同步原位檢測CTC多重瘤標(biāo)蛋白表達(dá)與染色體異倍體的意義及應(yīng)用

由 磊，趙 燁，闞 秀，李一林，王東民，張愛群，王紅霞，劉 穎，王丹丹，林 平4,,0，鄭 直,4

·綜 述·

同步原位檢測CTC多重瘤標(biāo)蛋白表達(dá)與染色體異倍體的意義及應(yīng)用

由 磊1，趙 燁2，闞 秀3,4，李一林5，王東民4,6，張愛群7，王紅霞4,8，劉 穎9，王丹丹9，林 平4,9,10，鄭 直2,4

循環(huán)腫瘤細(xì)胞(circulating tumor cell, CTC)及播散腫瘤細(xì)胞(disseminated tumor cell, DTC)的可靠檢測主要取決于有效的細(xì)胞分離與鑒別，目前最為新穎的“差相富集-多重瘤標(biāo)免疫熒光染色-染色體熒光原位雜交 (SE-iFISH)”技術(shù)平臺，首次將CTC/DTC的富集方法與后續(xù)的原位、同步檢測腫瘤細(xì)胞染色體異倍體的核型分析及多種腫瘤標(biāo)志物的表型分析等進(jìn)行有效整合，并成功應(yīng)用于腫瘤細(xì)胞的基礎(chǔ)分析與臨床檢測。大量臨床實(shí)驗(yàn)證明，獨(dú)特的SE-iFISH可以為分析CTC/DTC在腫瘤早期診斷、療效快速評估、腫瘤耐藥與復(fù)發(fā)的實(shí)時監(jiān)測等提供可靠的技術(shù)保障。該文闡述SE-iFISH在不同瘤種患者及人源腫瘤動物模型體內(nèi)的有效檢測方法，并鎖定具有不同臨床意義的不同表型與核型的CTC/DTC亞類細(xì)胞，為后續(xù)的腫瘤單細(xì)胞分析與實(shí)驗(yàn)提供指導(dǎo)。

腫瘤轉(zhuǎn)移；染色體異倍體；腫瘤標(biāo)志物；CTC亞類；文獻(xiàn)綜述

1 CTC概述

循環(huán)腫瘤細(xì)胞(circulating tumor cell, CTC)是從實(shí)體腫瘤脫落入外周循環(huán)血液的具有特殊性狀的腫瘤細(xì)胞，它與腫瘤的轉(zhuǎn)移、復(fù)發(fā)等有著極為密切的關(guān)系。播散腫瘤細(xì)胞(disseminated tumor cell, DTC)則是存在于患者體液中(如腫瘤患者骨轉(zhuǎn)移的骨髓、腦脊液、胸腹水等)的源自實(shí)體腫瘤的腫瘤細(xì)胞。與CTC相似，DTC也有著重要的臨床意義[1]。經(jīng)過多年研究，人們對CTC及DTC的臨床意義已經(jīng)有了較為清晰的認(rèn)知。按治療前、中、后不同階段， CTC檢測的臨床應(yīng)用及意義詳見圖1。其中，輔助診斷、療效快速評估(包括手術(shù)、放化療及靶向藥物療效)、預(yù)后判斷以及腫瘤耐藥與復(fù)發(fā)的實(shí)時監(jiān)測等尤為重要，為腫瘤患者個體化的精準(zhǔn)醫(yī)療提供了有效的技術(shù)手段和有力保障。CTC 檢測目前已被公認(rèn)為是最具代表性的“液體活檢”技術(shù)，其可提供的各種信息完整性與臨床意義遠(yuǎn)非其它檢測所能比擬。

圖1 CTC檢測的意義

CTC與DTC的檢測手段相似，主要由分離與鑒別兩個主要環(huán)節(jié)組成，即“抓得著”與“看得見”兩個關(guān)鍵步驟。兩者相輔相成，缺一不可。分離與鑒別方法的有效性決定了CTC檢測的靈敏度與特異性。目前有關(guān)CTC檢測的各技術(shù)手段繁多，為了便于大家對此能有一個比較全面的了解，本文將目前國內(nèi)外較常見的CTC檢測手段，以及在病理科廣為開展的熒光原位雜交(fluorescence in situ hybridization, FISH)方法基礎(chǔ)上研發(fā)的iFISH技術(shù)，在CTC臨床檢測與基礎(chǔ)研究方面的應(yīng)用及意義做一扼要介紹[2]。

2 CTC分離

目前，國內(nèi)外各種分離CTC的技術(shù)手段基本可歸納為3大類，即過濾法、捕獲法以及富集法，最近一種有別于常規(guī)陰性富集的新穎富集方法-差相富集技術(shù)(subtraction enrichment, SE)已被報道。

2.1 過濾法(細(xì)胞篩法) 該方法的技術(shù)原理基于一種假設(shè)，即CTC的大小與培養(yǎng)的腫瘤細(xì)胞近似，可達(dá)50 μm。過濾法使用孔徑為6.5～8 μm的細(xì)胞篩過濾，去除體積較小的白細(xì)胞，從而試圖達(dá)到分離較大的CTC目的；主要代表技術(shù)為iSET[3]，其最大優(yōu)點(diǎn)在于便捷。隨著近年來人們對CTC了解的不斷加深，發(fā)現(xiàn)很多CTC實(shí)際上與白細(xì)胞一樣大，有些甚至只有白細(xì)胞的一半或更小。這些小的CTC細(xì)胞即可常見于腫瘤患者[4-5]，同時也大量存在于腫瘤動物模型(包括人源腫瘤動物模型)體內(nèi)[5-6]。應(yīng)用此方法在CTC分離過程中勢必會造成大量小細(xì)胞CTC的丟失[7]。在目前進(jìn)行的多中心CTC篩查過程中發(fā)現(xiàn)，小細(xì)胞CTC在相當(dāng)一些重要瘤種中占50%。鑒于CTC形成過程中的腫瘤細(xì)胞上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial-mesenchymal-transition, EMT)造成細(xì)胞體積變小[8]，且很多其它小細(xì)胞CTC的特殊臨床意義已經(jīng)越來越引起人們的極大關(guān)注[6,9]，因而對使用過濾法分離CTC及DTC過程中造成的大量小細(xì)胞丟失，甚至假陰性結(jié)果，應(yīng)受到重視。

2.2 捕獲法(釣魚法) 該技術(shù)主要依賴腫瘤細(xì)胞表面各種標(biāo)志物的表達(dá)(如上皮細(xì)胞標(biāo)志物EpCAM)，利用偶聯(lián)在固相載體(如磁珠、芯片等)上的相應(yīng)抗體或多肽對CTC/DTC進(jìn)行直接捕獲；主要代表技術(shù)為Cell Search及微流體。該方法亦可被形象比喻為釣魚法，可以從血液中快速分離表達(dá)相應(yīng)表面標(biāo)志物的部分特定腫瘤細(xì)胞。

近年，國內(nèi)外一系列研究指出，腫瘤細(xì)胞表面標(biāo)志物(如EpCAM)無論在細(xì)胞內(nèi)的分布或表達(dá)上均有極高的異質(zhì)性。EpCAM的完整蛋白或其胞內(nèi)的片段可分布于細(xì)胞膜上、溶酶體中[10]或細(xì)胞核內(nèi)。來源于不同組織的腫瘤細(xì)胞或同一標(biāo)本內(nèi)的不同腫瘤細(xì)胞的EpCAM也呈高異質(zhì)性表達(dá)[10-11]。據(jù)文獻(xiàn)報道[12]，在134種檢測的實(shí)體瘤中，只有70%的腫瘤有EpCAM表達(dá)，而另外30%則檢測不到EpCAM陽性細(xì)胞。最近發(fā)表的利用流式細(xì)胞儀定量分析EpCAM表達(dá)的實(shí)驗(yàn)結(jié)果與以往的報道一致。與乳腺癌細(xì)胞EpCAM的高表達(dá)相比，膀胱癌及惡性黑色素腫瘤細(xì)胞分別呈低表達(dá)及不表達(dá)(圖2A)[5]。利用免疫熒光染色方法進(jìn)一步比較EpCAM在不同腫瘤細(xì)胞上的表達(dá)強(qiáng)度與定位的結(jié)果顯示，結(jié)腸癌細(xì)胞的細(xì)胞膜上可見EpCAM的高表達(dá)，而胰腺癌及非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞則僅顯現(xiàn)與已往報道相一致的細(xì)胞核及細(xì)胞質(zhì)內(nèi)的異質(zhì)性弱表達(dá)[13]，而在細(xì)胞膜上不表達(dá)(圖2B)。EpCAM在胰腺癌及肺癌細(xì)胞膜上的極低或不表達(dá)可部分解釋為何基于抗EpCAM抗體的相關(guān)技術(shù)(如Cell Search等方法)不能有效檢測多種腫瘤的CTC。Gires等[10]指出，雖然部分腫瘤原發(fā)灶或轉(zhuǎn)移灶的細(xì)胞可表達(dá)極高的EpCAM，但其在CTC上的表達(dá)卻較低。這些不表達(dá)EpCAM的CTC亞類細(xì)胞具有特殊生物學(xué)及臨床意義，并與腫瘤轉(zhuǎn)移及EMT密切相關(guān)[14-15]。

A

B

結(jié)腸癌SW480 胰腺癌PANC-1 肺癌A549

圖2 EpCAM在不同腫瘤細(xì)胞上的異質(zhì)性表達(dá) A.流式細(xì)胞儀定量分析：乳腺癌細(xì)胞的EpCAM呈高表達(dá)，而膀胱癌及惡性黑色素腫瘤細(xì)胞分別呈低表達(dá)及不表達(dá)；B.免疫熒光染色結(jié)果顯示，絕大部分結(jié)腸癌細(xì)胞的細(xì)胞膜上EpCAM呈強(qiáng)表達(dá)；胰腺癌及肺癌細(xì)胞的EpCAM表達(dá)較弱，且在細(xì)胞膜上無表達(dá)；個別胰腺癌細(xì)胞的細(xì)胞核可見EpCAM表達(dá)(綠色箭頭)，而大部分肺癌細(xì)胞的細(xì)胞核中EpCAM呈弱表達(dá)，但有些細(xì)胞不表達(dá)EpCAM (白色箭頭)

除EpCAM陰性CTC亞類細(xì)胞外，對EpCAM在某些腫瘤上的陽性亞型細(xì)胞的報道較多。然而在利用抗EpCAM抗體捕獲CTC的過程中，因抗體交聯(lián)了細(xì)胞表面EpCAM蛋白，從而導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)一系列信號傳導(dǎo)通路(如Wnt通路)的激活[16]，因而通過利用抗EpCAM抗體與細(xì)胞表面極為活躍的信號傳導(dǎo)誘發(fā)因子EpCAM相結(jié)合，進(jìn)而捕獲的CTC或DTC已不再是自然狀態(tài)的細(xì)胞，故已不適于多種后續(xù)的功能性分析。最近，抗EpCAM抗體已被報道可誘導(dǎo)肺癌A549細(xì)胞增殖，并調(diào)控其基因表達(dá)[17]。其它依賴于腫瘤細(xì)胞表面標(biāo)志物的CTC捕獲技術(shù)(如多肽納米磁珠)存在類似問題的可能性亦不可忽視。

2.3 富集法 人們熟知的陰性富集是此類方法的常見代表性技術(shù)。陰性富集通過低滲裂解紅細(xì)胞及使用偶聯(lián)抗CD45抗體的免疫磁珠去除白細(xì)胞以達(dá)到富集非血源性腫瘤細(xì)胞的目的。然而低滲裂解紅細(xì)胞同樣也會對CTC造成極大的損害與丟失[18]，獲取的CTC已不再適于腫瘤細(xì)胞的原代培養(yǎng)、功能性研究及RNA測序等。目前國內(nèi)常見的陰性富集法基本以3～4 mL血液為主，但較少的血樣量勢必造成CTC檢出數(shù)目的降低，從而對試圖利用CTC數(shù)目準(zhǔn)確評估腫瘤治療前后的療效造成嚴(yán)重干擾，主要表現(xiàn)為很多腫瘤患者的CTC數(shù)目治療前后差異無顯著性。

2.4 SE法 該方法與陰性富集法相比，兩者間最大的區(qū)別在于SE使用了特殊的非血源性細(xì)胞分離介質(zhì)去除紅細(xì)胞，而不是通過低滲裂解溶破紅細(xì)胞。在6～8.5 mL血樣的白細(xì)胞去除過程中，多種抗白細(xì)胞抗體的組合群(而非單一抗CD45抗體)與特殊包被的磁珠相偶聯(lián)，從而確保了對白細(xì)胞的最大特異性去除，及對腫瘤細(xì)胞最小的非特異性黏附。相對于釣魚法，SE技術(shù)不依賴于腫瘤細(xì)胞表面標(biāo)志物的表達(dá)，對不同瘤種的腫瘤細(xì)胞均具有較高且穩(wěn)定的回收率。通過SE法富集的保持自然狀態(tài)的CTC，無低滲損傷且未與抗體結(jié)合，仍保持生物學(xué)活性，是新型生物標(biāo)本庫的重要組成。大量實(shí)驗(yàn)已證明，這些富集得到的CTC及DTC可適于后續(xù)一系列的研究，包括CTC原代細(xì)胞培養(yǎng)及構(gòu)建腫瘤模型、CTC單細(xì)胞RNA與DNA分析(包括全基因組、全外顯子或基因突變[19])等。

2007年美國癌癥研究協(xié)會(AACR)大會上，SE原代技術(shù)被首次報道可以有效富集肺癌[20]及胰腺癌[21]患者體內(nèi)的CTC之后，不斷改進(jìn)的SE技術(shù)已被廣泛應(yīng)用于國內(nèi)外多中心的腫瘤動物模型[6]或不同瘤種腫瘤患者的CTC、DTC及癌栓的檢測與研究。檢測瘤種涵蓋了小細(xì)胞肺癌及非小細(xì)胞肺癌[5]、肝癌、食管癌、神經(jīng)膠質(zhì)瘤[5]、乳腺癌[22]、結(jié)直腸癌[23]、胃癌[24]等；標(biāo)本來源包括血液、胸腹水、骨髓、尿液、腦脊液、淋巴穿刺等。待檢腫瘤細(xì)胞不受細(xì)胞大小及腫瘤標(biāo)志物高度異質(zhì)性表達(dá)的限制[2,5]。2009年國際上首次報道應(yīng)用SE技術(shù)可以在86%的肺癌復(fù)發(fā)患者中有效檢測到CTC[25]，且發(fā)現(xiàn)肺癌患者CTC數(shù)目與血液中角蛋白CK19 的裂解片段CYFRA21-1含量呈正相關(guān)[26]。

3 CTC鑒別

多年前人們曾經(jīng)嘗試使用非特異的HE染色法鑒別經(jīng)細(xì)胞篩過濾得到的部分大細(xì)胞CTC[3]，但后續(xù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果證實(shí)，此種根據(jù)核質(zhì)比例判別腫瘤細(xì)胞的方法不能有效區(qū)分血中的單核細(xì)胞與CTC，因而該方法未被接受為CTC檢查方法，近年來也不再有相關(guān)報道。目前，常規(guī)的CTC鑒別方法主要為核酸檢測及免疫染色。

3.1 核酸檢測 基于核酸檢測判別CTC的方法報道較多。PCR、RT-PCR或二代測序 等多種方法已被廣泛用于測定CTC的DNA或mRNA。美國Affymetrix公司發(fā)明的RNA原位雜交技術(shù)(RNAish)可在CTC細(xì)胞內(nèi)同時可視性檢測多種mRNA。迄今報道的各種核酸檢測相關(guān)技術(shù)較好地應(yīng)用于確定了的CTC或DTC的相關(guān)功能性研究。然而作為CTC或DTC的鑒別手段，其待檢腫瘤相關(guān)基因的選擇(包括有效性與及特異性等)，以及對陽性或陰性檢測結(jié)果的客觀準(zhǔn)確解釋還有待進(jìn)一步驗(yàn)證與完善。此外，對腫瘤細(xì)胞功能最終起主導(dǎo)作用的蛋白表達(dá)及相關(guān)的轉(zhuǎn)錄后蛋白修飾是不能用核酸法進(jìn)行檢測的。

3.2 免疫染色 實(shí)體腫瘤細(xì)胞一般均為上皮來源，細(xì)胞內(nèi)通常表達(dá)角蛋白。目前，被廣泛應(yīng)用的技術(shù)手段是借助免疫組化或免疫熒光法對來自實(shí)體瘤細(xì)胞中的CK進(jìn)行染色[5]，從而達(dá)到鑒別CTC/DTC的目的。大量文獻(xiàn)報道[10,27]，在CTC形成的EMT階段中，與EpCAM相同，腫瘤細(xì)胞內(nèi)的CK也會降解，并導(dǎo)致腫瘤的浸潤性與轉(zhuǎn)移能力增加。CTC內(nèi)的CK降解不可避免地造成“看不見”的CTC假陰性，嚴(yán)重干擾CTC的準(zhǔn)確檢測。因此，人們迫切需要尋找一種不依賴于CK表達(dá)及腫瘤類型與分期的替代技術(shù)，以有效鑒別各式各樣的高異質(zhì)性CTC及DTC。

EpCAM與CK目前在CTC/DTC的檢測過程中，主要是被用作腫瘤細(xì)胞的上皮標(biāo)志物。但這兩種蛋白的高異質(zhì)性及在EMT過程中的降解等特征，造成了不容忽視的大量“抓不著”與“看不見”的假陰性結(jié)果，極大地限制了在CTC與DTC檢測過程中的應(yīng)用。然而除上皮標(biāo)志物的特性外，EpCAM及CK作為腫瘤細(xì)胞的生物學(xué)標(biāo)志物已受到人們的密切關(guān)注。EpCAM的過量表達(dá)與前列腺癌的早期進(jìn)展和轉(zhuǎn)移密切相關(guān)[28]，而胃癌腫瘤細(xì)胞EpCAM與CD44的持續(xù)高表達(dá)預(yù)示胃癌患者較高的10年生存率[29]。而在乳腺癌及結(jié)直腸患者中，隨著細(xì)胞內(nèi)EpCAM的降低或消失則與腫瘤的進(jìn)展、出芽、遷移能力及遠(yuǎn)端轉(zhuǎn)移的增強(qiáng)密切相關(guān)[14-15]。除此之外，CK18的一系列生物學(xué)功能近來也被廣泛報道。CK18在腫瘤細(xì)胞內(nèi)的轉(zhuǎn)錄后修飾與肝癌細(xì)胞的分化密切相關(guān)[30]，其蛋白水平的降低將促進(jìn)乳腺癌、鼻咽癌、結(jié)腸癌的癌細(xì)胞遷移[31]及腫瘤進(jìn)展[32]，而CK18蛋白的升高則與肺癌、腎細(xì)胞癌、口腔癌、食管鱗癌的低分化、高分期、腫瘤轉(zhuǎn)移及復(fù)發(fā)密切相關(guān)。血漿中CK18的半胱天冬酶(Caspase)的酶切片段是公認(rèn)的腫瘤細(xì)胞凋亡的生物學(xué)標(biāo)志物。作為其細(xì)胞內(nèi)的對應(yīng)物，CTC/DTC內(nèi)完整的CK18蛋白具有同樣重要的生物學(xué)與臨床意義。但迄今為止，尚未有CTC/DTC內(nèi)CK18蛋白特異性表達(dá)及相關(guān)功能研究的報道。

3.3 染色體FISH技術(shù) 目前，國內(nèi)醫(yī)院病理科早已普及使用FISH技術(shù)在腫瘤組織標(biāo)本上檢測腫瘤細(xì)胞。利用8號染色體著絲粒探針(centromere probe 8, CEP8)的FISH法檢測已被文獻(xiàn)廣泛報道于肺癌、食管癌、胰腺癌、胃癌、結(jié)直腸癌、膀胱癌和肝癌等腫瘤的診斷。然而由于血液樣本中的大量血源性白細(xì)胞、紅細(xì)胞、血漿蛋白及非血源性腫瘤細(xì)胞的內(nèi)在生物學(xué)特性，以往用于檢測組織標(biāo)本的FISH法不適于直接檢測CTC及DTC。此外，與單一核酸檢測的局限性相同，常規(guī)的FISH法不能對腫瘤細(xì)胞內(nèi)起決定作用的各種瘤標(biāo)蛋白的表達(dá)與修飾進(jìn)行觀察與檢測。

3.4 iFISH法 鑒于對CTC/DTC原位同步進(jìn)行染色體核型與瘤標(biāo)蛋白表型分析具有極其重要的意義，將免疫熒光染色與FISH進(jìn)行有效整合成為一種新穎的檢測方法，以便有效檢測非血源性異倍體CTC/DTC 的iFISH技術(shù)已被報道[5]。

iFISH的原理及如何有效同步檢測多重腫瘤標(biāo)志物與異倍體詳見圖3。圖3A描述了對使用SE法富集的標(biāo)本進(jìn)行CD45染色，其中1個細(xì)胞為CD45陽性的血源性白細(xì)胞，剩余2個細(xì)胞為CD45陰性的非血源性細(xì)胞。瘤標(biāo)免疫熒光染色顯示這兩個非血源性細(xì)胞中，細(xì)胞1瘤標(biāo)表達(dá)陽性。而FISH檢測則顯示非血源性細(xì)胞1、2均為異倍體。iFISH合成圖像顯示，細(xì)胞1 為瘤標(biāo)表達(dá)陽性的三倍體細(xì)胞，而細(xì)胞2則為瘤標(biāo)表達(dá)陰性的三倍體細(xì)胞。單一抗體染色顯然不能檢測出瘤標(biāo)陰性的CTC/DTC。而單一FISH檢測亦無法檢測出瘤標(biāo)表達(dá)陰性的二倍體腫瘤細(xì)胞。相對于單一使用免疫熒光染色或FISH法，iFISH可將染色體及瘤標(biāo)單一異?；螂p異常的CTC有效檢測出來，從而極大地提高了檢測的靈敏性與特異性。圖3B展示了單瘤標(biāo) (如CK、EpCAM或HER-2)-iFISH (4色通道)。圖3C則顯示了在骨髓DTC 癌栓(≥2腫瘤細(xì)胞)上原位進(jìn)行雙瘤標(biāo) (CK 及EpCAM)-iFISH(5色通道)檢測，以幫助人們了解兩種腫瘤標(biāo)志物在CTC/DTC中的形態(tài)學(xué)分布、生物學(xué)功能及特殊臨床意義等方面是如何協(xié)調(diào)的。

圖3 iFISH原理 A.1個細(xì)胞為CD45陽性(紅色)的血源性白細(xì)胞， 2 個細(xì)胞為CD45陰性的非血源性細(xì)胞；其中，細(xì)胞1瘤標(biāo)表達(dá)陽性(綠色)；而FISH檢測則顯示非血源性細(xì)胞1、2均為異常的染色體三體；iFISH合成圖像顯示，細(xì)胞1 為瘤標(biāo)表達(dá)陽性的染色體3體細(xì)胞，而細(xì)胞2則為瘤標(biāo)表達(dá)陰性的三體細(xì)胞；B.單瘤標(biāo)-iFISH(4色通道)：CK、EpCAM或HER-2-iFISH;C.雙瘤標(biāo)-iFISH (5色通道): 在骨髓DTC癌栓(≥2腫瘤細(xì)胞)上原位同步進(jìn)行細(xì)胞核 (藍(lán)色)+ EpCAM (黃色) + CK18(綠色) + CD45(紅色) + CEP8(橙色)-iFISH檢測

有別于常規(guī)的組織樣本-FISH法，該iFISH可以理解為“細(xì)胞樣本-FISH”。iFISH 技術(shù)對鎖定的非血源性細(xì)胞(CD45染色陰性)進(jìn)行染色體異倍體FISH及各種腫瘤標(biāo)志物的免疫熒光染色檢測。不同于目前常規(guī)使用的CK單瘤標(biāo)熒光染色鑒別CTC，iFISH可在FISH的基礎(chǔ)上，進(jìn)一步提供可自由選擇(如CK、EpCAM、HER-2、vimentin、CD44V6、CD133、CA19-9、GFAP、EGFR Ⅷ、Methothelin等)與組合的雙色雙瘤標(biāo)蛋白表達(dá)檢測(如CK+EpCAM、HER-2+EpCAM、vimentin+EpCAM等)。待檢的瘤標(biāo)蛋白即可位于細(xì)胞核內(nèi)，也可位于細(xì)胞質(zhì)或細(xì)胞膜上。iFISH法為人們根據(jù)不同瘤種的CTC/DTC自由選取想要研究的任意染色體或任意瘤標(biāo)提供了便利。這些擴(kuò)大的信息量勢必會為提高CTC檢測的敏感度與特異性，以及為人們研究不同腫瘤標(biāo)志物在CTC上如何協(xié)調(diào)發(fā)揮生物學(xué)功能提供極大的幫助。

根據(jù)同一CTC上的瘤標(biāo)表達(dá)與染色體倍體不同，可將CTC進(jìn)行亞類分型，如在CTC大小及CK18陽性或CK18陰性的前提下，每類可包含染色體單體、二倍體、三倍體、四倍體以及≥5倍體的亞類CTC細(xì)胞[5,24]。對每一不同亞類CTC細(xì)胞的腫瘤耐藥、藥敏、轉(zhuǎn)移與復(fù)發(fā)等不同臨床意義的闡明[24]，可為后續(xù)的CTC單細(xì)胞分析[19, 33]提供積極的指導(dǎo)意義。

此外，與常規(guī)的耗時較長(20 h)的FISH法相比，優(yōu)化的iFISH實(shí)驗(yàn)操作(包括抗體染色)可在3～4 h內(nèi)完成，從而為臨床快速診斷提供了便利。

4 SE-iFISH用于檢測及分類CTC/DTC的意義與應(yīng)用

長期以來，人們一直試圖從分離(抓得著)或是鑒別(看得見)兩個角度分別進(jìn)行優(yōu)化，以期提高CTC/DTC檢測的敏感性。然而有效的CTC檢測方法是由密不可分的分離及鑒別兩個方面共同組成 (圖4)，兩者同等重要[2]。目前常規(guī)的CTC檢測方法對大量EpCAM和CK陰性的CTC/DTC 具有“抓不著”與“看不見”的內(nèi)在缺陷。經(jīng)過大量臨床樣本驗(yàn)證過的SE-iFISH整合技術(shù)在CTC/DTC檢測過程中則已顯示一系列特殊優(yōu)勢[5,6,24]。

無論CTC/DTC是否具有很高的異質(zhì)性、CK及EpCAM蛋白是否降解或不表達(dá)以及CTC細(xì)胞大、小的巨大差異[4,7]，借助德國蔡司公司、德國MetaSystems公司、美國Cytelligen公司及國內(nèi)賽特生物公司聯(lián)合開發(fā)的 Metafer-iFISH CTC全自動掃描、圖像采集與分析系統(tǒng)，利用SE-iFISH可以從富集與鑒別兩方面對來源于血液、胸水、腹水、骨髓、尿液、腦脊液、淋巴穿刺等樣本中的各種實(shí)體腫瘤的CTC/DTC和癌栓進(jìn)行快速有效的檢測、分類及數(shù)理統(tǒng)計(jì)，其中包括肺癌、肝癌、胃癌、乳腺癌、胰腺癌、食管癌、子宮頸癌、卵巢癌、結(jié)直腸癌、膀胱癌、腎細(xì)胞癌、神經(jīng)膠質(zhì)瘤、骨肉瘤、黑色素瘤、嗜鉻細(xì)胞瘤、甲狀旁腺腫瘤等。部分CTC檢測的陽性率結(jié)果詳見表1。

北京大學(xué)腫瘤醫(yī)院新近發(fā)表的臨床比對實(shí)驗(yàn)顯示，CellSearch 在已確診的胃癌患者中的CTC(EpCAM+/CK+)檢出率為54.8%，而SE-iFISH在同一臨床實(shí)驗(yàn)相同患者中的檢出率為90.5%(包括EpCAM+/CK+、EpCAM+/CK-、EpCAM-/CK+及 EpCAM-/CK-等不同類別的染色體異倍體 CTC)[24]。

圖4 不同的CTC捕獲與鑒別技術(shù)匯總

腫瘤類型n陽性率(%)乳腺癌7597.3肺癌20588.3肝癌31496.2食管癌5687.0骨肉瘤18100.0胃癌51888.6胰腺癌26280.6腎癌7686.3嗜鉻細(xì)胞瘤14100.0膠質(zhì)瘤34280.7

北京大學(xué)腫瘤醫(yī)院針對胃癌患者CTC亞類細(xì)胞進(jìn)行的同位表型與核型分析發(fā)現(xiàn)，CK18陰性/8號染色體三體的CTC對順鉑具有內(nèi)源性耐藥的特征，而CK18陰性 /8號染色體四倍體或以上的CTC則具有繼發(fā)性耐藥的特性[24]。類似的結(jié)果在利用轉(zhuǎn)移性人源腫瘤動物模型 (metastatic patient derived xenograft, mPDX)的實(shí)驗(yàn)中也得到證實(shí)[6]。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，人們可以對這些經(jīng)過多次給藥(順鉑)的神經(jīng)內(nèi)分泌型胃癌肺轉(zhuǎn)移人源腫瘤動物模型小鼠進(jìn)行數(shù)次采血，以實(shí)時動態(tài)監(jiān)測CTC的數(shù)目變化，從而進(jìn)一步精確鎖定對順鉑敏感或耐受的CTC亞類細(xì)胞。

使用SE獲取肺癌患者CTC后，在相應(yīng)寡細(xì)胞CTC上開展EGFR點(diǎn)突變檢測以評估靶向藥物易瑞沙治療的可靠性已被報道[19]。

綜上所述，不同于其它根據(jù)單一瘤標(biāo)表達(dá)(如CK蛋白)或單純的核酸探針雜交方法檢測CTC，SE-iFISH可以幫助人們根據(jù)不同瘤種以及臨床或研究的具體不同需求，將自由選取的檢測腫瘤細(xì)胞內(nèi)各種生物標(biāo)志物的免疫熒光染色與染色體FISH相結(jié)合，在進(jìn)一步提高CTC檢測的敏感性與特異性的基礎(chǔ)上，還能獲取其它單一技術(shù)手段所不能提供的CTC及其亞類的重要臨床意義與生物信息，并進(jìn)一步確定不同瘤種的CTC亞類與各種臨床指標(biāo)相關(guān)性。目前，應(yīng)用多種單一或雙瘤標(biāo)組合-iFISH在不同瘤種間的大樣本、多中心的臨床實(shí)驗(yàn)正在積極開展過程當(dāng)中。這些臨床實(shí)驗(yàn)將深入探討、分析各種CTC亞類細(xì)胞與腫瘤患者的預(yù)后、轉(zhuǎn)移、耐藥、復(fù)發(fā)的相關(guān)性，并以此指導(dǎo)下一步利用RNA及DNA單細(xì)胞測序技術(shù)對鎖定的CTC亞類單細(xì)胞與原發(fā)灶、轉(zhuǎn)移灶的腫瘤細(xì)胞進(jìn)行深入比對。相關(guān)研究將會為人們尋找新的腫瘤標(biāo)志物，加深對腫瘤形成、轉(zhuǎn)移、復(fù)發(fā)的認(rèn)知，以及提高腫瘤的臨床治療療效提供更多的幫助。

[本文承蒙北京協(xié)和醫(yī)院呼吸科、胰腺外科、胸外科、消化內(nèi)科、骨科、病理科，中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院腫瘤醫(yī)院腫瘤研究所，華西醫(yī)科大學(xué)腫瘤中心，北京大學(xué)第一醫(yī)院泌尿外科，北京大學(xué)泌尿研究所，北京大學(xué)腫瘤醫(yī)院胸外科，中國人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院，中國人民解放軍全軍腫瘤中心，清華大學(xué)北京清華長庚醫(yī)院，首都醫(yī)科大學(xué)北京天壇醫(yī)院神經(jīng)外科，首都醫(yī)科大學(xué)北京朝陽醫(yī)院胸外科，首都醫(yī)科大學(xué)腫瘤學(xué)院胸外科，天津醫(yī)科大學(xué)腫瘤醫(yī)院胰腺外科，上海瑞金醫(yī)院內(nèi)分泌科，上海華山醫(yī)院神經(jīng)外科，復(fù)旦大學(xué)藥學(xué)院與藥物基因組學(xué)研究中心，中美冠科生物技術(shù)公司(CrownBio)，賽特生物(Cytointelligen)等單位提供的幫助及技術(shù)支持；本文得到北京協(xié)和醫(yī)院肺癌中心李龍蕓教授及北京大學(xué)腫瘤醫(yī)院沈琳教授的大力支持，特此一并致謝！]

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時間：2017-3-16 14:23

http://kns.cnki.net/kcms/detail/34.1073.R.20170316.1423.014.html

1北京協(xié)和醫(yī)院基本外科，北京 1007302中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所/北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)學(xué)院生物化學(xué)與分子生物學(xué)系及中心實(shí)驗(yàn)室，北京 1000053北京大學(xué)人民醫(yī)院病理科，北京 1000444北京博雅醫(yī)學(xué)健康研究所，北京 1000055北京大學(xué)腫瘤醫(yī)院消化內(nèi)科，北京 1000446北京大學(xué)第一醫(yī)院乳腺癌中心，北京 1000447中國人民解放軍總醫(yī)院(301醫(yī)院)肝膽中心，北京 1008538上海第一人民醫(yī)院腫瘤中心，上海 2000809賽特生物醫(yī)藥科技有限公司，江蘇 泰州 22530010Cytelligen, San Diego, California, USA

由 磊，女，博士，副研究員 鄭 直，男，博士，教授，通訊作者。E-mail： zhizheng100@126.com

R 362

A

1001-7399(2017)03-0297-06

10.13315/j.cnki.cjcep.2017.03.014

接受日期：2017-01-12