同步原位檢測CTC多重瘤標蛋白表達與染色體異倍體的意義及應用

由 磊，趙 燁，闞 秀，李一林，王東民，張愛群，王紅霞，劉 穎，王丹丹，林 平4,,0，鄭 直,4

·綜 述·

同步原位檢測CTC多重瘤標蛋白表達與染色體異倍體的意義及應用

由 磊1，趙 燁2，闞 秀3,4，李一林5，王東民4,6，張愛群7，王紅霞4,8，劉 穎9，王丹丹9，林 平4,9,10，鄭 直2,4

循環(huán)腫瘤細胞(circulating tumor cell, CTC)及播散腫瘤細胞(disseminated tumor cell, DTC)的可靠檢測主要取決于有效的細胞分離與鑒別，目前最為新穎的“差相富集-多重瘤標免疫熒光染色-染色體熒光原位雜交 (SE-iFISH)”技術平臺，首次將CTC/DTC的富集方法與后續(xù)的原位、同步檢測腫瘤細胞染色體異倍體的核型分析及多種腫瘤標志物的表型分析等進行有效整合，并成功應用于腫瘤細胞的基礎分析與臨床檢測。大量臨床實驗證明，獨特的SE-iFISH可以為分析CTC/DTC在腫瘤早期診斷、療效快速評估、腫瘤耐藥與復發(fā)的實時監(jiān)測等提供可靠的技術保障。該文闡述SE-iFISH在不同瘤種患者及人源腫瘤動物模型體內(nèi)的有效檢測方法，并鎖定具有不同臨床意義的不同表型與核型的CTC/DTC亞類細胞，為后續(xù)的腫瘤單細胞分析與實驗提供指導。

腫瘤轉(zhuǎn)移；染色體異倍體；腫瘤標志物；CTC亞類；文獻綜述

1 CTC概述

循環(huán)腫瘤細胞(circulating tumor cell, CTC)是從實體腫瘤脫落入外周循環(huán)血液的具有特殊性狀的腫瘤細胞，它與腫瘤的轉(zhuǎn)移、復發(fā)等有著極為密切的關系。播散腫瘤細胞(disseminated tumor cell, DTC)則是存在于患者體液中(如腫瘤患者骨轉(zhuǎn)移的骨髓、腦脊液、胸腹水等)的源自實體腫瘤的腫瘤細胞。與CTC相似，DTC也有著重要的臨床意義[1]。經(jīng)過多年研究，人們對CTC及DTC的臨床意義已經(jīng)有了較為清晰的認知。按治療前、中、后不同階段， CTC檢測的臨床應用及意義詳見圖1。其中，輔助診斷、療效快速評估(包括手術、放化療及靶向藥物療效)、預后判斷以及腫瘤耐藥與復發(fā)的實時監(jiān)測等尤為重要，為腫瘤患者個體化的精準醫(yī)療提供了有效的技術手段和有力保障。CTC 檢測目前已被公認為是最具代表性的“液體活檢”技術，其可提供的各種信息完整性與臨床意義遠非其它檢測所能比擬。

圖1 CTC檢測的意義

CTC與DTC的檢測手段相似，主要由分離與鑒別兩個主要環(huán)節(jié)組成，即“抓得著”與“看得見”兩個關鍵步驟。兩者相輔相成，缺一不可。分離與鑒別方法的有效性決定了CTC檢測的靈敏度與特異性。目前有關CTC檢測的各技術手段繁多，為了便于大家對此能有一個比較全面的了解，本文將目前國內(nèi)外較常見的CTC檢測手段，以及在病理科廣為開展的熒光原位雜交(fluorescence in situ hybridization, FISH)方法基礎上研發(fā)的iFISH技術，在CTC臨床檢測與基礎研究方面的應用及意義做一扼要介紹[2]。

2 CTC分離

目前，國內(nèi)外各種分離CTC的技術手段基本可歸納為3大類，即過濾法、捕獲法以及富集法，最近一種有別于常規(guī)陰性富集的新穎富集方法-差相富集技術(subtraction enrichment, SE)已被報道。

2.1 過濾法(細胞篩法) 該方法的技術原理基于一種假設，即CTC的大小與培養(yǎng)的腫瘤細胞近似，可達50 μm。過濾法使用孔徑為6.5～8 μm的細胞篩過濾，去除體積較小的白細胞，從而試圖達到分離較大的CTC目的；主要代表技術為iSET[3]，其最大優(yōu)點在于便捷。隨著近年來人們對CTC了解的不斷加深，發(fā)現(xiàn)很多CTC實際上與白細胞一樣大，有些甚至只有白細胞的一半或更小。這些小的CTC細胞即可常見于腫瘤患者[4-5]，同時也大量存在于腫瘤動物模型(包括人源腫瘤動物模型)體內(nèi)[5-6]。應用此方法在CTC分離過程中勢必會造成大量小細胞CTC的丟失[7]。在目前進行的多中心CTC篩查過程中發(fā)現(xiàn)，小細胞CTC在相當一些重要瘤種中占50%。鑒于CTC形成過程中的腫瘤細胞上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial-mesenchymal-transition, EMT)造成細胞體積變小[8]，且很多其它小細胞CTC的特殊臨床意義已經(jīng)越來越引起人們的極大關注[6,9]，因而對使用過濾法分離CTC及DTC過程中造成的大量小細胞丟失，甚至假陰性結(jié)果，應受到重視。

2.2 捕獲法(釣魚法) 該技術主要依賴腫瘤細胞表面各種標志物的表達(如上皮細胞標志物EpCAM)，利用偶聯(lián)在固相載體(如磁珠、芯片等)上的相應抗體或多肽對CTC/DTC進行直接捕獲；主要代表技術為Cell Search及微流體。該方法亦可被形象比喻為釣魚法，可以從血液中快速分離表達相應表面標志物的部分特定腫瘤細胞。

近年，國內(nèi)外一系列研究指出，腫瘤細胞表面標志物(如EpCAM)無論在細胞內(nèi)的分布或表達上均有極高的異質(zhì)性。EpCAM的完整蛋白或其胞內(nèi)的片段可分布于細胞膜上、溶酶體中[10]或細胞核內(nèi)。來源于不同組織的腫瘤細胞或同一標本內(nèi)的不同腫瘤細胞的EpCAM也呈高異質(zhì)性表達[10-11]。據(jù)文獻報道[12]，在134種檢測的實體瘤中，只有70%的腫瘤有EpCAM表達，而另外30%則檢測不到EpCAM陽性細胞。最近發(fā)表的利用流式細胞儀定量分析EpCAM表達的實驗結(jié)果與以往的報道一致。與乳腺癌細胞EpCAM的高表達相比，膀胱癌及惡性黑色素腫瘤細胞分別呈低表達及不表達(圖2A)[5]。利用免疫熒光染色方法進一步比較EpCAM在不同腫瘤細胞上的表達強度與定位的結(jié)果顯示，結(jié)腸癌細胞的細胞膜上可見EpCAM的高表達，而胰腺癌及非小細胞肺癌細胞則僅顯現(xiàn)與已往報道相一致的細胞核及細胞質(zhì)內(nèi)的異質(zhì)性弱表達[13]，而在細胞膜上不表達(圖2B)。EpCAM在胰腺癌及肺癌細胞膜上的極低或不表達可部分解釋為何基于抗EpCAM抗體的相關技術(如Cell Search等方法)不能有效檢測多種腫瘤的CTC。Gires等[10]指出，雖然部分腫瘤原發(fā)灶或轉(zhuǎn)移灶的細胞可表達極高的EpCAM，但其在CTC上的表達卻較低。這些不表達EpCAM的CTC亞類細胞具有特殊生物學及臨床意義，并與腫瘤轉(zhuǎn)移及EMT密切相關[14-15]。

A

B

結(jié)腸癌SW480 胰腺癌PANC-1 肺癌A549

圖2 EpCAM在不同腫瘤細胞上的異質(zhì)性表達 A.流式細胞儀定量分析：乳腺癌細胞的EpCAM呈高表達，而膀胱癌及惡性黑色素腫瘤細胞分別呈低表達及不表達；B.免疫熒光染色結(jié)果顯示，絕大部分結(jié)腸癌細胞的細胞膜上EpCAM呈強表達；胰腺癌及肺癌細胞的EpCAM表達較弱，且在細胞膜上無表達；個別胰腺癌細胞的細胞核可見EpCAM表達(綠色箭頭)，而大部分肺癌細胞的細胞核中EpCAM呈弱表達，但有些細胞不表達EpCAM (白色箭頭)

除EpCAM陰性CTC亞類細胞外，對EpCAM在某些腫瘤上的陽性亞型細胞的報道較多。然而在利用抗EpCAM抗體捕獲CTC的過程中，因抗體交聯(lián)了細胞表面EpCAM蛋白，從而導致細胞內(nèi)一系列信號傳導通路(如Wnt通路)的激活[16]，因而通過利用抗EpCAM抗體與細胞表面極為活躍的信號傳導誘發(fā)因子EpCAM相結(jié)合，進而捕獲的CTC或DTC已不再是自然狀態(tài)的細胞，故已不適于多種后續(xù)的功能性分析。最近，抗EpCAM抗體已被報道可誘導肺癌A549細胞增殖，并調(diào)控其基因表達[17]。其它依賴于腫瘤細胞表面標志物的CTC捕獲技術(如多肽納米磁珠)存在類似問題的可能性亦不可忽視。

2.3 富集法 人們熟知的陰性富集是此類方法的常見代表性技術。陰性富集通過低滲裂解紅細胞及使用偶聯(lián)抗CD45抗體的免疫磁珠去除白細胞以達到富集非血源性腫瘤細胞的目的。然而低滲裂解紅細胞同樣也會對CTC造成極大的損害與丟失[18]，獲取的CTC已不再適于腫瘤細胞的原代培養(yǎng)、功能性研究及RNA測序等。目前國內(nèi)常見的陰性富集法基本以3～4 mL血液為主，但較少的血樣量勢必造成CTC檢出數(shù)目的降低，從而對試圖利用CTC數(shù)目準確評估腫瘤治療前后的療效造成嚴重干擾，主要表現(xiàn)為很多腫瘤患者的CTC數(shù)目治療前后差異無顯著性。

2.4 SE法 該方法與陰性富集法相比，兩者間最大的區(qū)別在于SE使用了特殊的非血源性細胞分離介質(zhì)去除紅細胞，而不是通過低滲裂解溶破紅細胞。在6～8.5 mL血樣的白細胞去除過程中，多種抗白細胞抗體的組合群(而非單一抗CD45抗體)與特殊包被的磁珠相偶聯(lián)，從而確保了對白細胞的最大特異性去除，及對腫瘤細胞最小的非特異性黏附。相對于釣魚法，SE技術不依賴于腫瘤細胞表面標志物的表達，對不同瘤種的腫瘤細胞均具有較高且穩(wěn)定的回收率。通過SE法富集的保持自然狀態(tài)的CTC，無低滲損傷且未與抗體結(jié)合，仍保持生物學活性，是新型生物標本庫的重要組成。大量實驗已證明，這些富集得到的CTC及DTC可適于后續(xù)一系列的研究，包括CTC原代細胞培養(yǎng)及構(gòu)建腫瘤模型、CTC單細胞RNA與DNA分析(包括全基因組、全外顯子或基因突變[19])等。

2007年美國癌癥研究協(xié)會(AACR)大會上，SE原代技術被首次報道可以有效富集肺癌[20]及胰腺癌[21]患者體內(nèi)的CTC之后，不斷改進的SE技術已被廣泛應用于國內(nèi)外多中心的腫瘤動物模型[6]或不同瘤種腫瘤患者的CTC、DTC及癌栓的檢測與研究。檢測瘤種涵蓋了小細胞肺癌及非小細胞肺癌[5]、肝癌、食管癌、神經(jīng)膠質(zhì)瘤[5]、乳腺癌[22]、結(jié)直腸癌[23]、胃癌[24]等；標本來源包括血液、胸腹水、骨髓、尿液、腦脊液、淋巴穿刺等。待檢腫瘤細胞不受細胞大小及腫瘤標志物高度異質(zhì)性表達的限制[2,5]。2009年國際上首次報道應用SE技術可以在86%的肺癌復發(fā)患者中有效檢測到CTC[25]，且發(fā)現(xiàn)肺癌患者CTC數(shù)目與血液中角蛋白CK19 的裂解片段CYFRA21-1含量呈正相關[26]。

3 CTC鑒別

多年前人們曾經(jīng)嘗試使用非特異的HE染色法鑒別經(jīng)細胞篩過濾得到的部分大細胞CTC[3]，但后續(xù)實驗結(jié)果證實，此種根據(jù)核質(zhì)比例判別腫瘤細胞的方法不能有效區(qū)分血中的單核細胞與CTC，因而該方法未被接受為CTC檢查方法，近年來也不再有相關報道。目前，常規(guī)的CTC鑒別方法主要為核酸檢測及免疫染色。

3.1 核酸檢測 基于核酸檢測判別CTC的方法報道較多。PCR、RT-PCR或二代測序 等多種方法已被廣泛用于測定CTC的DNA或mRNA。美國Affymetrix公司發(fā)明的RNA原位雜交技術(RNAish)可在CTC細胞內(nèi)同時可視性檢測多種mRNA。迄今報道的各種核酸檢測相關技術較好地應用于確定了的CTC或DTC的相關功能性研究。然而作為CTC或DTC的鑒別手段，其待檢腫瘤相關基因的選擇(包括有效性與及特異性等)，以及對陽性或陰性檢測結(jié)果的客觀準確解釋還有待進一步驗證與完善。此外，對腫瘤細胞功能最終起主導作用的蛋白表達及相關的轉(zhuǎn)錄后蛋白修飾是不能用核酸法進行檢測的。

3.2 免疫染色 實體腫瘤細胞一般均為上皮來源，細胞內(nèi)通常表達角蛋白。目前，被廣泛應用的技術手段是借助免疫組化或免疫熒光法對來自實體瘤細胞中的CK進行染色[5]，從而達到鑒別CTC/DTC的目的。大量文獻報道[10,27]，在CTC形成的EMT階段中，與EpCAM相同，腫瘤細胞內(nèi)的CK也會降解，并導致腫瘤的浸潤性與轉(zhuǎn)移能力增加。CTC內(nèi)的CK降解不可避免地造成“看不見”的CTC假陰性，嚴重干擾CTC的準確檢測。因此，人們迫切需要尋找一種不依賴于CK表達及腫瘤類型與分期的替代技術，以有效鑒別各式各樣的高異質(zhì)性CTC及DTC。

EpCAM與CK目前在CTC/DTC的檢測過程中，主要是被用作腫瘤細胞的上皮標志物。但這兩種蛋白的高異質(zhì)性及在EMT過程中的降解等特征，造成了不容忽視的大量“抓不著”與“看不見”的假陰性結(jié)果，極大地限制了在CTC與DTC檢測過程中的應用。然而除上皮標志物的特性外，EpCAM及CK作為腫瘤細胞的生物學標志物已受到人們的密切關注。EpCAM的過量表達與前列腺癌的早期進展和轉(zhuǎn)移密切相關[28]，而胃癌腫瘤細胞EpCAM與CD44的持續(xù)高表達預示胃癌患者較高的10年生存率[29]。而在乳腺癌及結(jié)直腸患者中，隨著細胞內(nèi)EpCAM的降低或消失則與腫瘤的進展、出芽、遷移能力及遠端轉(zhuǎn)移的增強密切相關[14-15]。除此之外，CK18的一系列生物學功能近來也被廣泛報道。CK18在腫瘤細胞內(nèi)的轉(zhuǎn)錄后修飾與肝癌細胞的分化密切相關[30]，其蛋白水平的降低將促進乳腺癌、鼻咽癌、結(jié)腸癌的癌細胞遷移[31]及腫瘤進展[32]，而CK18蛋白的升高則與肺癌、腎細胞癌、口腔癌、食管鱗癌的低分化、高分期、腫瘤轉(zhuǎn)移及復發(fā)密切相關。血漿中CK18的半胱天冬酶(Caspase)的酶切片段是公認的腫瘤細胞凋亡的生物學標志物。作為其細胞內(nèi)的對應物，CTC/DTC內(nèi)完整的CK18蛋白具有同樣重要的生物學與臨床意義。但迄今為止，尚未有CTC/DTC內(nèi)CK18蛋白特異性表達及相關功能研究的報道。

3.3 染色體FISH技術 目前，國內(nèi)醫(yī)院病理科早已普及使用FISH技術在腫瘤組織標本上檢測腫瘤細胞。利用8號染色體著絲粒探針(centromere probe 8, CEP8)的FISH法檢測已被文獻廣泛報道于肺癌、食管癌、胰腺癌、胃癌、結(jié)直腸癌、膀胱癌和肝癌等腫瘤的診斷。然而由于血液樣本中的大量血源性白細胞、紅細胞、血漿蛋白及非血源性腫瘤細胞的內(nèi)在生物學特性，以往用于檢測組織標本的FISH法不適于直接檢測CTC及DTC。此外，與單一核酸檢測的局限性相同，常規(guī)的FISH法不能對腫瘤細胞內(nèi)起決定作用的各種瘤標蛋白的表達與修飾進行觀察與檢測。

3.4 iFISH法 鑒于對CTC/DTC原位同步進行染色體核型與瘤標蛋白表型分析具有極其重要的意義，將免疫熒光染色與FISH進行有效整合成為一種新穎的檢測方法，以便有效檢測非血源性異倍體CTC/DTC 的iFISH技術已被報道[5]。

iFISH的原理及如何有效同步檢測多重腫瘤標志物與異倍體詳見圖3。圖3A描述了對使用SE法富集的標本進行CD45染色，其中1個細胞為CD45陽性的血源性白細胞，剩余2個細胞為CD45陰性的非血源性細胞。瘤標免疫熒光染色顯示這兩個非血源性細胞中，細胞1瘤標表達陽性。而FISH檢測則顯示非血源性細胞1、2均為異倍體。iFISH合成圖像顯示，細胞1 為瘤標表達陽性的三倍體細胞，而細胞2則為瘤標表達陰性的三倍體細胞。單一抗體染色顯然不能檢測出瘤標陰性的CTC/DTC。而單一FISH檢測亦無法檢測出瘤標表達陰性的二倍體腫瘤細胞。相對于單一使用免疫熒光染色或FISH法，iFISH可將染色體及瘤標單一異常或雙異常的CTC有效檢測出來，從而極大地提高了檢測的靈敏性與特異性。圖3B展示了單瘤標 (如CK、EpCAM或HER-2)-iFISH (4色通道)。圖3C則顯示了在骨髓DTC 癌栓(≥2腫瘤細胞)上原位進行雙瘤標 (CK 及EpCAM)-iFISH(5色通道)檢測，以幫助人們了解兩種腫瘤標志物在CTC/DTC中的形態(tài)學分布、生物學功能及特殊臨床意義等方面是如何協(xié)調(diào)的。

圖3 iFISH原理 A.1個細胞為CD45陽性(紅色)的血源性白細胞， 2 個細胞為CD45陰性的非血源性細胞；其中，細胞1瘤標表達陽性(綠色)；而FISH檢測則顯示非血源性細胞1、2均為異常的染色體三體；iFISH合成圖像顯示，細胞1 為瘤標表達陽性的染色體3體細胞，而細胞2則為瘤標表達陰性的三體細胞；B.單瘤標-iFISH(4色通道)：CK、EpCAM或HER-2-iFISH;C.雙瘤標-iFISH (5色通道): 在骨髓DTC癌栓(≥2腫瘤細胞)上原位同步進行細胞核 (藍色)+ EpCAM (黃色) + CK18(綠色) + CD45(紅色) + CEP8(橙色)-iFISH檢測

有別于常規(guī)的組織樣本-FISH法，該iFISH可以理解為“細胞樣本-FISH”。iFISH 技術對鎖定的非血源性細胞(CD45染色陰性)進行染色體異倍體FISH及各種腫瘤標志物的免疫熒光染色檢測。不同于目前常規(guī)使用的CK單瘤標熒光染色鑒別CTC，iFISH可在FISH的基礎上，進一步提供可自由選擇(如CK、EpCAM、HER-2、vimentin、CD44V6、CD133、CA19-9、GFAP、EGFR Ⅷ、Methothelin等)與組合的雙色雙瘤標蛋白表達檢測(如CK+EpCAM、HER-2+EpCAM、vimentin+EpCAM等)。待檢的瘤標蛋白即可位于細胞核內(nèi)，也可位于細胞質(zhì)或細胞膜上。iFISH法為人們根據(jù)不同瘤種的CTC/DTC自由選取想要研究的任意染色體或任意瘤標提供了便利。這些擴大的信息量勢必會為提高CTC檢測的敏感度與特異性，以及為人們研究不同腫瘤標志物在CTC上如何協(xié)調(diào)發(fā)揮生物學功能提供極大的幫助。

根據(jù)同一CTC上的瘤標表達與染色體倍體不同，可將CTC進行亞類分型，如在CTC大小及CK18陽性或CK18陰性的前提下，每類可包含染色體單體、二倍體、三倍體、四倍體以及≥5倍體的亞類CTC細胞[5,24]。對每一不同亞類CTC細胞的腫瘤耐藥、藥敏、轉(zhuǎn)移與復發(fā)等不同臨床意義的闡明[24]，可為后續(xù)的CTC單細胞分析[19, 33]提供積極的指導意義。

此外，與常規(guī)的耗時較長(20 h)的FISH法相比，優(yōu)化的iFISH實驗操作(包括抗體染色)可在3～4 h內(nèi)完成，從而為臨床快速診斷提供了便利。

4 SE-iFISH用于檢測及分類CTC/DTC的意義與應用

長期以來，人們一直試圖從分離(抓得著)或是鑒別(看得見)兩個角度分別進行優(yōu)化，以期提高CTC/DTC檢測的敏感性。然而有效的CTC檢測方法是由密不可分的分離及鑒別兩個方面共同組成 (圖4)，兩者同等重要[2]。目前常規(guī)的CTC檢測方法對大量EpCAM和CK陰性的CTC/DTC 具有“抓不著”與“看不見”的內(nèi)在缺陷。經(jīng)過大量臨床樣本驗證過的SE-iFISH整合技術在CTC/DTC檢測過程中則已顯示一系列特殊優(yōu)勢[5,6,24]。

無論CTC/DTC是否具有很高的異質(zhì)性、CK及EpCAM蛋白是否降解或不表達以及CTC細胞大、小的巨大差異[4,7]，借助德國蔡司公司、德國MetaSystems公司、美國Cytelligen公司及國內(nèi)賽特生物公司聯(lián)合開發(fā)的 Metafer-iFISH CTC全自動掃描、圖像采集與分析系統(tǒng)，利用SE-iFISH可以從富集與鑒別兩方面對來源于血液、胸水、腹水、骨髓、尿液、腦脊液、淋巴穿刺等樣本中的各種實體腫瘤的CTC/DTC和癌栓進行快速有效的檢測、分類及數(shù)理統(tǒng)計，其中包括肺癌、肝癌、胃癌、乳腺癌、胰腺癌、食管癌、子宮頸癌、卵巢癌、結(jié)直腸癌、膀胱癌、腎細胞癌、神經(jīng)膠質(zhì)瘤、骨肉瘤、黑色素瘤、嗜鉻細胞瘤、甲狀旁腺腫瘤等。部分CTC檢測的陽性率結(jié)果詳見表1。

北京大學腫瘤醫(yī)院新近發(fā)表的臨床比對實驗顯示，CellSearch 在已確診的胃癌患者中的CTC(EpCAM+/CK+)檢出率為54.8%，而SE-iFISH在同一臨床實驗相同患者中的檢出率為90.5%(包括EpCAM+/CK+、EpCAM+/CK-、EpCAM-/CK+及 EpCAM-/CK-等不同類別的染色體異倍體 CTC)[24]。

圖4 不同的CTC捕獲與鑒別技術匯總

腫瘤類型n陽性率(%)乳腺癌7597.3肺癌20588.3肝癌31496.2食管癌5687.0骨肉瘤18100.0胃癌51888.6胰腺癌26280.6腎癌7686.3嗜鉻細胞瘤14100.0膠質(zhì)瘤34280.7

北京大學腫瘤醫(yī)院針對胃癌患者CTC亞類細胞進行的同位表型與核型分析發(fā)現(xiàn)，CK18陰性/8號染色體三體的CTC對順鉑具有內(nèi)源性耐藥的特征，而CK18陰性 /8號染色體四倍體或以上的CTC則具有繼發(fā)性耐藥的特性[24]。類似的結(jié)果在利用轉(zhuǎn)移性人源腫瘤動物模型 (metastatic patient derived xenograft, mPDX)的實驗中也得到證實[6]。實驗結(jié)果顯示，人們可以對這些經(jīng)過多次給藥(順鉑)的神經(jīng)內(nèi)分泌型胃癌肺轉(zhuǎn)移人源腫瘤動物模型小鼠進行數(shù)次采血，以實時動態(tài)監(jiān)測CTC的數(shù)目變化，從而進一步精確鎖定對順鉑敏感或耐受的CTC亞類細胞。

使用SE獲取肺癌患者CTC后，在相應寡細胞CTC上開展EGFR點突變檢測以評估靶向藥物易瑞沙治療的可靠性已被報道[19]。

綜上所述，不同于其它根據(jù)單一瘤標表達(如CK蛋白)或單純的核酸探針雜交方法檢測CTC，SE-iFISH可以幫助人們根據(jù)不同瘤種以及臨床或研究的具體不同需求，將自由選取的檢測腫瘤細胞內(nèi)各種生物標志物的免疫熒光染色與染色體FISH相結(jié)合，在進一步提高CTC檢測的敏感性與特異性的基礎上，還能獲取其它單一技術手段所不能提供的CTC及其亞類的重要臨床意義與生物信息，并進一步確定不同瘤種的CTC亞類與各種臨床指標相關性。目前，應用多種單一或雙瘤標組合-iFISH在不同瘤種間的大樣本、多中心的臨床實驗正在積極開展過程當中。這些臨床實驗將深入探討、分析各種CTC亞類細胞與腫瘤患者的預后、轉(zhuǎn)移、耐藥、復發(fā)的相關性，并以此指導下一步利用RNA及DNA單細胞測序技術對鎖定的CTC亞類單細胞與原發(fā)灶、轉(zhuǎn)移灶的腫瘤細胞進行深入比對。相關研究將會為人們尋找新的腫瘤標志物，加深對腫瘤形成、轉(zhuǎn)移、復發(fā)的認知，以及提高腫瘤的臨床治療療效提供更多的幫助。

[本文承蒙北京協(xié)和醫(yī)院呼吸科、胰腺外科、胸外科、消化內(nèi)科、骨科、病理科，中國醫(yī)學科學院腫瘤醫(yī)院腫瘤研究所，華西醫(yī)科大學腫瘤中心，北京大學第一醫(yī)院泌尿外科，北京大學泌尿研究所，北京大學腫瘤醫(yī)院胸外科，中國人民解放軍軍事醫(yī)學科學院，中國人民解放軍全軍腫瘤中心，清華大學北京清華長庚醫(yī)院，首都醫(yī)科大學北京天壇醫(yī)院神經(jīng)外科，首都醫(yī)科大學北京朝陽醫(yī)院胸外科，首都醫(yī)科大學腫瘤學院胸外科，天津醫(yī)科大學腫瘤醫(yī)院胰腺外科，上海瑞金醫(yī)院內(nèi)分泌科，上海華山醫(yī)院神經(jīng)外科，復旦大學藥學院與藥物基因組學研究中心，中美冠科生物技術公司(CrownBio)，賽特生物(Cytointelligen)等單位提供的幫助及技術支持；本文得到北京協(xié)和醫(yī)院肺癌中心李龍蕓教授及北京大學腫瘤醫(yī)院沈琳教授的大力支持，特此一并致謝！]

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時間：2017-3-16 14:23

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1北京協(xié)和醫(yī)院基本外科，北京 1007302中國醫(yī)學科學院基礎醫(yī)學研究所/北京協(xié)和醫(yī)學院基礎學院生物化學與分子生物學系及中心實驗室，北京 1000053北京大學人民醫(yī)院病理科，北京 1000444北京博雅醫(yī)學健康研究所，北京 1000055北京大學腫瘤醫(yī)院消化內(nèi)科，北京 1000446北京大學第一醫(yī)院乳腺癌中心，北京 1000447中國人民解放軍總醫(yī)院(301醫(yī)院)肝膽中心，北京 1008538上海第一人民醫(yī)院腫瘤中心，上海 2000809賽特生物醫(yī)藥科技有限公司，江蘇 泰州 22530010Cytelligen, San Diego, California, USA

由 磊，女，博士，副研究員 鄭 直，男，博士，教授，通訊作者。E-mail： zhizheng100@126.com

R 362

A

1001-7399(2017)03-0297-06

10.13315/j.cnki.cjcep.2017.03.014

接受日期：2017-01-12