miR-31通過結合Dock180抑制乳腺癌細胞侵襲

鄭書賢，孫雪梅，王瑞鴿，史立宏，張寶剛

miR-31通過結合Dock180抑制乳腺癌細胞侵襲

鄭書賢1，孫雪梅1，王瑞鴿1，史立宏2，張寶剛1

目的 探討miR-31表達與Dock180表達的相關性，以及miR-31通過結合Dock180對乳腺癌細胞侵襲能力的影響。方法 通過脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染技術，將miR-31轉(zhuǎn)染乳腺癌細胞系過表達miR-31；采用熒光酶報告基因檢測miR-31與Dock180的結合方式；應用Western blot法檢測miR-31表達不同的乳腺癌細胞中Dock180和其他相關蛋白的表達；RT-PCR檢測miR-31與Dock180 mRNA的關系；基質(zhì)膠侵襲實驗檢測miR-31過表達時，乳腺癌細胞的侵襲能力。結果 在乳腺癌細胞中，miR-31靶向結合Dock180，且Dock180蛋白表達與miR-31表達呈負相關，Dock180下調(diào)和miR-31上調(diào)削弱了乳腺癌的侵襲能力。結論 miR-31可通過結合Dock180抑制乳腺癌細胞的侵襲。

乳腺腫瘤；miR-31；Dock180；侵襲

乳腺癌是女性最常見的惡性腫瘤，其發(fā)病率與病死率逐年上升，侵襲和轉(zhuǎn)移是乳腺癌患者死亡的主要原因[1]。Dock180是作為信號銜接蛋白(Crk)下游因子為人們熟知，相對分子質(zhì)量約1.80×105。Dock180作為小GTP酶Rho家族的鳥嘌呤核苷交換因子(guanine-nucleotide exchange factor, GEF)，是調(diào)節(jié)肌動蛋白細胞骨架及細胞形態(tài)的重要分子[2]。Li等[3]的研究表明，Dock180參與乳腺癌的侵襲。作者推測有microRNA(miRNA)參與調(diào)節(jié)Dock180的表達，通過Target Scan靶點預測工具(http://www.targetscan.org/)搜索，發(fā)現(xiàn)Dock180基因為miR-31潛在的靶基因。近來，大量研究表明[4-8]，miR-31可以抑制乳腺癌的侵襲[5]和轉(zhuǎn)移[6]，促進凋亡[7]。因此，miR-31在乳腺癌中異常低表達，有望成為乳腺癌篩查、診斷乃至治療中的新靶點。因此，為進一步明確miR-31和Dock180的關系，需對兩者進行深入分析。本文旨在探討miR-31是否參與調(diào)節(jié)Dock180的表達，且miR-31和Dock180結合對乳腺癌侵襲的影響。

1 材料與方法

1.1 材料 人類乳腺癌細胞系MDA-MB-231、MDA-MB-435、MCF-7購自American Type Culture Collection(ATCC)公司；培養(yǎng)基及相關試劑購自Hyclone公司；細胞裂解液、胰酶等購自北京碧云天公司；兔抗人Dock180單抗購自北京中杉金橋公司；侵襲實驗所用的Transwell小室購自Corning公司；Matrigel購自BD公司。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養(yǎng)和轉(zhuǎn)染 MDA-MB-231、MDA-MB-435、MCF-7細胞置于37 ℃ 5%CO2的濕潤環(huán)境中常規(guī)培養(yǎng)。MDA-MB-231(2×105個)細胞種植于4個35 mm培養(yǎng)皿內(nèi)，24 h后根據(jù)試劑盒說明書將miR-31陰性對照、miR-31、miR-31抑制劑、miR-31抑制劑陰性對照的Lipofectamine 2000(Invitrogen, Carlsbad, CA, USA))轉(zhuǎn)染MDA-MB-231。轉(zhuǎn)染后分別命名為MDA-MB-231/NC、MDA-MB-231/miR-31、miR-31 inhibitor、inhibitor NC，于37 ℃、5%CO2環(huán)境下培養(yǎng)，以供后續(xù)實驗使用。

1.2.2 體外癌細胞侵襲實驗 按照文獻[5]方法進Transwell小室侵襲實驗。將轉(zhuǎn)染成功的MDA-MB-231/miR-31、MDA-MB-231/NC分別用胰蛋白酶消化，1×105個細胞種于Transwell小室的上室，預涂層為20 μg Matrigel(基質(zhì)膠)，下室為10%胎牛血清作為化學引誘物。37℃、5%CO2溫箱孵育24 h后取出培養(yǎng)板，棄去Transwell小室內(nèi)培養(yǎng)基，用棉簽擦掉上室的基質(zhì)膠和非侵襲細胞，下室用甲醇固定10 min后，常規(guī)HE染色，400倍光鏡下觀察5個高倍鏡視野，計數(shù)Transwell小室下室的細胞數(shù)即為穿透人工基膜的細胞數(shù)，每個實驗重復3次，取平均數(shù)作為實驗結果。

1.2.3 Western blot法 使用Western blot法檢測轉(zhuǎn)染后細胞的Dock180蛋白表達量，β-actin作為內(nèi)參。轉(zhuǎn)染后的MDA-MB-231/NC、MDA-MB-231/mR-31、miR-31 inhibitor、inhibitor NC細胞常規(guī)培養(yǎng)72 h提取總蛋白，蛋白變性后經(jīng)SDS-PAGE凝膠電泳、轉(zhuǎn)膜、封閉、一抗孵育過夜、二抗孵育后顯影得到Dock180的蛋白表達情況。實驗重復3次，結果用Image J軟件處理，以第一個數(shù)值作為基數(shù)，其他數(shù)值與第一個數(shù)值的比值為相對密度。

1.2.4 RT-PCR法 用Trizol抽提細胞總RNA，5 ng總RNA為模板，在引物的指引下以dNTP為原料經(jīng)過變性、復性、延伸35個循環(huán)合成cDNA，Dock180的表達水平應用Quantity One 4.62定量分析。

1.2.5 熒光素酶報告實驗 MDA-MB-231/miR-31、MDA-MB-231/NC細胞各3.5×104個接種于48孔板。設計引物用PCR法從基因組DNA中克隆所需的靶啟動子片段Dock180-3′UTR，將此片段插入到熒光素酶報告基因腺病毒中構成pGL-Dock180-3′UTR。培養(yǎng)24 h后，Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)染48 h后用熒光素酶報告實驗工具箱依據(jù)公司給與的說明檢測pGL-Dock180-3′UTR的相對熒光酶素活性。

1.3 統(tǒng)計學方法 所有數(shù)據(jù)采用SPSS 17.0軟件進行統(tǒng)計學處理，統(tǒng)計方法采用獨立樣本t檢驗。P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 miR-31與Dock180的3′UTR互補結合 通過Target Scan靶點預測工具搜索，結果顯示miR-31與Dock180的3′UTR互補結合(圖1)。

2.2 miR-31在3種乳腺癌細胞系中的表達 本實驗選擇3種乳腺癌細胞系MCF-7、MDA-MB-231和MDA-MB-435(侵襲力依次增強)，RT-PCR檢測顯示，miR-31在3種乳腺癌中表達不同，侵襲力較弱的MCF-7高表達miR-31，侵襲力強的MDA-MB-435低表達miR-31，MDA-MB-231表達居中。提示miR-31的表達量與乳腺癌細胞系的侵襲能力呈反比(圖2)。

圖1 miR-31與Dock180的3′UTR互補結合

圖2 miR-31在3種乳腺癌細胞系中的表達

2.3 Dock180的表達與miR-31呈負相關 miR-31可以結合Dock180，但miR-31對Dock180表達量的影響未知。采用Western blot法檢測轉(zhuǎn)染后細胞中Dock180的表達, MDA-MB-231/miR-31中Dock180低表達，miR-31 inhibitor中Dock180高表達；Dock180的表達與miR-31呈負相關(圖3)。

圖3 Dock180的表達與miR-31呈負相關

2.4 miR-31與Dock180的3′UTR結合抑制其翻譯 miRNA通過兩種方式對靶基因的表達進行反向調(diào)節(jié)，一種是與mRNA結合，使其降解；另一種是結合在mRNA的3′UTR，抑制翻譯。為了證明miR-31與Dock180作用方式，本實驗通過RT-PCR分別檢測MDA-MB-231/miR-31、MDA-MB-231/NC中Dock180 mRNA的表達。MDA-MB-231/miR-31、MDA-MB-231/NC中，Dock180 mRNA表達量的差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。提示miR-31不是結合在Dock180 mRNA上使其降解，而是結合在Dock180的3′UTR上抑制翻譯(圖4)。

2.5 miR-31通過與Dock180的3′UTR靶向結合降低Dock180的翻譯 本組采用熒光素酶報告基因?qū)嶒灆z測MDA-MB-231/miR-31、MDA-MB-231/NC的pGL-Dock180-3′UTR的相關熒光素酶活性，MDA-MB-231/NC的活性明顯高于MDA-MB-231/miR-31，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，提示miR-31結合Dock180的3′UTR(圖5)。

圖4 RT-PCR檢測MDA-MB-231/miR-31、MDA-MB-231/NC中 Dock180 mRNA表達差異

圖5 MDA-MB-231/NC、MDA-MB-231/miR-31的 pGL-Dock180-3′UTR的相關熒光素酶活性

2.6 miR-31對乳腺癌MDA-MB-231細胞侵襲性的影響 采用基質(zhì)膠侵襲實驗檢測MDA-MB-231/miR-31、MDA-MB-231/NC的侵襲能力。與MDA-MB-231/NC相比，MDA-MB-231/miR-31穿過人工基膜的細胞減少，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05，圖6)。

圖6 MDA-MB-231/miR-31、MDA-MB-231/NC的侵襲能力比較

3 討論

乳腺癌在演進過程中以侵襲力強、轉(zhuǎn)移早、化療多重耐藥為特點[9]。其中，乳腺癌細胞的擴散是患者病情急劇惡化的重要原因，其中對細胞外基質(zhì)和基膜的侵襲是乳腺癌侵襲轉(zhuǎn)移過程中的關鍵環(huán)節(jié)[10]。進一步探討乳腺癌演進的機制，抑制乳腺癌侵襲和轉(zhuǎn)移是提高患者生存質(zhì)量，延緩患者病情甚至治愈乳腺癌的關鍵。

miRNA是一類由內(nèi)源基因編碼的長度約為22個核苷酸的非編碼單鏈RNA分子，Iorio等[11]表明miRNA參與乳腺癌的發(fā)生，且miRNA的表達與ER狀態(tài)相關，參與腫瘤的侵襲轉(zhuǎn)移。miRNA在不同部位腫瘤組織中的表達出現(xiàn)上調(diào)和下調(diào)兩個方向變化。一方面，miR-31在乳腺癌[4-8]、胃癌[12]及卵巢癌[13]中的表達水平均明顯降低，可抑制DNA復制及細胞周期或侵襲。本組實驗發(fā)現(xiàn)與MDA-MB-231/NC相比，MDA-MB-231/miR-31中miR-31過表達削弱乳腺癌細胞系的侵襲能力，提示本實驗結果與上述報道相符。然而，在有些癌癥中miR-31的過表達反而會增強腫瘤細胞的侵襲能力，在Cottonham等[14]報道中，miR-31過表達可增強直腸癌細胞系的遷移和侵襲能力。Xu等[15]發(fā)現(xiàn)，結腸癌中miR-31可能通過靶基因RhoBTB1促進結腸癌的發(fā)生。

本實驗發(fā)現(xiàn)miR-31可以與Dock180的3′UTR特異性的靶向結合，每個miRNA可以結合多個靶基因[6,8]，而幾個miRNA也可以調(diào)節(jié)同一個基因[14]。這種復雜的調(diào)節(jié)網(wǎng)絡既可以由一個miRNA來調(diào)控多個基因的表達，也可以通過幾個miRNA的組合來共同調(diào)控某個基因的表達。miRNA通過兩種方式對靶基因的表達進行反向調(diào)節(jié)，一種方式為依賴miRNA誘導的基因沉默，miRNA與編碼蛋白質(zhì)的mRNA近乎完全互補，其沉默復合體被相關酶切斷致使靶基因降解；另一種方式通過與靶基因mRNA的部分堿基互補(通常發(fā)生在 3′非翻譯端)，降低蛋白質(zhì)翻譯水平。為了證明miR-31通過哪種方式結合Dock180，本實驗采用熒光酶報告基因分析證明miR-31特異性作用于Dock180的3′UTR。通過Western blot法檢測MDA-MB-231/miR-31組的Dock180蛋白表達與MDA-MB-231/NC相比下降，miR-31 inhibitor的Dock180的表達上調(diào)，進一步證實Dock180是miR-31的靶基因。Li等[3]的實驗證明，在乳腺癌中趨化因子CXCL12與其受體CXCR4結合促進Dock180與ELMO穩(wěn)定結合形成復合體，進而激活Rac促進肌動蛋白的聚合反應；為miR-31通過結合Dock180抑制乳腺癌的侵襲提供了理論依據(jù)。

綜上所述，miR-31可通過結合Dock180抑制乳腺癌侵襲，有望成為通過Dock180逆轉(zhuǎn)乳腺癌侵襲的新靶點，提高患者的生存質(zhì)量。但是，miR-31通過結合Dock180抑制乳腺癌的具體機制尚不清楚，有待進一步探討。

(本文獲得國家留學生基金管理委員會資助，特此鳴謝！)

[1] 楊 碩，李洪利，李文通，等. 乳腺癌中PKCζ、MMP-2、MMP-9的表達及相關性[J]. 臨床與實驗病理學雜志, 2014,30(9):958-962.

[2] Akakura S, Kar B, Singh S,etal. C-terminal SH3 domain of CrkII regulates the assembly and function of the DOCK180/ELMO Rac-GEF[J]. J Cell Physiol, 2005,204(1):344-351.

[3] Li H, Yang L, Fu H,etal. Association between Galphai2 and ELMO1/Dock180 connects chemokine signalling with Rac activation and metastasis[J]. Nat Commun, 2013,4:1706.

[4] Valastyan S, Reinhardt F, Benaich N,etal. A pleiotropically acting micro RNA, miR-31 inhibits breast cancer metastasis[J]. Cell, 2009,137(6):1032-1046.

[5] Rasheed S A, Teo C R, Beillard E J,etal. MicroRNA-31 controls G protein alpha-13 (GNA13) expression and cell invasion in breast cancer cells[J]. Mol Cancer, 2015,14:67.

[6] Valastyan S, Chang A, Benaich N,etal. Concurrent suppression of integrin alpha5, radixin, and RhoA phenocopies the effects of miR-31 on metastasis[J]. Cancer Res, 2010,70(12):5147-5154.

[7] K?rner C, Keklikoglou I, Bender C,etal. MicroRNA-31 sensitizes human breast cells to apoptosis by direct targeting of protein kinase C epsilon (PKCepsilon)[J]. J Biol Chem, 2013,288(12):8750-8761.

[8] Viré E, Curtis C, Davalos V,etal. The breast cancer oncogene EMSY represses transcription of antimetastatic microRNA miR-31[J]. Mol Cell, 2014,53(5):806-818.

[9] Wang C Z, Yuan P, Li Y,etal. mi R-126 regulated breast cancer cell invasion by targeting ADAM9[J]. Int J Clin Exp Pathol, 2015,8(6):6547-6553.

[10] 李小龍，齊岳亮，陳為一，等. 下調(diào)Raptor表達對乳腺癌細胞侵襲能力影響及其機制探討[J]. 中華腫瘤防治雜志, 2014,21(22):1764-1768.

[11] Iorio M V, Ferracin M, Liu C G,etal. Micro RNA gene expression deregulation in human breast miRNA[J]. Cancer Res, 2005,65(16):7065-7070.

[12] Zhang Y, Guo J, Li D,etal. Down-regulation of miR-31 expression in gastric cancer tissues and its clinical significance[J]. Med Oncol, 2010,27(3):685-689.

[13] Creighton C J, Fountain M D, Yu Z,etal. Molecular profiling uncovers a p53-associated role for micro RNA-31 in inhibiting the proliferation of serous ovarian carcinomas and other cancers[J]. Cancer Res, 2010,70(5):1906-1915.

[14] Cottonham C L, Kaneko S, Xu L,etal. miR-21 and miR-31 converge on TIAM1 to regulate migration and invasion of colon carcinoma cells[J]. J Biol Chem, 2010,285(46):35293-35302.

[15] Xu R S, Wu X D, Zhang S Q,etal. The tumor suppressor gene RhoBTB1 is a novel target of miR-31 in human colon cancer[J]. Int J Oncol, 2013,42(2):676-682.

MiR-31 inhibit the invasion of breast cancer by Dock180

ZHENG Shu-xian1, SUN Xue-mei1, WANG Rui-ge1, SHI Li-hong2, ZHANG Bao-gang1

(1DepartmentofPathology,2DepartmentofPharmacology,WeifangMedicalUniversity,Weifang261053,China)

Purpose To investigate the correlation of Dock180 and miR-31 expression in breast cancer cells, and to observe the effect of miR-31 on the invasion of breast cancer cells by Dock180. Methods MiR-31 was transfected into breast cancer cells by liposome transfection technique. The actual binding site of miR-31 to the 3′-untranslated region of Dock180 was confirmed through luciferase assay. Western blot was performed to detect the expression of Dock180 and other related proteins. Real-time PCR was used to measure the expression of Dock180. Matrigel invasion were performed to detect the invasion of breast cancer cell lines with miR-31 increased. Results The protein levels of Dock180 in breast cancer cell lines negatively correlated with miR-31 expression, and Dock180 was directly targeted by miR-31. Dock180 downregulation and miR-31 overexpression reduced breast cancer cells invasion. Conclusion Dock180 modulated by miR-31 plays an important function in breast cancer cell lines invasion.

breast neoplasm； miR-31； Dock180； invasion

時間：2017-3-16 14:23

http://kns.cnki.net/kcms/detail/34.1073.R.20170316.1423.002.html

國家自然科學基金(81072068、81672631)、山東省自然科學基金中青年科學家獎勵基金(2010BSB14051)、山東省教育廳課題(J14LK13)

濰坊醫(yī)學院1病理學教研室、2藥理學教研室，濰坊 261053

鄭書賢，女，碩士研究生。Tel:(0536)8462034，E-mail: shuxianzheng@126.com 張寶剛，男，教授，通訊作者。E-mail: zbg0903@hotmail.com

R 737.9

A

1001-7399(2017)03-0241-04

10.13315/j.cnki.cjcep.2017.03.002

接受日期：2017-01-23