藍(lán)莓采后主要病原真菌的分離鑒定與生物學(xué)特性研究

郜海燕 肖尚月 陳杭君 黎云龍 劉瑞玲 吳偉杰

(浙江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院食品科學(xué)研究所， 杭州 310021)

藍(lán)莓采后主要病原真菌的分離鑒定與生物學(xué)特性研究

郜海燕 肖尚月 陳杭君 黎云龍 劉瑞玲 吳偉杰

(浙江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院食品科學(xué)研究所， 杭州 310021)

霉變是導(dǎo)致藍(lán)莓采后損失、貨架期短的主要原因之一，為確定藍(lán)莓貯藏期的主要致腐病原真菌，對(duì)浙江省杭州市安吉縣藍(lán)莓產(chǎn)區(qū)發(fā)病果實(shí)的病原菌進(jìn)行分離純化，得到5株病原真菌(LMA、LMB、LMC1、LMC2和LMC3)。通過(guò)形態(tài)學(xué)和rDNA-ITS序列分析，初步鑒定為B.cinerea、T.viridescens、P.cecidicola、P.polonicum和P.expansum。分離菌株的生物學(xué)特性研究表明，5株病原菌適宜生長(zhǎng)條件為：藍(lán)莓汁-葡萄糖培養(yǎng)基，25～30℃；菌株LMA、LMC1 和LMC2的最適碳源為果糖，菌株LMB和菌株LMC3的最適碳源分別為蔗糖和可溶性淀粉；菌株LMA、LMC1 和LMC2的最適氮源為蛋白胨，菌株LMB和LMC3的最適氮源為酵母浸出粉。光照對(duì)菌株LMA、LMC1和LMC2病原菌菌絲生長(zhǎng)有明顯影響，而對(duì)菌株LMB和LMC3影響較小。

藍(lán)莓； 采后病害； 分離鑒定； rDNA-ITS； 生物學(xué)特性

引言

藍(lán)莓果實(shí)含有豐富的花青素、類(lèi)黃酮、維生素C、葉酸、鞣花酸等多種生理活性物質(zhì)[1-2]，具有抗衰老、降血壓、抗氧化、抗癌等功效[3]。藍(lán)莓一般成熟于高溫多雨的夏季，采收后，很容易發(fā)生結(jié)構(gòu)、營(yíng)養(yǎng)和生理品質(zhì)的變化，并且果實(shí)富含糖分及其他營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，易于微生物的繁殖，低pH值屬性使其更易受到真菌的侵襲，霉變成為藍(lán)莓采后損失、貨架期短的主要原因之一[4-5]，嚴(yán)重影響其商品性和經(jīng)濟(jì)價(jià)值。侵襲采后藍(lán)莓的病原真菌很多，但存在地域的差異性：西班牙、美國(guó)、智利、阿根廷等地的病原菌主要是Botrytiscinerea、Colletotrichumspp.、Alternariaspp.、Cladosporiumspp.、Penicilliumspp.、Fusariumspp.和Rhizopusspp.[5-10]；周笑犁等[11]的研究表明貴州省藍(lán)莓果實(shí)采后貯藏過(guò)程中的主要病原菌為擬盤(pán)多毛孢(Pestalotiopsis)、青霉(Penicillium)、地霉(Geotrichum)和枝孢霉(Cladosporium)；白雪等[12]鑒定出大連地區(qū)藍(lán)莓主要病原菌為葡萄孢霉(B.cinema)。分離鑒定藍(lán)莓采后致腐的主要病原菌是病害防治的首要問(wèn)題，目前尚未見(jiàn)浙江地區(qū)藍(lán)莓霉變真菌的研究。由于病原菌在形態(tài)、生理、病理等方面存在復(fù)雜性和多態(tài)性，常規(guī)形態(tài)鑒定周期較長(zhǎng)，且難以將病原鑒定到種或亞種水平；而真菌在rDNA-ITS區(qū)既具保守性，又在屬間及同屬不同種間存在廣泛的多態(tài)性[13]，在病菌分類(lèi)鑒定方面應(yīng)用廣泛。目前國(guó)內(nèi)外對(duì)利用真菌rDNA-ITS對(duì)霉?fàn)€藍(lán)莓病原菌鑒定的研究鮮有報(bào)道。

本文對(duì)采收于浙江省杭州市安吉縣藍(lán)莓基地貯藏發(fā)病的藍(lán)莓果實(shí)病原菌進(jìn)行分離純化，在傳統(tǒng)的形態(tài)鑒定基礎(chǔ)上，結(jié)合rDNA-ITS測(cè)序?qū)⒕觇b定到種的水平，并研究分離株的生物學(xué)特性，以期為藍(lán)莓貯藏期真菌病害的防控提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與培養(yǎng)基

1.1.1 試驗(yàn)材料

藍(lán)莓品種為“萊格西”，采自浙江省杭州市安吉縣“森之藍(lán)”藍(lán)莓基地，采摘當(dāng)天用保鮮車(chē)運(yùn)回實(shí)驗(yàn)室，4℃貯藏備用。

1.1.2 培養(yǎng)基

PDA培養(yǎng)基：馬鈴薯(去皮)200 g、葡萄糖20 g、瓊脂20 g，pH值自然。

察氏培養(yǎng)基：蔗糖30 g、NaNO32 g、K2HPO41 g、MgSO4·7H2O 0.5 g、KCl 0.5 g、FeSO4·7H2O 0.1 g、瓊脂20 g、蒸餾水1 000 mL，pH值7.0～7.2。

1.2 病原菌的分離純化與致病性測(cè)定

對(duì)典型發(fā)病的藍(lán)莓果實(shí)，采用常規(guī)組織分離法分離病原菌[14]，切取病健交界處小塊病變組織(5 mm×5 mm)，經(jīng)70%酒精消毒1 min，再用0.1%升汞處理30 s后，用無(wú)菌水漂洗3遍，移至PDA平板培養(yǎng)基上，置于28℃黑暗條件下培養(yǎng)。長(zhǎng)出菌絲后挑取菌落邊緣接種至PDA平板純化，獲純培養(yǎng)后，再轉(zhuǎn)接到試管培養(yǎng)7 d，放入4℃冰箱保存。

按照柯赫氏法則進(jìn)行致病性測(cè)定。將純化保存的病原菌活化，接種至PDA培養(yǎng)基上28℃黑暗條件下培養(yǎng)5 d，挑取菌絲塊放入無(wú)菌水中將孢子洗脫，用血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)測(cè)定孢子懸浮液濃度并調(diào)至105個(gè)/mL。將健康的藍(lán)莓果實(shí)經(jīng)75%酒精表面消毒后，用經(jīng)高壓蒸汽滅菌的針輕輕刺傷表皮，將制備好的孢子懸液涂布到刺傷部位，將藍(lán)莓果實(shí)置于90 mm培養(yǎng)皿中，培養(yǎng)皿放有無(wú)菌水浸濕的經(jīng)高壓蒸汽滅菌的濾紙保濕培養(yǎng)。每處理3次重復(fù)，設(shè)清水對(duì)照。發(fā)病后從病斑上再分離病原菌。

1.3 病原菌鑒定

病原菌形態(tài)學(xué)觀察：將病原菌接種到PDA平板，28℃黑暗培養(yǎng)，觀察記錄菌落形態(tài)學(xué)特征，并對(duì)病原菌分生孢子進(jìn)行顯微形態(tài)觀測(cè)、拍照。

ITS序列分析：將孢子懸浮液接種到PDB培養(yǎng)液中培養(yǎng)3～4 d，收集菌絲，采用改良的CTAB法[15]提取病原菌基因組DNA。采用真菌核糖體基因轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)通用引物ITSl(5′-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3′)和ITS4(5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′)對(duì)病原菌的基因組DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增。25 μL PCR反應(yīng)體系包括10 x PCR buffer 2.5 μL，MgCl2(25 mmol/L)2.5 μL，dNTP(10 mmol/L)0.5 μL，模板DNA 1 μL，5 U/μL TaqDNA聚合酶0.2 μL，ITS1和ITS4引物(20 mmol/L)各0.5 μL，ddH2O 17.3 μL。

反應(yīng)程序：95℃預(yù)變性5 min；94℃變性30 s，55℃退火30 s，72℃延伸1 min，共30個(gè)循環(huán)；最后72℃延伸10 min。

擴(kuò)增產(chǎn)物用1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)后，在凝膠成像儀上進(jìn)行觀察并拍照，并送杭州利貞生物公司進(jìn)行測(cè)序。將所得序列與GenBank中已知序列進(jìn)行BLAST比對(duì)和同源性分析，選取與病原菌ITS序列同源性高和形態(tài)相近的菌株序列，用MEGA 5.0軟件[16-17]中的Neighbor-Joining(NJ)方法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)，并用Bootstrap進(jìn)行自舉檢驗(yàn)，500次重復(fù)。

1.4 病原菌生物學(xué)特性

將純化保存的病原菌活化后接種至PDA培養(yǎng)基上28℃黑暗條件下培養(yǎng)5 d，用打孔器取直徑為6 mm 的菌餅接種至測(cè)定培養(yǎng)基，培養(yǎng)5 d后用十字交叉法測(cè)量菌落直徑，分析不同培養(yǎng)基、溫度、碳源、氮源、pH值、光照對(duì)菌絲生長(zhǎng)的影響。

培養(yǎng)基：病原菌接種到PDA、PCA(胰蛋白胨5.0 g、酵母浸膏2.5 g、葡萄糖1.0 g、瓊脂15 g、蒸餾水1 000 mL，pH值7.0～7.2)、孟加拉紅培養(yǎng)基(蛋白胨5.0 g、葡萄糖10.0 g、K2HPO41.0 g、MgSO4·7H2O 0.5 g、孟加拉紅0.033 g、瓊脂20 g、蒸餾水1 000 mL)、藍(lán)莓汁-葡萄糖培養(yǎng)基(藍(lán)莓200 g、葡萄糖20 g、瓊脂20 g、蒸餾水1 000 mL，pH值7.0～7.2)和WA培養(yǎng)基(瓊脂20 g、蒸餾水1 000 mL)。

圖1 藍(lán)莓貯藏期發(fā)病果實(shí)病害癥狀、分離菌株形態(tài)特征及其回接癥狀Fig.1 Symptoms of postharvest diseases on blueberry and morphology and pathogenicity of pathogens

溫度：病原菌接種到PDA培養(yǎng)基后，置于溫度為4、10、15、20、25、30、35℃的條件下恒溫培養(yǎng)。

碳、氮源：以察氏培養(yǎng)基為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，用含等質(zhì)量的葡萄糖、果糖、可溶性淀粉、麥芽糖、乳糖、甘露醇代替蔗糖作為碳源；用含等質(zhì)量的牛肉膏、NH4NO3、蛋白胨、酵母浸膏、尿素代替NaNO3作為氮源。

pH值：病原菌接種到用0.1% NaOH和0.1% HCl溶液調(diào)節(jié)至pH值為4、5、6、7、8、9、10、11的PDA培養(yǎng)基后，恒溫培養(yǎng)。

光照：病原菌接種到PDA培養(yǎng)基后，進(jìn)行24 h光照、12 h光暗交替、24 h黑暗共3個(gè)處理。以上試驗(yàn)每處理3次重復(fù)，除溫度和光照試驗(yàn)外，其余均在28℃條件下黑暗培養(yǎng)24 h。

1.5 數(shù)據(jù)分析

數(shù)據(jù)以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，利用OriginPro 5.8軟件進(jìn)行單因素方差分析，p<0.05作為差異顯著性判斷標(biāo)準(zhǔn)。

2 結(jié)果與分析

2.1 病害癥狀及致病性

藍(lán)莓果實(shí)在低溫貯藏一個(gè)月后，果實(shí)長(zhǎng)出霉菌，典型發(fā)病果實(shí)分為3類(lèi)(圖1a)。菌斑LMA：果實(shí)上密生灰褐色團(tuán)粒狀柔軟霉層，形成大量孢子，易與周?chē)」纬善瑺蠲箤?。菌斑LMB：病果初期有扁平或塌陷的斑點(diǎn)，后期形成大的腐爛區(qū)，在腐爛區(qū)域的表面有白色菌絲。菌斑LMC：造成藍(lán)莓的干癟皺縮，侵染部位最初為水浸狀略變色的斑點(diǎn)，形成橄欖綠色或綠色霉層。

用病斑上分離純化的菌株，人工接種健康的藍(lán)莓果實(shí)。在接種部位分別出現(xiàn)灰色霉層、白色菌絲和橄欖綠色或綠色霉斑，病癥與自然條件下的發(fā)病癥狀相同(圖1d)。從接種發(fā)病的部位可重新分離到與接種菌相同的菌株，而對(duì)照不發(fā)病，證明所分離接種的菌株為藍(lán)莓致腐病原菌。

2.2 分離菌株的形態(tài)學(xué)特征

從發(fā)病果實(shí)樣品上經(jīng)純化得到 5株分離菌株，編號(hào)為L(zhǎng)MA、LMB、LMC1、LMC2和LMC3(圖1b、1c)。菌株LMA在PDA培養(yǎng)基上28℃培養(yǎng)3～6 d即可長(zhǎng)滿平板，初為白色、質(zhì)密，隨著菌絲增長(zhǎng)顏色加深變成深灰綠色，老熟時(shí)呈灰褐色，菌絲絲絨狀，約7 d在培養(yǎng)基周?chē)a(chǎn)生黑色菌核，呈球形，分生孢子梗數(shù)根叢生，具隔膜，稍彎曲，淡褐色，(123～287)μm×(10～14)μm，頂端有分枝，膨大呈圓形，分生孢子聚生于小梗上，呈卵圓形或橢圓形，單胞，(8～14)μm×(7～11)μm，無(wú)色至淡色透明。菌株LMB在PDA培養(yǎng)基上、28℃條件下菌落生長(zhǎng)速度很快，整個(gè)菌落整齊而平坦，氣生菌絲體絨狀或棉絮狀，菌絲為白色，生長(zhǎng)中期菌落中間出現(xiàn)淡黃色，后期漸變?yōu)榍嗑G色，在電子顯微鏡下觀察呈樹(shù)枝狀，疏散，分生孢子呈卵形、橢圓形或近球形，光滑，3.6 μm×4.5 μm。菌株LMC1在PDA培養(yǎng)基上菌落呈粉末狀，具有明顯環(huán)痕，中間區(qū)域呈綠色，生長(zhǎng)后期中間有白色，后長(zhǎng)成白絨，周?chē)式鸷稚?，背面黃褐色。分生孢子梗生于菌絲，一端分生孢子梗頂端呈帚狀分枝，分子孢子大多呈圓形，多為三輪生。菌株LMC2在PDA培養(yǎng)基上菌落平坦，青色呈粉粒狀，中間有小白點(diǎn)，有白色的邊緣，最后變褐色?；|(zhì)由白色轉(zhuǎn)為黃褐色，并隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)逐步加深，較薄，易產(chǎn)生小菌落，干燥，呈圓形，生長(zhǎng)后期顏色加深。在電鏡下觀察，帚狀枝，通常雙輪生，分生孢子呈卵圓形，孢梗莖壁平滑。菌株LMC3在PDA培養(yǎng)基上形成的菌落平坦，呈絨狀，生長(zhǎng)后期顏色加深，呈深灰綠色，背面暗紅色，最外圈呈粉色，有油狀分泌物。菌絲細(xì)長(zhǎng)絲狀，線性，分生孢子梗頂端呈帚狀分枝，分枝不規(guī)則，排列緊密；小梗平行排列，通常6～10個(gè)，(9.0～15.0)μm×(3.0～3.5)μm，分生孢子呈鏈狀，橢圓形，表面光滑，單胞，無(wú)色，(4.5～6.5)μm×(3.0～4.0)μm分生孢子鏈集成圓柱形。在罹病果實(shí)和人工培養(yǎng)條件下均未見(jiàn)病原菌的有性階段。依據(jù)病原菌的培養(yǎng)性狀和形態(tài)學(xué)特征，參照文獻(xiàn)[18-20]，初步鑒定以分離菌株LMA為代表的第1類(lèi)藍(lán)莓果實(shí)的病原菌是灰葡萄孢，以分離菌株LMB為代表的第2類(lèi)藍(lán)莓果實(shí)的病原菌是木霉屬，以分離菌株LMC1、LMC2和LMC3為代表的第3類(lèi)藍(lán)莓果實(shí)的病原菌是青霉屬。

2.3 rDNA-ITS序列分析

以真菌rDNA-ITS區(qū)通用引物ITS1和ITS4，擴(kuò)增這5種代表病原菌菌株的基因組DNA，在500 bp附近有明顯的擴(kuò)增條帶(圖2，圖中M、1、2、3、4、5、C分別表示DL2000 DNA marker、菌株LMA、菌株LMB、菌株LMC1、菌株LMC2、菌株LMC3和對(duì)照)，將測(cè)序結(jié)果與NCBI中的基因序列進(jìn)行比對(duì)，用軟件ClustalX 1.8進(jìn)行多重序列比較，再用軟件MEGA 5.0采用鄰接法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)(圖3)。LMA與GenBank中登記的登錄號(hào)為KR080286、KR909190的灰葡萄孢菌聚為一支；LMB與登錄號(hào)為NR138429、AY380905、AF456922的綠色木霉聚為一支；LMC1與GenBank中登記的登錄號(hào)為AY787844的P.cecidicola聚為一支；LMC2與GenBank中登記的登錄號(hào)為AJ005492.1、NR103687的波蘭青霉聚為一支；LMC3與GenBank中登記的登錄號(hào)為KC456327、NR077154的擴(kuò)展青霉聚為一支，相似度分別為99%～100%。5種病原菌特異性引物擴(kuò)增結(jié)果再次證明所獲代表菌株分別為B.cinerea、T.viridescens、P.cecidicola、P.polonicum和P.expansum。

圖2 ITS1 和 ITS4 區(qū)域的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物電泳圖Fig.2 Electrophoresis of PCR amplified products in ITS1 and ITS4

2.4 病原菌生物學(xué)特性

從圖4可以看出，不同培養(yǎng)基對(duì)5種病原菌菌落生長(zhǎng)影響有差異，與其他3種培養(yǎng)基相比，病原菌均在藍(lán)莓汁-葡萄糖培養(yǎng)基中生長(zhǎng)最好，其次是PDA培養(yǎng)基。培養(yǎng)5 d后，5 種病原菌菌絲在 10～35℃均可生長(zhǎng)，且菌落生長(zhǎng)直徑在 4～35℃溫度梯度范圍內(nèi)均呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢(shì)，最適生長(zhǎng)溫度為 25～30℃。LMA、LMC1 和 LMC3 最適生長(zhǎng)溫度為 25℃，LMB 和 LMC2 最適生長(zhǎng)溫度為 30℃。LMA、LMB 和 LMC1 5 d菌落直徑分別達(dá)到 71.19 mm、83.42 mm 和 57.46 mm，而 LMC2、LMC3 5 d菌落直徑僅為35.40 mm 和 31.69 mm。LMB 相比其他病原菌有較寬的適宜生長(zhǎng)溫度。LMA、LMC1和LMC2菌株在以果糖為碳源的培養(yǎng)基中菌絲生長(zhǎng)得較好，LMB菌株在以蔗糖為碳源的培養(yǎng)基中菌絲生長(zhǎng)得較好，LMC3菌株在以可溶性淀粉為碳源的培養(yǎng)基中菌絲生長(zhǎng)得較好。病原菌菌絲生長(zhǎng)對(duì)氮源的要求不同，其中LMA、LMC1和LMC2菌株菌絲在以蛋白胨為氮源的培養(yǎng)基中生長(zhǎng)最好，LMB和LMC3菌株菌絲在以酵母浸出粉為氮源的培養(yǎng)基中生長(zhǎng)最好。5種病原菌在pH值為6～11下均能生長(zhǎng)，其中LMB對(duì)pH值不敏感，在pH值為6～11下均生長(zhǎng)良好，但其他4種病原菌在pH值為9.0以上時(shí)病原菌菌絲均生長(zhǎng)受限。在光照、黑暗和12 h光暗交替條件下，光照對(duì)LMA、LMC1和LMC2病原菌菌絲生長(zhǎng)的影響有顯著差異(p<0.05)，說(shuō)明對(duì)光照反應(yīng)敏感，而光照對(duì)LMB和LMC3病原菌菌絲生長(zhǎng)的影響沒(méi)有顯著差異(p>0.05)，說(shuō)明對(duì)光照反應(yīng)不敏感。

圖3 藍(lán)莓貯藏期主要真菌病害分離株rDNA-ITS 序列系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)Fig.3 Phylogenetic tree of rDNA-ITS of fungal pathogens from blueberry during postharvest storage

圖4 不同培養(yǎng)基、碳氮源、溫度、pH值和光照對(duì)病原真菌菌絲生長(zhǎng)的影響Fig.4 Effects of different medias, carbon and nitrogen sources, temperatures, pH values and light on mycelial growth of five fungal pathogens

3 討論

(1)為延長(zhǎng)藍(lán)莓的貨架期，低溫儲(chǔ)藏是最常用的方式，而霉菌能在-0.5℃的條件下生長(zhǎng)并通過(guò)氣生菌絲在漿果間快速傳播，導(dǎo)致藍(lán)莓在采后儲(chǔ)藏、運(yùn)輸過(guò)程中損失嚴(yán)重[21-22]。梁晨等[23]分離鑒定出引起北方地區(qū)藍(lán)莓采后病害的主要病原菌包括灰葡萄孢、青霉、褐孢霉、鏈格孢和枝頂孢等真菌。由于藍(lán)莓品種以及溫度和濕度等自然條件的差異，不同地區(qū)的藍(lán)莓采后感染的真菌種類(lèi)不同。本文從浙江地區(qū)采后發(fā)病藍(lán)莓果實(shí)中分離得到主要病原真菌，經(jīng)形態(tài)學(xué)及分子生物學(xué)鑒定，分別確定為灰葡萄孢霉(B.cinerea)、木霉(T.viridescens)和青霉(Penicilliumspp.)。葡萄孢(Botrytis)和青霉菌(Penicillium)分別導(dǎo)致果蔬發(fā)生灰霉病(gray mold)和綠霉病(gray mold)。國(guó)內(nèi)外有研究報(bào)道葡萄孢、青霉是引起藍(lán)莓采后貯藏期病害的主要病原菌[6-12,23-24]，本研究得到了相類(lèi)似的結(jié)果，灰葡萄孢霉(B.cinerea)、青霉(P.cecidicola、P.polonicum和P.expansum)也是浙江地區(qū)藍(lán)莓采后霉變的主要真菌，另外，本研究還在霉變藍(lán)莓果實(shí)中分離鑒定出病原菌T.viridescens。木霉屬(Trichoderma)被報(bào)道是引起獼猴桃貯藏期果實(shí)霉?fàn)€的主要病原菌之一[13]。張廣志等[25]發(fā)現(xiàn)Trchodermasp.是一類(lèi)具有較高生防價(jià)值的真菌，對(duì)防治作物白絹病、立枯病、猝倒病、枯萎病、疫病等土傳病害及線蟲(chóng)有良好的效果。本研究中的木霉菌株LMB對(duì)引起藍(lán)莓霉變的其他病原菌是否有拮抗作用，還有待進(jìn)一步研究。

(2)灰葡萄孢菌(B.cinerea)的寄主范圍十分廣泛，生物學(xué)特性由于寄主、地區(qū)等條件不同而略有差異[26]。梁晨等[23]報(bào)道的灰葡萄孢菌適宜生長(zhǎng)溫度范圍為20～25℃；雷百戰(zhàn)等[27]發(fā)現(xiàn)灰葡萄孢菌生長(zhǎng)溫度范圍為5～30℃，最適溫度為15～25℃；陳長(zhǎng)卿等[28]研究的越橘灰霉病病原菌菌絲生長(zhǎng)最適碳、氮源分別為甘露糖和蛋白胨。本研究分離的灰葡萄孢菌LMA最適生長(zhǎng)溫度為25℃，最適碳、氮源分別為果糖和蛋白胨。木霉菌LMB的最適生長(zhǎng)溫度為30℃，蔗糖和酵母浸出粉分別為最適碳、氮源，與柯仿鋼等[29]研究報(bào)道的菌絲最適生長(zhǎng)溫度范圍為28～30℃，蔗糖、酵母膏分別為最佳碳、氮源結(jié)果類(lèi)似。青霉屬之間的生物學(xué)特性有一定差異。P.polonicum的最適溫度為30℃，而P.cecidicola和P.expansum的最適溫度為25℃，在高溫條件下P.polonicum為優(yōu)勢(shì)種，這與梁晨等[23]研究發(fā)現(xiàn)的高溫條件有利于青霉菌的侵染結(jié)果相似。

(3)多種采后病害的發(fā)生與水分、溫度和可溶性糖含量有關(guān)[30-31]，藍(lán)莓果實(shí)可溶性糖含量高，成熟采收于6—7月份，杭州多雨且溫度多為25～30℃，為5種病原菌的最適宜溫度。有些病原菌有潛伏特性，多數(shù)病原菌在生長(zhǎng)期間就侵入果實(shí)，長(zhǎng)期潛伏在果實(shí)內(nèi)部，并不表現(xiàn)癥狀，直至果實(shí)成熟采收和環(huán)境條件適宜的時(shí)候才發(fā)病[32-33]，5種病原菌是否具有潛伏特性以及侵染機(jī)制的研究還有待進(jìn)一步研究。采后侵染多是由于在果實(shí)的采收、包裝、運(yùn)輸過(guò)程中劃傷或擠壓造成的微傷口，是微生物侵染的主要途徑[31]，我國(guó)藍(lán)莓的采收多為人工采摘，為減少采后病害的發(fā)生，在采收和貯運(yùn)過(guò)程中要盡量避免機(jī)械損傷；藍(lán)莓采收后應(yīng)盡快運(yùn)到包裝廠進(jìn)行預(yù)冷處理，在低溫下貯藏，以減少病原菌的侵染，降低采后病害發(fā)生率。

4 結(jié)束語(yǔ)

初步研究了浙江地區(qū)藍(lán)莓采后貯藏期霉變病原菌，獲得5株病原菌，結(jié)合形態(tài)學(xué)和分子生物學(xué)方法分別鑒定為B.cinerea、T.viridescens、P.cecidicola、P.polonicum和P.expansum；同時(shí)研究分離菌株的生物學(xué)特性，確定了其營(yíng)養(yǎng)基質(zhì)和生長(zhǎng)條件：藍(lán)莓汁-葡萄糖培養(yǎng)基，25～30℃；菌株B.cinerea、P.cecidicola和P.polonicum的最適碳、氮源分別為果糖和蛋白胨，且對(duì)光照敏感；菌株T.viridescens和菌株P(guān).expansum的最適碳源分別為蔗糖和可溶性淀粉，最適氮源均為酵母浸出粉，對(duì)光照不敏感。研究結(jié)果可為藍(lán)莓貯藏期腐爛病害的防治提供理論基礎(chǔ)。

1 SELLAPPAN S, AKOH C C, KREWER G. Phenolic compounds and antioxidant capacity of Georgia-grown blueberries and blackberries[J]. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 2002, 50(8): 2432-2438.

2 郜海燕, 徐龍, 陳杭君, 等. 藍(lán)莓采后品質(zhì)調(diào)控和抗氧化研究進(jìn)展[J]. 中國(guó)食品學(xué)報(bào), 2013, 13(6): 1-8. GAO Haiyan, XU Long, CHEN Hangjun, et al.Research progress on postharvest quality control and antioxidant activity of blueberries[J]. Journal of Chinese Institute of Food Science and Technology, 2013, 13(6): 1-8. (in Chinese)

3 PATEL S. Blueberry as functional food and dietary supplement: the natural way to ensure holistic health[J]. Mediterranean Journal of Nutrition & Metabolism, 2014, 7:133-143.

4 YANG G, YUE J, GONG X,et al. Blueberry leaf extracts incorporated chitosan coatings for preserving postharvest quality of fresh blueberries[J]. Postharvest Biology and Technology, 2014, 92: 46-53.

5 TOURNAS V H, KATSOUDAS E. Mould and yeast flora in fresh berries, grapes and citrus fruits[J]. International Journal of Food Microbiology,2005, 105(1): 11-17.

6 BARRAU C, SANTOS B D L, ROMERO F. Susceptibility of southern highbush and rabbiteye blueberry cultivars to postharvest diseases in Huelva, Spain[J]. Journal of Physiology, 2006, 366(1):197-220.

7 MEHRA L K, MACLEAN D D, SHEWFELT R L, et al. Effect of postharvest biofumigation on fungal decay, sensory quality, and antioxidant levels of blueberry fruit[J]. Postharvest Biology & Technology, 2013, 85:109-115.

8 MEHRA L K, SAVELLE A T, MACLEAN D D, et al. Postharvest disease development on southern highbush blueberry fruit in relation to berry flesh type and harvest method[J]. Plant Disease, 2013, 97(2):213-221.

9 ZHU X Q, XIAO C L. Phylogenetic, morphological, and pathogenic characterization ofAlternariaspecies associated with fruit rot of blueberry in California[J]. Phytopathology, 2015, 105: 1555-1567.

10 RIVERA S A, ZOFFOLI J P, LATORRE B A. Determination of optimal sulfur dioxide time and concentration product for postharvest control of gray mold of blueberry fruit[J]. Postharvest Biology & Technology, 2013, 83(2):40-46.

11 周笑犁, 王瑞, 雷霽卿, 等. 藍(lán)莓采后病原真菌分離及其生物學(xué)鑒定[J]. 食品科技, 2015, 40(9):283-293. ZHOU Xiaoli, WANG Rui, LEI Jiqing, et al. Separation and biological identification of pathogenic fungi on postharvest blueberry[J]. Food Science and Technology, 2015, 40(9):283-293. (in Chinese)

12 白雪, 姜愛(ài)麗, 胡文忠, 等. 采后藍(lán)莓果實(shí)表面病原菌的分離鑒定及PCR檢測(cè)[J]. 食品工業(yè)科技, 2015, 36(23): 297-305. BAI Xue, JIANG Aili, HU Wenzhong,et al. Study on the optimization of PCR detection conditions for pathogen isolated from the postharvest blueberry surface[J]. Science and Technology of Food Industry, 2015, 36(23): 297-305.(in Chinese)

13 段愛(ài)莉, 雷玉山, 孫翔宇,等. 獼猴桃果實(shí)貯藏期主要真菌病害的rDNA-ITS鑒定及序列分析[J]. 中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué), 2013, 46(4):810-818. DUAN Aili, LEI Yushan, SUN Xiangyu, et al. Molecular identification and rDNA-ITS sequence analysis of fungal pathogens in kiwifruit during storage[J]. Scientia Agricultura Sinica, 2013, 46(4):810-818.(in Chinese)

14 方忠達(dá). 植病研究方法[M]. 北京：中國(guó)農(nóng)業(yè)出版社, 1998.

15 周宗山, 徐成楠, 吳玉星, 等. 歐李炭疽病病原菌鑒定[J]. 植物病理學(xué)報(bào), 2011, 41(5): 538-541. ZHOU Zongshan, XU Chengnan, WU Yuxing, et al. Identification of the pathogen causing anthracnose of Chinese dwarf cherry[J]. Acta Phytopathologica Sinica, 2011, 41(5): 538-541. (in Chinese)

16 岳田利, 耿玉麗, 袁亞宏,等. 陜西省果庫(kù)中嗜酸耐熱菌的分離鑒定[J/OL]. 農(nóng)業(yè)機(jī)械學(xué)報(bào), 2013, 44(7):187-193.http:∥www.j-csam.org/jcsam/ch/reader/view_abstract.aspx?file_no=20130733&flag=1. DOI: 10.6041/j.issn.1000-1298.2013.07.033. YUE Tianli,GENG Yuli,YUAN Yahong, et al. Isolation and identification ofAlicyclobacillusfrom Shaanxi apple libraries[J/OL]. Transactions of the Chinese Society for Agricultural Machinery, 2013, 44(7):187-193.(in Chinese)

17 王虎玄, 岳田利, 胡仲秋,等. 陜西濃縮蘋(píng)果汁中高滲酵母的分離鑒定[J/OL]. 農(nóng)業(yè)機(jī)械學(xué)報(bào), 2015, 46(4):246-251. http:∥www.j-csam.org/jcsam/ch/reader/view_abstract.aspx?file_no=20150436&flag=1. DOI:10. 6041/j.issn.1000-1298. 2015. 04. 036. WANG Huxuan,YUE Tianli,HU Zhongqiu, et al. Identification of osmotolerant yeast in apple juice concentrate from Shaanxi province[J/OL]. Transactions of the Chinese Society for Agricultural Machinery, 2015, 46(4):246-251.(in Chinese)

18 TAMURA K, PETERSON D, PETERSON N, et al. MEGA5: molecular evolutionary genetics analysis using maximum likelihood, evolutionary distance, and maximum parsimony methods[J]. Molecular Biology and Evolution, 2011, 28(10): 2731-2739.

19 戴芳瀾. 中國(guó)真菌總匯[M]. 北京: 科學(xué)出版社，1979.

20 魏景超. 真菌鑒定手冊(cè)[M]. 上海: 上?？茖W(xué)技術(shù)出版社，1979.

21 XU C, ZHANG H, ZHOU Z, et al. Identification and distribution ofBotryosphaeriaceaespecies associated with blueberry stem blight in China [J]. European Journal of Plant Pathology, 2015, 143(4):737-752.

22 JUNQUEIRA-GON?ALVES M P, ALARCN E, NIRANJAN K. The efficacy of potassium sorbate-coated packaging to control postharvest gray mold in raspberries, blackberries and blueberries[J]. Postharvest Biology & Technology, 2016, 111:205-208.

23 梁晨, 劉翠, 趙洪海. 藍(lán)莓貯藏期病原菌的鑒定及病菌的溫度效應(yīng)[C]∥中國(guó)植物病理學(xué)會(huì)2010年學(xué)術(shù)年會(huì)論文集, 2010:108-113. LIANG Chen, LIU Cui, ZHAO Honghai. Identification and temperature effect of the pathogens from blueberry in storage[C]∥Proceedings of the 2010 Annual Conference of the Chinese Society for Plant Pathology, 2010: 108-113.(in Chinese)

24 徐城南, 王亞南, 胡同樂(lè),等. 藍(lán)莓炭疽病病原菌鑒定及致病性測(cè)定[J].中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué), 2014, 47(20): 3992-3998. XU Chengnan, WANG Ya’nan, HU Tongle,et al. Identification and pathogenicity of pathogen casuing anthracnose onVaccinium[J]. Scientia Agricultura Sinica, 2014, 47(20): 3992-3998.(in Chinese)

25 張廣志, 文成敬. 木霉對(duì)玉米紋枯病的生物防治[J]. 植物保護(hù)學(xué)報(bào), 2005, 32(4): 1-4. ZHANG Guangzhi, WEN Chengjing. Biocontrol of maize sheath blight withTrichodermaspp.[J]. Acta Phytophylacica Sinica, 2005, 32(4): 1-4. (in Chinese)

26 LI X, KERRIGAN J, CHAI W, et al.Botrytiscaroliniana, a new species isolated from blackberry in South Carolina[J]. Mycologia, 2012, 104(3): 650-658.

27 雷百戰(zhàn), 李國(guó)英, 石在強(qiáng). 葡萄灰霉病病原鑒定和生物學(xué)特性研究[J]. 石河子大學(xué)學(xué)報(bào)，2004，22(增刊)：145-149. LEI Baizhan, LI Guoying, SHI Zaiqiang. Identification and biological characteristics of the pathogen ofBotrytiscinereaon grape[J]. Journal of Shihezi University, 2004, 22(Supp.): 145-149.(in Chinese)

28 陳長(zhǎng)卿, 張博, 楊麗娜, 等. 越橘灰霉病病原菌鑒定及其生物學(xué)特性研究[J]. 吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào), 2012, 34(5):511-516. CHEN Changqing, ZHANG Bo, YANG Li’na, et al. Identification and biological characteristics of pathogenicBacteriaof blueberry gray mold[J]. Journal of Jilin Agricultural University, 2012, 34(5):511-516. (in Chinese)

29 柯仿鋼, 黃思良, 付崗,等. 西貢蕉枯萎病生防木霉菌株gz-2的鑒定及生物學(xué)特性研究[J]. 西南農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào), 2010, 23(5):1533-1539. KE Fanggang, HUANG Siliang, FU Gang, et al. Identification and biological characteristics ofTrichodermastrainin gz-2, abiocontrol agent against Saigon banana Fusarium wilt[J]. Southwest China Journal of Agricultural Science, 2010, 23(5):1533-1539. (in Chinese)

30 林月莉. 陜西省蘋(píng)果輪紋病菌的致病性分化及其對(duì)果實(shí)的侵染過(guò)程研究[D].楊凌: 西北農(nóng)林科技大學(xué), 2010. LIN Yueli. Study on the differentiation of pathogenicity and infection process on fruits ofBotryosphaeriadothideain Shaanxi[D].Yangling: Northwest A&F University,2010.

31 王艷娜. 鴨梨果實(shí)輪紋病寄生-病原菌互作機(jī)理[D]. 北京: 中國(guó)林業(yè)科學(xué)研究院, 2007. WANG Yanna.Interaction of host-pathogen on ‘Ya’ pear ring rot disease[D]. Beijing:Chinese Academy of Forestry, 2007.(in Chinese)

32 李廣旭, 沈永波, 高艷敏,等.Botryosphaeriadothidea在蘋(píng)果果實(shí)上的侵染過(guò)程[J]. 果樹(shù)學(xué)報(bào), 2006, 23(1):69-72. LI Guangxu, SHEN Yongbo,GAO Yanmin, et al. Infection process ofBotryosphaeriadothideain apple fruit[J]. Journal of Fruit Science, 2006, 23(1):69-72.(in Chinese)

33 胡美姣. 芒果果實(shí)潛伏侵染、Botryodiplodiatheobromae致腐機(jī)理及蒂腐病防治技術(shù)基礎(chǔ)研究[D]. ?？? 海南大學(xué), 2013. HU Meijiao. Study on latent infection,pathogenic mechanism ofBotryodiplodiatheobromaeand control for stem-end rot of mango fruit[D]. Haikou: Hainan University, 2013.(in Chinese)

Identification and Biological Characteristics of Fungal Pathogens in Blueberry during Postharvest Storage

GAO Haiyan XIAO Shangyue CHEN Hangjun LI Yunlong LIU Ruiling WU Weijie
(FoodScienceInstitute,ZhejiangAcademyofAgriculturalScience,Hangzhou310021,China)

Mold rot is one of the main factors which lead to the postharvest loss and short shelf-life of blueberry fruits. The objective of this study is to determine the primary fungal pathogens which may cause postharvest decay of blueberry during storage process, and to investigate the biological characteristics of pathogens, providing theoretical basis for disease control and further research. The typical postharvest decay sympotoms of blueberry were described. Five strains designated as LMA, LMB, LMC1, LMC2 and LMC3 were respectively isolated from diseased blueberry fruit harvested in Anji County of Zhejiang Province. Isolates were characterized by colony morphology and conidial characteristics at 28℃ in dark. The internal transcribed spacer (ITS) region of the ribosomal DNA (ITS1/ITS4) from five isolates was amplified and sequenced. The consensus ITS sequences of five isolates were compared with the associated sequences in GenBank. MEGA 5.0 was used to draw the phylogenetic tree of five isolates and other related sequences. The isolated strains were identified asB.cinerea,T.viridescens,P.cecidicola,P.polonicumandP.expansum, respectively, according to the morphologies of colony and conidial and the rDNA-ITS sequence analysis. The biological characteristics of the isolated strains were further investigated including the effects of different medias, carbon and nitrogen sources, temperatures, pH values and light on mycelial growth of five fungal pathogens using cross method, and the results showed that the suitable culture media and temperature for the five strains were blueberry extract-glucose media and 25～30℃, respectively. The optimal carbon source was fructose for LMA, LMC1 and LMC2 strains, sucrose for LMB strain, and soluble starch for LMC3 strain. The optimal nitrogen source was peptone for LMA, LMC1 and LMC2 strains, yeast extract powder for LMB1 and LMC3 strains. The effects of light on the mycelia growth of LMA, LMC1 and LMC2 were significant, but that was insignificant on the growth of LMB and LMC3 strains.

blueberry; postharvest disease; isolation and identification; rDNA-ITS; biological characteristics

2017-02-13

2017-03-25

國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(31601523)、公益性行業(yè)(農(nóng)業(yè))科研專項(xiàng)(201303073)和浙江省重大科技專項(xiàng)重點(diǎn)農(nóng)業(yè)項(xiàng)目(2014C02024)

郜海燕(1958—)，女，研究員，博士生導(dǎo)師，主要從事食品物流保鮮與質(zhì)量控制研究，E-mail: spsghy@163.com

10.6041/j.issn.1000-1298.2017.05.041

S663； S432.4+4

A

1000-1298(2017)05-0327-08