件下，降低培養(yǎng)溫度能有效減少包涵體的形成。因?yàn)闇囟鹊慕档褪怪亟M蛋白的轉(zhuǎn)錄和翻譯速度降低，有助于重組蛋白的正確折疊。另一方面，雖然在20℃下誘導(dǎo)表達(dá)時幾乎沒有包涵體形成，但其整體表達(dá)量低于30℃誘導(dǎo)條件下表達(dá)量，造成可溶性蛋白的表達(dá)量也低于30℃誘導(dǎo)條件下表達(dá)量。

注：M表達(dá)蛋白Marker；1，3，5分別表示20，30和 37℃誘導(dǎo)的全細(xì)胞蛋白；2，4，6分別表示20，30和 37℃誘導(dǎo)的可溶性蛋白；箭頭表示重組SOMT-9。圖2 誘導(dǎo)溫度對SOMT-9可溶性表達(dá)的影響Fig. 2 Effect of temperature on the soluble expression of SOMT-9

隨后選擇30℃誘導(dǎo)條件，考察不同IPTG濃度下SOMT-9的可溶性表達(dá)，研究發(fā)現(xiàn)0.1 mmol/L IPTG誘導(dǎo)效果最佳，高濃度的IPTG非但不能提高可溶性蛋白量，而且影響重組菌整體蛋白的表達(dá)量，這可能與OMT蛋白對細(xì)胞的毒性有關(guān)(圖3)。誘導(dǎo)劑的添加量也能影響重組蛋白的翻譯速度，低濃度的誘導(dǎo)劑有助于重組蛋白的可溶性表達(dá)。

注：M表達(dá)蛋白Marker；1，3，5，7，9，11分別表示0，0.01，0.05， 0.1，0.2，0.5 mmol/L IPTG誘導(dǎo)的全細(xì)胞蛋白；2，4，6，8，10，12 分別表示0，0.01，0.05，0.1、0.2，0.5 mmol/L IPTG誘導(dǎo)的 可溶性蛋白；箭頭表示重組SOMT-9。圖3 IPTG對SOMT-9可溶性表達(dá)的影響Fig. 3 Effect of IPTG on the soluble expression of SOMT-9

取最佳誘導(dǎo)條件的重組菌，破細(xì)胞測定粗酶酶活，發(fā)現(xiàn)最佳誘導(dǎo)條件下重組酶的酶活為75 U/L，而攜帶空載質(zhì)粒的重組菌沒有測到任何酶活，由此可見重組酶實(shí)現(xiàn)了活性表達(dá)。由于O-甲基化酶的Vmax都比較低，SOMT-9的僅為300 nmol/(mg·min)，所以雖然實(shí)現(xiàn)了高效表達(dá)，但酶活仍然較低。進(jìn)一步提高酶活，需要對酶分子進(jìn)行改造，提高其催化效率。

2.3 轉(zhuǎn)化條件的確定

重組菌BL21-SysOMT轉(zhuǎn)化槲皮素生成異鼠李素采用分步轉(zhuǎn)化法，第一步主要是以LB為培養(yǎng)基，培養(yǎng)重組菌誘導(dǎo)產(chǎn)生重組酶SOMT-9；第二步是重組菌轉(zhuǎn)化槲皮素生成異鼠李素，以M9為基本培養(yǎng)基，通過條件優(yōu)化實(shí)現(xiàn)高效轉(zhuǎn)化。

2.3.1 起始菌量對轉(zhuǎn)化的影響

起始菌體量即轉(zhuǎn)化起始階段單位體積內(nèi)的重組菌BL21-SysOMT的量，對轉(zhuǎn)化槲皮素生成異鼠李素起重要作用。據(jù)報道，槲皮素等黃酮類化合物會影響大腸桿菌DNA拓?fù)洚悩?gòu)酶和解旋酶的活性[22]，而在前期研究中，筆者也發(fā)現(xiàn)槲皮素及生成的異鼠李素確實(shí)對大腸桿菌生長具有強(qiáng)烈的抑制作用。雖然在轉(zhuǎn)化培養(yǎng)中不以菌體量增加為目標(biāo)，但轉(zhuǎn)化過程中還是需要菌體提供重組酶、ATP及S-腺苷基甲硫氨酸等，因此一定量的起始菌量對轉(zhuǎn)化效率起重要作用。據(jù)此通過嘗試發(fā)現(xiàn)提高起始菌量有助于解決槲皮素的抑制作用。研究發(fā)現(xiàn)最佳起始菌量OD600為10左右，過低的菌量不利于重組菌轉(zhuǎn)化生成異鼠李素(圖4)。

圖4 起始菌量對轉(zhuǎn)化的影響Fig. 4 Effect of initial OD600 on bioconversion

2.3.2 轉(zhuǎn)化溫度及IPTG對轉(zhuǎn)化的影響

溫度對酶催化反應(yīng)和重組菌的生長是一個關(guān)鍵因素。在一定范圍內(nèi)酶的催化活性隨溫度升高而升高，但低溫有利于酶保持穩(wěn)定性。因此選擇合適的轉(zhuǎn)化溫度對異鼠李素的制備具有重要意義。研究發(fā)現(xiàn)，最佳轉(zhuǎn)化溫度為30℃，過低的轉(zhuǎn)化溫度對于產(chǎn)物的生成有抑制作用(圖5a)，分析可能的原因：1)低溫條件下槲皮素溶解度更低，更不利于槲皮素進(jìn)入細(xì)胞；2)低溫不利于重組酶SOMT-9進(jìn)行催化反應(yīng)。添加一定量的IPTG可持續(xù)誘導(dǎo)重組菌產(chǎn)生重組酶SOMT-9，可有效補(bǔ)充因失活而損失的重組酶，對重組菌保持催化能力非常重要，研究發(fā)現(xiàn)，最佳的誘導(dǎo)劑用量是0.01 mmol/L(圖5b)。

圖5 轉(zhuǎn)化溫度及IPTG濃度對轉(zhuǎn)化的影響Fig. 5 Effects of temperature and IPTG concentration on bioconversion

2.3.3 二甲基亞砜(DMSO)對轉(zhuǎn)化的影響

由于該轉(zhuǎn)化反應(yīng)中底物槲皮素和產(chǎn)物異鼠李素在水溶液中的溶解度很低。溶解度低一方面造成催化效率降低，另一方面因?yàn)殚纹に睾彤愂罄钏厝芙舛群艿停诎麅?nèi)積累會影響DNA拓?fù)洚悩?gòu)酶和解旋酶的活性，抑制大腸桿菌DNA的合成，進(jìn)而影響槲皮素轉(zhuǎn)化生成異鼠李素[22]。添加一定濃度的助溶劑DMSO，可提高底物和產(chǎn)物的溶解度，但高濃度的DMSO會抑制大腸桿菌的生長，DMSO添加量超過5%，會抑制大腸桿菌的生長速率。研究發(fā)現(xiàn)DMSO添加量為1%時，異鼠李素產(chǎn)量最高；繼續(xù)增加DMSO的量，則會嚴(yán)重抑制異鼠李素的產(chǎn)量(圖6)。

圖6 二甲基亞砜(DMSO)對轉(zhuǎn)化的影響Fig. 6 Effect of DMSO on bioconversion

2.3.4 不同碳源及添加量對轉(zhuǎn)化的影響

轉(zhuǎn)化過程中碳源主要為細(xì)胞生長提供能源及用于各種轉(zhuǎn)化所需因子的合成，如重組酶，ATP及S-腺苷基甲硫氨酸等。研究發(fā)現(xiàn)葡萄糖作為碳源時，最佳添加量為5%，異鼠李素的產(chǎn)量為54.6 mg/L；而甘油作為碳源時，最佳添加量為1%，異鼠李素的產(chǎn)量為81.1 mg/L。由圖7可見，添加低濃度的碳源時，甘油比葡萄糖更加有利于異鼠李素的生成；而添加高濃度的碳源時，葡萄糖的效果更佳。分析可能的原因，低濃度的甘油有助于重組菌減少酸的產(chǎn)生，更有利于菌體合成各種所需的轉(zhuǎn)化因子,從而提高了轉(zhuǎn)化效率；而添加高濃度的碳源時，甘油并不能有效減少重組菌產(chǎn)酸。

圖7 不同碳源及添加量對轉(zhuǎn)化的影響Fig. 7 Effects of carbon source and concentration on bioconversion

2.3.5 S-腺苷基甲硫氨酸及槲皮素對轉(zhuǎn)化的影響

S-腺苷基甲硫氨酸作催化反應(yīng)中甲基的供體，極大地影響著槲皮素的轉(zhuǎn)化效率，而大腸桿菌內(nèi)源的S-腺苷基甲硫氨酸生成量受多種因素調(diào)控，產(chǎn)量有限，可能會成為催化反應(yīng)進(jìn)行的限制因素。研究發(fā)現(xiàn)添加40 μmol/L的S-腺苷基甲硫氨酸時，催化效率最佳(圖8a)。大腸桿菌通過S-腺苷甲硫氨酸合成酶催化甲硫氨酸生成S-腺苷基甲硫氨酸，因此通過代謝工程提高甲硫氨酸的供應(yīng)量及提高S-腺苷甲硫氨酸合成酶的酶活，有望解除S-腺苷基甲硫氨酸對重組菌轉(zhuǎn)化槲皮素生成異鼠李素的限制作用。槲皮素是重組菌轉(zhuǎn)化的底物，高濃度的槲皮素對重組菌的生長有抑制作用，而低濃度的槲皮素不利于重組菌發(fā)揮最佳催化效果，研究發(fā)現(xiàn)異鼠李素的產(chǎn)量隨著底物添加量的增加而增加，當(dāng)?shù)孜锾砑恿窟_(dá)到1 mmol/L時，異鼠李素產(chǎn)量最高，達(dá)到72.7 mg/L(圖8b)。

圖8 槲皮素及S-腺苷基甲硫氨酸對轉(zhuǎn)化的影響Fig. 8 Effects of quercetin and s-adenosyl methionine on bioconversion

2.4 最優(yōu)條件下重組菌轉(zhuǎn)化槲皮素生成異鼠李素的研究

以最優(yōu)條件對重組菌轉(zhuǎn)化槲皮素生成異鼠李素的時間曲線進(jìn)行了研究。研究發(fā)現(xiàn)，重組菌前6 h內(nèi)的單位生產(chǎn)率為19 mg/(L·h)，轉(zhuǎn)化后期隨著產(chǎn)物量的增加，生產(chǎn)速率大幅下降，后6 h內(nèi)的單位生產(chǎn)率為3.2 mg/(L·h)，12 h后由于菌體轉(zhuǎn)化環(huán)境的改變，異鼠李素產(chǎn)量開始降低，這預(yù)示轉(zhuǎn)化結(jié)束的時間不能超過12 h(圖9、圖10)。重組菌在12 h內(nèi)，可將127 mg/L的槲皮素，轉(zhuǎn)化生成133 mg/L異鼠李素，產(chǎn)量是優(yōu)化前的7.8倍，摩爾轉(zhuǎn)化率為42%。這是目前報道的槲皮素轉(zhuǎn)化生成異鼠

李素的最高產(chǎn)量[15,17,19]。

圖9 重組菌轉(zhuǎn)化槲皮素生成異鼠李素的時間曲線Fig. 9 Time course of conversion quercetin toisorhamnetin by the recombinant strain

注：a表示標(biāo)樣；b、c、d、e、f分別表示0，2，6，12，24 h樣品。圖10 重組菌轉(zhuǎn)化槲皮素生成異鼠李素HPLC檢測圖Fig. 10 HPLC analysis of conversion quercetin to isorhamnetin by the recombinant strain

雖然本研究通過基因優(yōu)化和轉(zhuǎn)化條件的優(yōu)化，大幅提高了重組菌轉(zhuǎn)化槲皮素生成異鼠李素的產(chǎn)量，但該產(chǎn)量離工業(yè)化生產(chǎn)仍存在很大的差距。如何進(jìn)一步提高轉(zhuǎn)化率及異鼠李素的產(chǎn)量是后續(xù)研究的關(guān)鍵。目前制約重組菌轉(zhuǎn)化槲皮素生成異鼠李素的關(guān)鍵問題是：

1)甲基化酶的催化效率，目前報道性能最佳的酶是大豆來源的O-甲基化酶，但該酶的轉(zhuǎn)化效率還是遠(yuǎn)遠(yuǎn)不能滿足實(shí)際應(yīng)用需求，如何篩選性能更優(yōu)異的O-甲基化酶或?qū)υ撁高M(jìn)行分子改造是提高異鼠李素產(chǎn)量的關(guān)鍵；

2)槲皮素和異鼠李素對重組菌生長的抑制作用，雖然通過提高起始菌量在一定程度上減輕了這種生長抑制作用，但還無法從根本上解決該問題，有研究表明對黃酮苷元進(jìn)行糖基化能大幅度降低黃酮對重組菌的抑制作用[22]，而且通過糖基化有助于提高其溶解度[9]，從而有利于產(chǎn)物從胞內(nèi)分泌至胞外，通過對異鼠李素進(jìn)行糖基化生成其他高附加值的產(chǎn)物(如異鼠李素-3-O-葡萄糖[23])是解決抑制作用的有效方法。

3 結(jié) 論

以大豆來源的O-甲基化酶SOMT-9為研究對象，通過全基因密碼子優(yōu)化和誘導(dǎo)條件的優(yōu)化，在大腸桿菌中實(shí)現(xiàn)了SOMT-9可溶性高效表達(dá)。并通過對該重組菌催化槲皮素生成異鼠李素的轉(zhuǎn)化條件進(jìn)行優(yōu)化，使異鼠李素產(chǎn)量達(dá)到133 mg/L，是優(yōu)化前的7.8倍，摩爾轉(zhuǎn)化率為42%。這是目前報道的槲皮素轉(zhuǎn)化生成異鼠李素的最高產(chǎn)量。

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Optimization of transformation conditions and construction ofrecombinant bacteria for conversion quercetin to isorhamnetin

PEI Jianjun1, DONG Ping1△, XU Fei1, ZHAO Dongxia1, ZHAO Linguo1*,DING Gang2, XIAO Wei2

(1. College of Chemical Engineering, Nanjing Forestry University; Jiangsu Key Lab. of Biomass Based Green Fuels and Chemicals,Nanjing 210037, China;2. Jiangsu Kanion Pharmaceutical Co., Ltd., Lianyungang 222001, Jiangsu, China)

As a kind of important flavonoids, isorhamnetin exists widely in many plants such asGinkgobiloba,Seabuchthorn,SalizmatsudanaandMatrimonyvine. Isorhamnetin has many pharmacological activities. The hydroxyl group in quercetin can be methylated by O-methyltransferases from plants. Thus, the construction of bioconversion engineering bacteria that could catalyze the quercetin into isorhamnetin was considered as an effective approach to produce isorhamnetin. In order to improve the expression of O-methyltransferase SOMT-9, the gene of O-methyltransferaseSOMT-9 was designed, optimized and synthesized based on the synonymous condon bias ofEscherichiacoli, and the codon adaptation index (CAI) increased from 0.59 to 0.87. The recombinant plasmid pGEX-SysOMT was constructed by inserting the optimal gene into pGEX-2T. The recombinant O-methyltransferase SOMT-9 was over-expressed inE.coliBL21 (DE3) by different strategies such as changing induction temperature and concentration of isopropy-β-D-thiogalactoside (IPTG). Based on that, the optimal transformation conditions were determined. The optimal of initial OD600value was 10; the optimal concentration of IPTG was 0.01 mmol/L; the optimal concentration of dimethyl sulphoxide (DMSO) was 1%; the optimal carbon source was glycerol with 1% concentration; the optimal concentration of S-adenosyl methionine was 40 μmol/L; and the optimal concentration of the substrate, i.e., quercetin, was 1 mmol/L. The recombinant strain was at 30℃ for 12 h. Under the optimal transformation conditions, 127 mg/L quercetin was transformed into 133 mg/L isorhamnetin within 12 h by the recombinant strain and the molar conversion rate was 42%, which was eight times higher than that before the optimization.

quercetin; isorhamnetin; O-methyltransferase; recombinant bacteria; optimization

2016-07-26

2016-11-25

國家林業(yè)公益性行業(yè)科研專項(xiàng)(201404601)；江蘇省自然科學(xué)基金(BK20131423)；江蘇省“青藍(lán)工程”項(xiàng)目；江蘇高校優(yōu)勢學(xué)科建設(shè)工程資助項(xiàng)目(PAPD)。

裴建軍，男，副教授，研究方向?yàn)榇x工程。董萍為并列第一作者。通信作者：趙林果，男，教授。E-mail:lg.zhao@163.com

Q819

A

2096-1359(2017)03-0050-08