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    內(nèi)皮祖細(xì)胞攜帶KAI1/CD82基因?qū)θ吮茄拾┘?xì)胞裸鼠模型肺轉(zhuǎn)移的影響

    2017-06-05 15:06:03汪庚明徐洪波查從亮陳振東

    汪庚明,周 燕,孫 謙,徐洪波,查從亮,江 浩,項(xiàng) 平,陳振東

    內(nèi)皮祖細(xì)胞攜帶KAI1/CD82基因?qū)θ吮茄拾┘?xì)胞裸鼠模型肺轉(zhuǎn)移的影響

    汪庚明1,周 燕1,孫 謙1,徐洪波1,查從亮2,江 浩1,項(xiàng) 平3,陳振東4

    目的 探討KAI1/CD82基因在鼻咽癌侵襲轉(zhuǎn)移中的作用,分析轉(zhuǎn)染KAI1/CD82基因的內(nèi)皮祖細(xì)胞在鼻咽癌防治中的應(yīng)用價(jià)值。方法 應(yīng)用過(guò)表達(dá)KAI1/CD82基因的慢病毒轉(zhuǎn)染血管內(nèi)皮祖細(xì)胞,獲得高表達(dá)KAI1/CD82基因的穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞(KAI1/CD82-EPCs);構(gòu)建荷人鼻咽癌裸鼠移植瘤模型,通過(guò)裸鼠尾靜脈注入KAI1/CD82-EPCs;觀察KAI1/CD82-EPCs對(duì)裸鼠腋下移植瘤及其轉(zhuǎn)移灶的影響。結(jié)果 EPCs組、空白組和KAI1/CD82-EPCs組成瘤時(shí)間(天)分別為14.70±3.81、15.05±3.85、14.20±3.55,差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.771);EPCs組、空白組和KAI1/CD82-EPCs組移植瘤的重量(g)分別為1.388±0.204、1.487±0.223、1.485±0.234,差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.274);EPCs組、空白組和KAI1/CD82-EPCs組肺轉(zhuǎn)移灶生成率分別為55%、45%和10%,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.005),三組肺臟的轉(zhuǎn)移灶數(shù)目分別為34.27±5.35、38.44±9.63、17.50±3.54,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.007);注射KAI1/CD82-EPCs的實(shí)驗(yàn)組肺轉(zhuǎn)移灶KAI1/CD82呈陽(yáng)性,EPCs組和空白組肺轉(zhuǎn)移灶KAI1/CD82呈陰性。結(jié)論 轉(zhuǎn)染KAI1/CD82基因的EPCs對(duì)鼻咽癌裸鼠模型的肺轉(zhuǎn)移具有抑制作用。

    鼻咽腫瘤;轉(zhuǎn)移抑制基因;KAI1/CD82;血管內(nèi)皮祖細(xì)胞

    轉(zhuǎn)移是鼻咽癌治療失敗主要原因之一,在精確放療時(shí)代尤為突出。腫瘤細(xì)胞基因組是決定鼻咽癌轉(zhuǎn)移習(xí)性的根本因素,故探討轉(zhuǎn)移相關(guān)基因在鼻咽癌轉(zhuǎn)移中的作用顯得極為重要。內(nèi)皮祖細(xì)胞是一類能夠分化為成熟的血管內(nèi)皮細(xì)胞的前體細(xì)胞。臨床研究顯示內(nèi)皮祖細(xì)胞能夠定向歸巢于腫瘤組織[1],利用此特性可將內(nèi)皮祖細(xì)胞作為靶向運(yùn)輸至腫瘤組織的基因載體[2]。本實(shí)驗(yàn)擬建立荷人鼻咽癌細(xì)胞株裸鼠模型,構(gòu)建高表達(dá)KAI1/CD82基因的穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞(KAI1/CD82-EPCs),鼻咽癌荷瘤小鼠尾靜脈注射KAI1/CD82-EPCs,分析KAI1/CD82基因?qū)υ撃P娃D(zhuǎn)移能力的影響;從而推斷KAI1/CD82基因在鼻咽癌轉(zhuǎn)移過(guò)程中的作用和價(jià)值,為臨床預(yù)測(cè)鼻咽癌患者是否發(fā)生轉(zhuǎn)移、個(gè)體化治療以及應(yīng)用腫瘤轉(zhuǎn)移抑制基因進(jìn)行早期干預(yù)治療提供理論基礎(chǔ)。

    1 材料與方法

    1.1 材料 CNE-2Z人鼻咽癌細(xì)胞株購(gòu)自上海優(yōu)選公司;內(nèi)皮祖細(xì)胞在本課題組前期研究中獲得,經(jīng)形態(tài)學(xué)觀察、流式細(xì)胞儀表型鑒定及雙熒光染色鑒定;BALB/c-nu雌性裸鼠60只,限齡4~6周,購(gòu)自南京斯科瑞公司;過(guò)表達(dá)KAI1/CD82基因的慢病毒,購(gòu)自上海吉滿基因公司。

    1.2 主要試劑 RPMI 1640培養(yǎng)基購(gòu)自上海生工公司,凝聚胺(Polybrene)購(gòu)自上海博普公司,四甲基乙二胺(TEMED)購(gòu)自美國(guó)Sigma公司,KAI1/CD82抗體購(gòu)自美國(guó)BD公司。

    1.3 方法

    1.3.1 過(guò)表達(dá)KAI1/CD82基因的慢病毒轉(zhuǎn)染內(nèi)皮祖細(xì)胞 在進(jìn)行慢病毒轉(zhuǎn)染前18~24 h,將貼壁的內(nèi)皮祖細(xì)胞以每孔1×105鋪到24孔板中,使細(xì)胞在慢病毒轉(zhuǎn)染時(shí)的數(shù)量每孔約2×105。第2天用2 mL含6 μg/mL的Polybrene新鮮培養(yǎng)基替換原培養(yǎng)基,并根據(jù)預(yù)實(shí)驗(yàn)得到最適MOI值(50)作為標(biāo)準(zhǔn),加入對(duì)應(yīng)的病毒懸液,37 ℃孵育。4 h后加入2 mL新鮮培養(yǎng)基,繼續(xù)培養(yǎng)24 h,使用新鮮培養(yǎng)基替換原含病毒的培養(yǎng)基。繼續(xù)培養(yǎng)48 h后在熒光顯微鏡下觀察轉(zhuǎn)染效率,可見熒光表達(dá)明顯,72 h后顯示熒光表達(dá)率更高。在轉(zhuǎn)染3天后,使用嘌呤霉素(2.5 μg/μL)進(jìn)行篩選,在篩選6天后細(xì)胞轉(zhuǎn)染陽(yáng)性率可達(dá)90%以上。

    1.3.2 過(guò)表達(dá)KAI1/CD82基因的慢病毒轉(zhuǎn)染內(nèi)皮祖細(xì)胞后行Western blot檢測(cè) 根據(jù)KAI1/CD82基因的分子量配制5%濃縮膠和10%分離膠;將1×電泳緩沖液加入電泳池,取10 μL已煮過(guò)的蛋白,向泳道加入。將濃縮膠電壓設(shè)置為70 V,分離膠電壓設(shè)置為100 V,電泳,至溴酚藍(lán)達(dá)凝膠底邊緣處時(shí)停止,于凝膠下緣切角處做標(biāo)記,使用超純水沖洗,再在常溫下用考馬斯亮藍(lán)緩慢振蕩染色,2 h后用超純水清洗,再用脫色液浸泡凝膠,更換3~5次脫色液后蛋白條帶變清晰。轉(zhuǎn)膜:電泳結(jié)束后根據(jù)預(yù)染Marker的位置,裁取目的蛋白及內(nèi)參,并放轉(zhuǎn)膜緩沖液中浸泡。使用轉(zhuǎn)膜緩沖液浸泡剪好的硝酸纖維素膜(NC膜),約10 min,再由陰極到陽(yáng)極的順序放纖維墊-濾紙-凝膠-NC膜-濾紙-纖維墊,將電泳槽放在冰浴中,開始電泳,設(shè)置80 mA的恒流,時(shí)間110 min。封閉:取膜,并用5%脫脂牛奶浸潤(rùn)NC膜,并置搖床上緩慢搖晃約1 h。孵育一抗:用TBST稀釋KAI1/CD82一抗后將NC膜封閉于塑料袋中,并于37 ℃水浴箱1 h后4 ℃冰箱過(guò)夜,次日再置于37 ℃水浴箱中,經(jīng)40 min孵育,再置搖床搖晃20 min。經(jīng)4次TBST液洗膜后孵育二抗:按1 ∶3 000的比例用TBST液稀釋辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的二抗,P膜封閉于塑料袋中,置于水浴箱孵育,37 ℃ 30 min,搖晃30 min。將底物顯色劑滴與P膜上,在經(jīng)曝光、顯影、掃描后得所需蛋白質(zhì)條帶。用同樣的方法孵育內(nèi)參抗體并得到所需的蛋白質(zhì)條帶。

    1.3.3 構(gòu)建荷人鼻咽癌裸鼠移植瘤模型 將裸鼠用隨機(jī)數(shù)字法分成3組(A、B、C),每組20只,使用0.2 mL的CNE-2Z細(xì)胞株腋下注射預(yù)養(yǎng)的60只裸鼠。接種后,密切觀察裸鼠變化,記錄成瘤時(shí)間。在裸鼠接種腫瘤后一周,采用裸鼠尾靜脈直接注射法給予干預(yù)。具體分組如下:A組為EPCs組;B組為空白組;C組為KAI1/CD82-EPCs組。

    當(dāng)裸鼠出現(xiàn)反應(yīng)遲緩、進(jìn)食量下降、消瘦等情況后,以頸椎脫臼方式處死。處死裸鼠后,應(yīng)立即解剖,完整取其腋下移植瘤、肝臟及肺組織,并將移植瘤稱重記錄。同時(shí)將肺及肝組織取出后先放置Bouin液中固定,待2天后觀察肺部轉(zhuǎn)移灶已顯示為白色,而肝組織未見明顯轉(zhuǎn)移灶。顯微鏡下觀察肺組織轉(zhuǎn)移灶的大小,并同時(shí)記錄數(shù)目。將浸泡于Bouin液中的肺組織制成石蠟切片后,經(jīng)HE染色,顯微鏡下觀察,并對(duì)各組裸鼠肺轉(zhuǎn)移結(jié)節(jié)的數(shù)目進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。

    1.3.4 免疫組化 取KAI1/CD82-EPCs組裸鼠移植瘤肺轉(zhuǎn)移灶,行免疫組化SP法染色。所有標(biāo)本均經(jīng)10%中性福爾馬林固定,石蠟包埋,常規(guī)4 μm厚連續(xù)切片,分別行HE及免疫組化染色。以PBS代替一抗作陰性對(duì)照。陽(yáng)性染色為細(xì)胞質(zhì)和(或)細(xì)胞膜被染成棕黃色。采取二次計(jì)分法,具體如下:每張切片選擇5個(gè)高倍視野,首先陽(yáng)性細(xì)胞著色強(qiáng)度由強(qiáng)至弱分別計(jì)分,深棕黃色或棕褐色計(jì)為3分、棕黃色計(jì)為2分、淡黃色計(jì)為1分、無(wú)著色計(jì)為0分;再將陽(yáng)性細(xì)胞百分比計(jì)分,采用高倍視野隨機(jī)計(jì)數(shù)500個(gè)腫瘤細(xì)胞中的陽(yáng)性細(xì)胞所占比例,無(wú)陽(yáng)性細(xì)胞為0分,≤10%陽(yáng)性細(xì)胞為1分,11%~50%陽(yáng)性細(xì)胞為2分,51%~75%陽(yáng)性細(xì)胞為3分,>75%陽(yáng)性細(xì)胞為4分。以陽(yáng)性細(xì)胞著色強(qiáng)度和陽(yáng)性細(xì)胞百分?jǐn)?shù)得分的乘積作為結(jié)果判定標(biāo)準(zhǔn),其中≤1分為陰性,>1分則為陽(yáng)性。

    2 結(jié)果

    2.1 轉(zhuǎn)染KAI1/CD82基因的人臍血內(nèi)皮祖細(xì)胞及行Western blot檢測(cè)

    2.1.1 慢病毒轉(zhuǎn)染進(jìn)人臍血內(nèi)皮祖細(xì)胞后形態(tài)學(xué)觀察 將過(guò)表達(dá)KAI1/CD82基因的慢病毒轉(zhuǎn)染進(jìn)人臍血內(nèi)皮祖細(xì)胞后,在熒光顯微鏡下可見其攜帶的綠色熒光蛋白的內(nèi)皮祖細(xì)胞(圖1)。

    圖1 轉(zhuǎn)染KAI1/CD82基因的內(nèi)皮祖細(xì)胞

    2.1.2 過(guò)表達(dá)KAI1/CD82基因的慢病毒轉(zhuǎn)染內(nèi)皮祖細(xì)胞后Western blot檢測(cè)結(jié)果 應(yīng)用Western blot檢測(cè)內(nèi)皮祖細(xì)胞內(nèi)KAI1/CD82蛋白含量,同時(shí)以β-actin作為內(nèi)參,經(jīng)凝膠圖象處理系統(tǒng)分析后進(jìn)行比較,可見KAI1/CD82蛋白在KAI1/CD82-EPCs組中表達(dá)最高(圖2)。

    圖2 Western blot法檢測(cè)內(nèi)皮祖細(xì)胞內(nèi)KAI1/CD82的表達(dá)

    2.2 人鼻咽癌裸鼠移植瘤腋下成瘤時(shí)間及成瘤重量 裸鼠腋下接種人鼻咽癌CNE-2Z細(xì)胞株后均成瘤,成瘤率為100%。A、B、C組成瘤時(shí)間(天)分別為14.70±3.81、15.05±3.85、14.20±3.55,三組數(shù)據(jù)行方差分析,差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=0.261,P=0.771);A、B、C組移植瘤的重量(g)分別為1.388±0.204、1.487±0.223、1.485±0.234,三組間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=1.325,P=0.274,圖3)。

    2.4 鏡下觀察

    2.4.1 裸鼠腋下移植瘤HE染色 裸鼠腋下移植瘤HE染色切片在鏡下顯示為腫瘤細(xì)胞核大而深染,排列紊亂,核仁清晰,可見病理核分裂象(圖4)。

    2.4.2 裸鼠肺轉(zhuǎn)移灶HE染色 裸鼠肺轉(zhuǎn)移灶經(jīng)HE染色,在鏡下可見腫瘤細(xì)胞核大深染,且排列紊亂,核仁清晰,見病理核分裂象(圖5)。

    2.4.3 KAI1/CD82-EPCs組、EPCs組和空白組肺轉(zhuǎn)移灶免疫表型 取KAI1/CD82-EPCs組裸鼠移植瘤肺轉(zhuǎn)移灶,行免疫組化染色,結(jié)果顯示KAI1/CD82呈陽(yáng)性(圖6)。EPCs組和空白組肺轉(zhuǎn)移灶行免疫組化染色,結(jié)果顯示KAI1/CD82呈陰性。

    ③④⑤⑥

    圖3 裸鼠腋下移植瘤 圖4 裸鼠腋下移植瘤HE染色 圖5 裸鼠肺轉(zhuǎn)移灶HE染色 圖6 KAI1/CD82-EPCs組肺轉(zhuǎn)移灶KAI1/CD82呈陽(yáng)性,SP法

    3 討論

    腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移是臨床治療中的較大阻礙,鼻咽癌治療失敗的患者中絕大多數(shù)伴轉(zhuǎn)移,然而目前臨床應(yīng)對(duì)鼻咽癌轉(zhuǎn)移的有效方法仍十分匱乏。因此,分析如何降低進(jìn)而控制轉(zhuǎn)移的發(fā)生率是當(dāng)今探求鼻咽癌療效提升的關(guān)鍵。

    KAI1基因是1995年由Dong等[3]克隆的特異性腫瘤轉(zhuǎn)移抑制基因。由于KAI1編碼的產(chǎn)物與CD82完全相同,故將其并稱為KAI1/CD82基因。人類KAI1/CD82基因位于染色體11p11.2上,該基因全長(zhǎng)約80 kb,KAI1/CD82基因編碼蛋白由267氨基酸殘基組成[3],屬于跨膜四超蛋白家族成員之一。研究表明,KAI1/CD8基因表達(dá)下調(diào)或缺失與腫瘤轉(zhuǎn)移相關(guān)[4-6]。

    內(nèi)皮祖細(xì)胞又稱為成血管細(xì)胞,參與絕大多數(shù)的血管新生。最近也有不少臨床研究證實(shí)內(nèi)皮祖細(xì)胞在人類惡性腫瘤血管形成中的作用。內(nèi)皮祖細(xì)胞在細(xì)胞因子及相關(guān)受體的刺激下,向腫瘤組織特異性錨定、進(jìn)入腫瘤組織并參與腫瘤血管形成,這一特性為定位腫瘤病灶及發(fā)現(xiàn)治療物質(zhì)的新載體提供了一定的方向。

    基于腫瘤的歸巢性,作為靶向載體的內(nèi)皮祖細(xì)胞可為腫瘤治療提供藥物。內(nèi)皮祖細(xì)胞能促進(jìn)血管生成,其作為載體治療腫瘤,很多質(zhì)疑也就隨之而來(lái):注入內(nèi)皮祖細(xì)胞,它是否會(huì)促進(jìn)腫瘤生長(zhǎng)?該作用是否會(huì)超越它的治療作用?Muta等[7]在空白組注射Walker256腫瘤的小鼠,由于內(nèi)皮祖細(xì)胞促進(jìn)腫瘤血管生產(chǎn),腫瘤血液供應(yīng)增加導(dǎo)致腫瘤進(jìn)展。隨后轉(zhuǎn)染IL-12-EPCs注射同樣的小鼠模型,由于其分泌的IL-12強(qiáng)烈地激活NK細(xì)胞和TC細(xì)胞,扼制腫瘤的發(fā)展,抵消內(nèi)皮祖細(xì)胞的促進(jìn)腫瘤作用。因此,研究者認(rèn)為轉(zhuǎn)染基因的內(nèi)皮祖細(xì)胞可作為一種腫瘤特異性藥物傳遞系統(tǒng)。使用血管內(nèi)皮祖細(xì)胞作為基因治療的載體將成為腫瘤一種新的療法。

    很多文獻(xiàn)報(bào)道內(nèi)皮祖細(xì)胞可作為腫瘤的靶向治療中的生物基因載體[8-11],并且選用靜脈注入的方式,藥物可以準(zhǔn)確快速地到達(dá)腫瘤區(qū)。由于血液循環(huán)過(guò)程損耗量少,局部藥物濃度高,從而達(dá)到較好地控制腫瘤的效果。

    本實(shí)驗(yàn)中構(gòu)建高表達(dá)KAI1/CD82-EPCs組,注入鼻咽癌裸鼠尾靜脈,觀察KAI1/CD82-EPCs組顯著影響人鼻咽癌裸鼠移植瘤肺轉(zhuǎn)移灶的生成率,其肺轉(zhuǎn)移率僅為10%,顯著低于EPCs組和空白組;KAI1/CD82-EPCs組裸鼠移植瘤肺轉(zhuǎn)移灶免疫組化標(biāo)記KAI1/CD82呈陽(yáng)性;在EPCs和空白組中,KAI1/CD82呈陰性。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示內(nèi)皮祖細(xì)胞可作為基因的有效載體趨向腫瘤區(qū),并發(fā)揮抑制腫瘤轉(zhuǎn)移的重要作用,攜帶KAI1/CD82基因的EPCs有望成為鼻咽癌治療的新方法。

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    Effect of KAI1/CD82-expressing EPCs on lung metastasis of a xenograft mouse model of human nasopharyngeal carcinoma

    WANG Geng-ming1, ZHOU Yan1, SUN Qian1, XU Hong-bo1, ZHA Cong-liang2, JIANG Hao1, XIANG Ping3, CHEN Zhen-dong4

    (1DepartmentofRadiotherapy,3CentralLaboratory,theFirstAffiliatedHospitalofBengbuMedicalCollege,Bengbu233000,China;2DepartmentofRadiotherapy,TonglingPeople’sHospital,Tongling244000,China;4DepartmentofOncology,theSecondAffiliatedHospitalofAnhuiMedicalUniversity,Hefei230601,China)

    Purpose To clarify the role of KAI1/CD82 in metastasis of nasopharyngeal carcinom and to evaluate the clinical efficacy of KAI1/CD82-expressing EPCs in the prevention of nasopharyngeal carcinoma. Method Umbilical vein-derived EPCs were infected with KAI1/CD82-expressing lenti-virus to get a KAI1/CD82-overexpressing EPC cell line (KAI1/CD82-EPCs). A xenograft mouse model of human nasopharyngeal carcinoma was established, and KAI1/CD82-EPCs were injected through the tail vein. The effect of the KAI1/CD82-EPCs on growth and metastasis of the xenograft was observed. Results Time required for tumor formation was 14.70±3.81, 15.05±3.85, 14.20±3.55 days respectively for the EPCs, EPCs-NC, and KAI1/CD82-EPCs groups, with no significant difference among the three groups (P=0.771). Weight of the xenograft was (1.388±0.204) g, (1.487±0.223) g, (1.485±0.234) g respectively for the EPCs, EPCs-NC, and KAI1/CD82-EPCs groups, with no significant difference (P=0.274). Rate of lung metastasis was 55%, 45% and 10% for the EPCs, EPCs-NC, and KAI1/CD82-EPC groups, and the difference was significant (P=0.005). Number of metastatic lesions was 34.27 ± 5.35, 38.44 ± 9.63, 17.50 ± 3.54 for the three groups, and the difference was also significant (P=0.007). Immunohistochemistry indicated positive KAI1/CD82 expression in metastatic lesion of the KAI1/CD82-EPCs group, but no KAI1/CD82 expression in the EPCs group or EPCs-NC group. Conclusion KAI1/CD82-expressing EPCs inhibits lung metastasis of the xenograft mouse model of human nasopharyngeal carcinoma.

    nasopharyngeal neoplasm;metastasis suppressor gene; KAI1/CD82; endothelial progenitor cell

    時(shí)間:2017-3-16 14:23

    http://kns.cnki.net/kcms/detail/34.1073.R.20170316.1423.012.html

    安徽省高等學(xué)校自然科學(xué)研究(KJ2015B091by)、蚌埠醫(yī)學(xué)院院級(jí)科研課題(BY0925)

    1蚌埠醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院腫瘤放療科、3中心試驗(yàn)室,蚌埠 233000

    2銅陵市人民醫(yī)院放療科,銅陵 244000

    汪庚明,女,博士,主治醫(yī)師。E-mail: lansefeidian777@163.com

    R 739.62

    A

    1001-7399(2017)03-0287-05

    10.13315/j.cnki.cjcep.2017.03.012

    接受日期:2017-01-18

    4安徽醫(yī)科大學(xué)第二附屬醫(yī)院腫瘤科,合肥 230601

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