金線魚魚皮抗凍蛋白酶法制備工藝優(yōu)化

張 怡，吳 珊，傅維擎，黃燦燦，曾紅亮，鄭寶東

金線魚魚皮抗凍蛋白酶法制備工藝優(yōu)化

張 怡，吳 珊，傅維擎，黃燦燦，曾紅亮，鄭寶東

（福建農(nóng)林大學(xué)食品科學(xué)學(xué)院，福州350002）

為了探討金線魚魚皮抗凍蛋白的酶法高效制備工藝，該文首先探究不同蛋白酶酶解獲得的酶解產(chǎn)物的熱滯活性（thermal hysteresis activity，THA）以及不同分子區(qū)間的酶解產(chǎn)物的熱滯活性。隨后以抗凍蛋白得率為指標(biāo)優(yōu)化了底物與酶的比例、酶解時間、酶解溫度以及pH值，并采用響應(yīng)面法探究抗凍蛋白的最佳酶解工藝。最后使用差示掃描量熱儀（differential scanning calorimeter，DSC）測定驗證抗凍蛋白的熱滯活性。結(jié)果表明：在堿性蛋白酶、中性蛋白酶、木瓜蛋白酶以及復(fù)合蛋白酶4種酶的最佳酶解條件下，堿性蛋白酶酶解所獲得抗凍蛋白熱滯活性最大，選擇堿性蛋白酶作為制備金線魚魚皮抗凍蛋白的最佳蛋白酶；截留分子量為≥5～10 kDa魚皮蛋白的抗凍效果最佳，熱滯活性達(dá)1.20±0.07 ℃，確定≥5～10 kDa魚皮蛋白得率作為酶解制備工藝的指標(biāo)；得到金線魚魚皮抗凍蛋白最佳的酶解制備工藝條件為：底物與酶比例為32∶1、酶解時間為147 min、酶解溫度為50 ℃和pH值為9，在此條件下，金線魚魚皮抗凍蛋白得率為49.25%±1.34%。相比于牛血清蛋白（bovine serum albumin，BSA），其降低了溶液起始結(jié)晶的溫度；在最佳的保留溫度條件下，其熱滯活性為1.2 ℃。堿性蛋白酶酶解制備魚皮抗凍蛋白是一種快速有效的方式，酶解獲得的抗凍蛋白熱滯活性高。該結(jié)果為綜合發(fā)展和利用金線魚魚皮提供一定的理論依據(jù)。

蛋白；酶；優(yōu)化；魚皮；金線魚；熱滯活性

0 引 言

金線魚（Nemipterus virgatus）隸屬于硬骨魚綱（Osteichthyes）、鱸形目（Perciformes）、金線魚科（Nemipteridae），主要分布于印度洋和太平洋的熱帶、亞熱帶海域[1]。金線魚肉質(zhì)鮮美、營養(yǎng)豐富，是中國東南沿海的重要經(jīng)濟(jì)魚類，是南海北部區(qū)域最主要的漁獲種類之一[2-3]。金線魚產(chǎn)量巨大，營養(yǎng)豐富，是做為魚糜制品加工的主要原料魚種之一。魚漿在加工過程中存在大量的副產(chǎn)物魚皮，為綜合利用魚漿加工副產(chǎn)物，提高其附加值，深加工是必由之路。研究者發(fā)現(xiàn)，雖然海洋硬骨魚類對海水溫度敏感，但它們能產(chǎn)生抗凍物質(zhì)以避免凍傷。后來學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)了這種物質(zhì)，即抗凍蛋白。其不僅存在于魚類的肝臟血液中，還存在于魚皮中。通過前期的試驗也發(fā)現(xiàn)，金線魚魚皮存在一定的抗凍活性。因此，通過酶解方式從金線魚魚皮中制備抗凍蛋白，這對綜合利用魚糜制品的副產(chǎn)物具有重要意義。

抗凍蛋白（antifreeze protein，AFP）又稱為熱滯蛋白或冰結(jié)構(gòu)蛋白，是一類能夠提高生物體抗凍能力的蛋白質(zhì)的總稱[4]。它能以非依數(shù)性的形式降低水溶液的冰點，而幾乎不影響熔點，以至使熔點和冰點之間產(chǎn)生差值，這個差值被稱為熱滯值，這種性質(zhì)稱為熱滯活性（thermal hysteresis activity，THA）[5-7]。魚類中含有6類抗凍蛋白：抗凍糖蛋白（AFGPs），Ⅰ型抗凍蛋白（AFP-Ⅰ），Ⅱ型抗凍蛋白（AFP-Ⅱ），Ⅲ型抗凍蛋白（AFP-Ⅲ），Ⅳ型抗凍蛋白（AFP-Ⅳ）以及Hyperactive-AFP[8-11]。抗凍蛋白主要來源于植物、動物和昆蟲。國內(nèi)外目前普遍采用制膠后再制備抗凍蛋白的方法。如洪晶等[12]對食品源抗凍多肽的制備及冰晶抑制作用進(jìn)行了研究，以食品源的食用明膠為原材料，通過控制木瓜蛋白酶的切割條件，將活性多肽切割為具有特定的肽鏈長度和結(jié)構(gòu)組成，其優(yōu)化的酶解條件為：pH值7.0，酶與底物配比1∶10；酶解時間30 min；酶解溫度37 ℃。通過Sephadex G-50和Sephadex C-25色譜分離以及MALDI-TOF質(zhì)譜鑒定，分子質(zhì)量在 700～1 318 u的親水多肽表現(xiàn)顯著的抗凍活性；Wang等[13]采用堿性蛋白酶酶解牛皮明膠，用MALDITOF測定出冰結(jié)構(gòu)肽分子量的分布，得出分子量為600～2 700 Da的肽能抑制過冷冰淇淋混合物和濃縮蔗糖溶液冰的再結(jié)晶，同時分子質(zhì)量為1 600～2 400 Da的陽離子組分比陰離子組分在抑制再結(jié)晶方面更有效。

因此，本文在考察蛋白酶種類、蛋白截留分子量和抗凍活性的基礎(chǔ)上，采用一步可控酶解法對金線魚魚皮抗凍蛋白酶解制備工藝進(jìn)行研究，以期為金線魚魚皮的綜合利用與開發(fā)提供一定的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

金線魚魚皮：金線魚購于永輝超市，在室溫（25℃）條件下用手術(shù)刀剝下魚皮，并刮去附著在魚皮上的脂肪組織和結(jié)締組織，將魚皮置于4 ℃的冰箱內(nèi)保存?zhèn)溆谩?/p>

堿性蛋白酶（Alcalase) 丹麥Novozymes公司，酶活力2.4 AU/g；中性蛋白酶（Neutrase）丹麥Novozymes 公司，酶活力1.0 AU/g；木瓜蛋白酶南寧龐博生物工程有限公司，酶活力3.2 AU/g；復(fù)合蛋白酶（Protamex）丹麥Novozymes公司，酶活力1.5 AU/g；鹽酸、氫氧化鈉等試劑均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

DSC 200 F3差示掃描量熱儀：德國耐馳儀器制造有限公司；DF-101S集熱式恒溫加熱磁力攪拌器：鞏義市英峪予華儀器廠；DELTA 320pH計：梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司；LG-1.0型真空冷凍干燥機(jī)：新陽速凍設(shè)備制造有限公司；LD5-10型臺式低速離心機(jī)：北京京立離心機(jī)有限公司；強(qiáng)力電動攪拌機(jī)JB200-D型：上海標(biāo)本模型廠；WH-C漩渦混合器：江蘇金壇儀器廠；UV-7200紫外可見分光光度計：上海尤尼柯儀器有限公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 工藝流程

金線魚皮→絞碎→勻漿→懸濁液→用酸或堿調(diào)節(jié)體系pH值→酶解→10 000 r/min離心10 min→依次過20、10和5 kDa的超濾膜超濾→40℃下旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮→冷凍干燥→魚皮抗凍蛋白。

勻漿后的魚皮，按質(zhì)量比1∶5與蒸餾水配置成懸濁液。用0.1 mol/L的鹽酸以及0.1 mol/L的氫氧化鈉調(diào)節(jié)體系的pH值。酶解液置于離心機(jī)中以10 000 r/min下離心10 min，取上清液。

1.3.2 魚皮中基本成分的測定

水分（GB/T5009.3-2010直接干燥法），粗蛋白（GB/T5009.5-2010凱式定氮法），粗脂肪（GB/T5009.6-2003)，灰分（GB/T5009.4-2010）。

魚皮的基本成分為：水分69.13%±1.95%，粗蛋白23.68%±1.33%，粗脂肪1.10%±0.12%，灰分1.14%±0.33%。

1.3.3 熱滯活性的測定

稱取一定的蛋白溶液，置于DSC容器內(nèi)，并置于DSC儀器內(nèi)，當(dāng)儀器充滿液氮并穩(wěn)定后，首先降溫至-25 ℃保持5 min，再升溫至25 ℃保溫5 min，獲得抗凍蛋白溶液熔點和結(jié)晶溫度。接著將樣品降溫至－20 ℃保持5 min，然后緩慢升溫至樣品呈部分熔化狀態(tài)，即到達(dá)其保留溫度（Th），保持15 min，再將溫度從Th降至－20 ℃。重復(fù)上述過程，在不同的Th條件下停留15 min，分別記錄不同Th時樣品的起始結(jié)晶溫度（To），按照公式（1）計算熱滯活性，以無抗凍活性的牛血清白蛋白（bovine serum albumin）作為對照[14-17]。

1.3.4 蛋白酶的篩選

魚皮經(jīng)過預(yù)處理，按魚皮與水的質(zhì)量比1:5配置成懸濁液，根據(jù)各種蛋白酶所具有的底物特異性，選擇堿性、中性、木瓜和復(fù)合蛋白酶，分別酶解金線魚魚皮100 min，各蛋白酶的水解條件如1表。經(jīng)各蛋白酶酶解后，離心后取上清蛋白液，進(jìn)行熱滯活性的測定。

表1 4種蛋白酶的試驗條件及底物特異性Table1 Experimental conditions and substrate specificity of 4 kinds of protease

1.3.5 膜分離

選擇最佳的蛋白酶酶解金線魚魚皮溶液，離心后取蛋白上清液，在壓力0.10 MPa、25 ℃條件下選用截留分子量分別為20、10和5 kDa的超濾膜對滲出液依次進(jìn)行超濾，工藝路線如圖1所示。將所得不同截留分子量蛋白進(jìn)行熱滯活性的測定，確定具有熱滯活性蛋白的分子量分布區(qū)域。

圖1 不同分子量蛋白制備工藝流程圖Fig.1 Preparation technology flow chart of different molecular weight proteins

1.3.6 單因素試驗

魚皮經(jīng)過預(yù)處理后，每組取3 g原料，配制成不同魚皮與堿性蛋白酶質(zhì)量比（20∶1、30∶1、40∶1、50∶1、60∶1）的溶液，分別在酶解溫度35、40、45、50、55、60 ℃和溶液pH值7、8、9、10、11的條件下，酶解50、100、150、200、250 min后，經(jīng)離心、超濾、濃縮和冷凍干燥后得到魚皮抗凍蛋白，測定其得率（%）。

金線魚魚皮抗凍蛋白得率如公式（2）所示：

式中m為金線魚魚皮抗凍蛋白質(zhì)量，g；M為金線魚魚皮質(zhì)量，g；c為金線魚魚皮中蛋白質(zhì)所占比例，%。

1.3.7 正交試驗

根據(jù)單因素試驗結(jié)果，采用二次回歸分析法研究底物與酶比例、酶解時間、酶解溫度和溶液pH值對金線魚魚皮抗凍蛋白得率的影響，得到回歸方程，采用響應(yīng)面分析法得出最佳工藝參數(shù)。各試驗因素和水平表見表2。

表2 因素和水平表Table 2 Factors and levels

1.3.8 驗證試驗

根據(jù)響應(yīng)面法預(yù)測的最佳制備工藝條件，按照“1.3.1”的操作方法，測定金線魚魚皮抗凍蛋白的實際得率，以驗證響應(yīng)面預(yù)測的準(zhǔn)確性。并采用DSC法對最佳制備工藝所得的抗凍蛋白進(jìn)行熱滯活性的測定。

1.3.9 數(shù)據(jù)分析

采用Design-Expert 8.0.6軟件對正交試驗數(shù)據(jù)進(jìn)行分析；試驗平行測定3次。

2 結(jié)果與分析

2.1 酶的種類對金線魚魚皮抗凍蛋白熱滯活性的影響

各蛋白液的熱滯活性參數(shù)如表3所示，堿性蛋白酶、中性蛋白酶、木瓜蛋白酶和復(fù)合蛋白酶酶解所得蛋白液在最佳保留溫度條件下的熱滯活性分別為：1.2、0.2、0.5和0.8 ℃。由此可知，堿性蛋白酶在60 min條件下酶解所得蛋白的熱滯活性最高。因此，選擇堿性蛋白酶作為金線魚魚皮抗凍蛋白的最佳蛋白酶。

表3 4種蛋白酶酶解所得蛋白液的熱滯活性參數(shù)Table3 Thermal hysteresis activity parameters of proteins enzymolysis by 4 proteases

2.2 截留分子量對金線魚魚皮抗凍蛋白熱滯活性的影響

不同截留分子量金線魚魚皮抗凍蛋白的熱滯活性參數(shù)如圖2所示，截留分子量為≥5～10 kDa的魚皮蛋白的抗凍效果最佳，其在最佳保留溫度條件下的熱滯活性為（1.20±0.07） ℃?？箖龌钚源沃牡鞍追肿恿糠植紴椤?0～20 kDa，其熱滯活性為（0.31±0.04）℃。由文獻(xiàn)可知，6類魚類抗凍肽的分子量分別為：抗凍糖蛋白（AFGPs）為2.5～33.7 kDa，Ⅰ型抗凍肽（AFP-Ⅰ）約為5kDa，Ⅱ型抗凍肽（AFP-Ⅱ）為15～16.7 kDa，Ⅲ型抗凍肽（AFP-Ⅲ）約為7 kDa，Ⅳ型抗凍肽（AFP-Ⅳ）約為12.3 kDa以及Hyperactive-AFP約為5～7 kDa[18-21]。由此可知，金線魚魚皮抗凍蛋白可能屬于AFGPs、AFP-Ⅰ、AFP-Ⅲ或者Hyperactive-AFP。因此，選擇5～10 kDa的魚皮蛋白含量作為金線魚魚皮抗凍蛋白酶解制備工藝的指標(biāo)。

圖2 不同截留分子量魚皮抗凍蛋白的熱滯活性Fig.2 Thermal hysteresis activity of different molecular weights of antifreeze protein from fish skin

2.3 單因素對金線魚魚皮抗凍蛋白得率的影響

選擇堿性蛋白酶，截留分子量為≥5～10 kDa，底物與酶比例、酶解時間、酶解溫度以及pH值對金線魚魚皮抗凍蛋白得率的影響如圖3所示。當(dāng)酶解時間為120 min，酶解溫度55 ℃，酶解pH值9時，底物與酶比例在10∶1～30∶1范圍內(nèi)，隨著底物與酶比例的增加，抗凍蛋白得率逐漸增加；當(dāng)二者比例高于30∶1時，抗凍蛋白得率隨著底物的增加而降低。當(dāng)?shù)孜锱c酶比例為30∶1，酶解溫度55 ℃，酶解pH值9時，酶解時間在50～150 min范圍內(nèi)，隨著酶解時間的延長，抗凍蛋白得率逐漸增加；當(dāng)酶解時間大于150 min時，抗凍蛋白得率隨著時間的延長而逐漸降低。當(dāng)?shù)孜锱c酶比例為30∶1，酶解時間150 min，酶解pH值9時，酶解溫度在35～50 ℃范圍內(nèi)，隨著溫度的升高，抗凍蛋白得率逐漸增加；當(dāng)酶解溫度高于50℃時，抗凍蛋白得率隨著溫度的升高而逐漸降低。當(dāng)?shù)孜锱c酶比例為30∶1，酶解時間150 min，酶解溫度50 ℃時，pH值為7～9時，隨著pH值增大，抗凍蛋白得率逐漸增加；當(dāng)pH值高于9時，抗凍蛋白得率隨著pH值增大而逐漸降低。在酶解起始階段，增加酶解底物有助于酶解反應(yīng)的進(jìn)行，但當(dāng)酶解底物高于一定濃度時，酶解底物的增加會使溶液黏度增強(qiáng)，阻礙酶與底物的充分接觸，導(dǎo)致蛋白得率降低。因金線魚魚皮抗凍蛋白主要集中在5～10 kDa分子量范圍內(nèi)，延長酶解時間，會導(dǎo)致酶解得到更小分子量的多肽，甚至將蛋白質(zhì)酶解為氨基酸，導(dǎo)致抗凍蛋白得率降低。在溫度高于50 ℃時，可能是因為溫度過高使得堿性蛋白酶發(fā)生了變性，從而影響到堿性蛋白酶的活性而導(dǎo)致得率降低。溶液的pH值可以顯著地影響堿性蛋白酶的活性，當(dāng)pH值為9時是堿性蛋白酶的最適pH值，詳見表1，此時堿性蛋白酶的活性最強(qiáng)，因此pH值選擇9為宜。

2.4 正交試驗結(jié)果與分析

根據(jù)單因素試驗結(jié)果，選取酶與底物比例（X1）、酶解時間（X2，min）、酶解溫度（X3，℃）、pH值（X4）為自變量，采用響應(yīng)面法進(jìn)行四因素三水平的試驗設(shè)計，以抗凍蛋白得率（Y，%）為響應(yīng)值，進(jìn)行響應(yīng)面分析。試驗設(shè)計及結(jié)果見表4。

圖3 單因素對金線魚皮抗凍蛋白得率的影響Fig.3 Effect of single factor on yield of antifreeze protein of Nemipterus virgatus’ skin

2.5 顯著性分析及模型的建立

采用Design-Expert 8.0.6對表4中的試驗數(shù)據(jù)進(jìn)行多元回歸擬合，對回歸系數(shù)和回歸模型進(jìn)行方差分析，分析結(jié)果如表5所示。

由表5可知，回歸模型P<0.000 1，表明該回歸模型達(dá)極顯著水平；在一次項中，X1和X3對抗凍蛋白得率的影響達(dá)到極顯著水平，X2對抗凍蛋白得率的影響達(dá)到顯著水平；在交互項中，X1X3對抗凍蛋白得率的影響達(dá)到極顯著水平；在二次項中，對抗凍蛋白得率的影響達(dá)到極顯著水平；失擬項不顯著，并且該模型的決定系數(shù)R2=0.990 9，修正決定系數(shù)RAdj2=0.981 9，變異系數(shù)CV=2.757 8%，說明響應(yīng)值的變化有99.09%來源于所選變量，模型可以較好的解釋試驗所得抗凍蛋白得率的變化。因此，該回歸方程可以較好的描述各因素與抗凍蛋白得率之間的真實關(guān)系，可用于確定最佳提取工藝條件。在所選取的各因素水平范圍內(nèi)，各因素對抗凍蛋白得率的影響程度從大到小依次排列為：底物與酶比例>酶解溫度>酶解時間>pH值。

表4 試驗設(shè)計和結(jié)果Table4 Experimental design and results

各因素經(jīng)二次多項式回歸擬合后，得到抗凍蛋白得率對底物與酶比例、酶解時間、酶解溫度和pH值4個因素編碼值的二次多項回歸方程為：

式中Y為抗凍蛋白得率，%；X1為底物與酶比例；X2為酶解溫度，℃；X3為酶解時間，min；X4為pH值。

表5 方差分析表Table5 Variance analysis

2.6 響應(yīng)面圖分析

由回歸模型方差分析結(jié)果（表5）可知，各因素對抗凍蛋白得率的影響程度大小依次為：X1>X3>X2>X4。X1、X2、X3和X4二次項的系數(shù)均為負(fù)值，方程表示的拋物面開口向下有極大值點。

各因素的交互作用對抗凍蛋白得率的影響如圖4所示。當(dāng)酶解溫度為50 ℃，pH值為9時，在底物與酶比例為22.5∶1～38.0∶1與酶解時間122.5～177.0 min范圍內(nèi)，抗凍蛋白得率較大。當(dāng)酶解時間為150 min，pH值為9時，在底物與酶比例為22.5∶1～38.0∶1與酶解溫度46.5～53.0 ℃范圍內(nèi)，抗凍蛋白得率較大。當(dāng)酶解時間為150 min，酶解溫度為50 ℃時，在底物與酶比例為22.5∶1～38.0∶1與pH值8.2～9.9范圍內(nèi)，抗凍蛋白得率較大。當(dāng)?shù)孜锱c酶比例為30∶1，pH值為9時，在酶解時間114.0～181.0 min與酶解溫度46.5～53.0 ℃范圍內(nèi)，抗凍蛋白得率較大。當(dāng)?shù)孜锱c酶比例為30∶1，酶解溫度為50 ℃時，在酶解時間114.0～181.0 min與pH值8.2～9.9范圍內(nèi)，抗凍蛋白得率較大。當(dāng)?shù)孜锱c酶比例為30∶1，酶解時間為150 min時，在酶解溫度46.5～53.0 ℃與pH值8.2～9.9范圍內(nèi)，抗凍蛋白得率較大。

圖4 各因素對抗凍蛋白得率影響的響應(yīng)面Fig.4 Response surface of effect of each factor on yield of AFP

綜上所述，圖4直觀地反映了各因素的交互作用對抗凍蛋白得率的影響。由圖可知，底物與酶比例與酶解溫度交互作用（X1X3）對抗凍蛋白得率的影響最為顯著，表現(xiàn)為曲面較陡；其他交互作用對抗凍蛋白得率的影響不顯著，表現(xiàn)為曲面較為平滑。這與方差分析的結(jié)果一致。

2.7 酶解制備工藝的確定

結(jié)合回歸模型，由Design-Expert軟件分析得到金線魚魚皮抗凍蛋白最佳的酶解制備工藝參數(shù)為：底物與酶比例為31.61∶1、酶解時間為147.30 min、酶解溫度為49.82 ℃和pH值為9.04，在此條件下，金線魚魚皮抗凍蛋白的理論得率為49.32%。考慮到實際操作條件，將最佳工藝條件修正為：底物與酶比例為32∶1、酶解時間為147 min、酶解溫度為50 ℃和pH值為9，在此條件下重復(fù)3次試驗，金線魚魚皮抗凍蛋白得率分別為48.86%、49.15%、50.15%，平均值為49.25%±1.34%，與理論預(yù)測值基本一致，說明回歸模型可靠。

2.8 熱滯活性的測定

以無抗凍活性的BSA為對照，測定了金線魚魚皮抗凍蛋白的熔融點及結(jié)晶點，結(jié)果如圖5a所示。由BSA和抗凍蛋白的吸熱峰可知，BSA在-2.8 ℃開始熔化，在3.7℃完全熔化，而魚皮抗凍蛋白在-3.2 ℃開始熔化，3.6 ℃完全熔化，二者熔融峰無顯著差異，都比較平緩。由BSA和抗凍蛋白的放熱峰可知，BSA的起始結(jié)晶溫度為-14.8℃，而魚皮抗凍蛋白溶液在-21.2 ℃開始結(jié)晶。相比于BSA，魚皮抗凍蛋白降低了溶液起始的結(jié)晶溫度。這可能是由于魚皮抗凍蛋白通過氫鍵將其極性側(cè)鏈吸附于冰晶表面，而其非極性側(cè)鏈暴露在外，使冰晶形成了亞顯微曲線表面，導(dǎo)致冰晶表面自由能增加，從而阻止其他水分子進(jìn)一步與冰晶結(jié)合，降低了冰點[22-26]。

魚皮抗凍蛋白的DSC熱流曲線如圖5b所示，在最佳的保留溫度-1.7 ℃條件下，測定金線魚魚皮抗凍蛋白的起始結(jié)晶溫度為-2.9 ℃，此時，由公式（1）可知，獲得最大的熱滯活性為1.2 ℃。據(jù)文獻(xiàn)記載，雞皮的熱滯活性為0.2 ℃，豬皮熱滯活性為0.61，白斑狗魚的熱滯活性為0.069[27-31]。金線魚魚皮熱滯活性顯著高于雞皮、豬皮和白斑狗魚魚皮。

圖5 DSC熱流曲線圖Fig.5 Heat flow curve of DSC

3 結(jié) 論

1）在各蛋白酶最佳酶解條件下，堿性蛋白酶酶解所得抗凍蛋白的熱滯活性最大，因此，選擇堿性蛋白酶作為制備金線魚魚皮抗凍蛋白的最佳蛋白酶；截留分子量為≥5～10 kDa的魚皮蛋白的抗凍效果最佳，由3組平行試驗測得其熱滯活性達(dá)1.20±0.07 ℃，因此，選擇≥5～10 kDa的魚皮蛋白含量作為金線魚魚皮抗凍蛋白酶解制備工藝的指標(biāo)。

2）金線魚魚皮抗凍蛋白最佳的酶解制備工藝參數(shù)為：底物與酶質(zhì)量比為32∶1、酶解時間為147 min、酶解溫度為50 ℃和pH值為9，在此條件下，金線魚魚皮抗凍蛋白得率為49.25%±1.34%；各因素對抗凍蛋白得率的影響程度從大到小依次排列為：底物與酶質(zhì)量比>酶解溫度>酶解時間>pH值。

3）相比于牛血清蛋白，魚皮抗凍蛋白降低了溶液起始結(jié)晶溫度；在最佳的保留溫度條件下，金線魚魚皮抗凍蛋白的熱滯活性為1.2 ℃。

[1] 寧平，吳仁協(xié)，劉靜. 中國金線魚屬魚類分類研究進(jìn)展[J].廣東海洋大學(xué)學(xué)報，2011，31(3)：99－102.

Ning Ping, Wu Renxie, Liu Jing. China Nemipterus Virgatuse in fish classification[J]. Journal of Guangdong Ocean University, 2011, 31(3): 99－102. (in Chinese with English abstract)

[2] 陳玉峰，吳燕燕，鄧建朝，等. 腌制和干燥工藝對咸金線魚中生物胺的影響[J]. 食品工業(yè)科技，2015，36(20)：83－91.

Chen Yufeng, Wu Yanyan, Deng Jianzhao, et al. Effect of salting and drying process of biogenic amines in salty Nemipterus Virgatuse[J]. Science and Technology of Food Industry, 2015, 36(20): 83－91. (in Chinese with English abstract)

[3] 王金路，王雪琦，儀淑敏，等. 金線魚魚丸冷藏過程中品質(zhì)變化規(guī)律研究[J]. 水產(chǎn)科學(xué)，2015，34(1)：14－18.

Wang Jinlu, Wang Xueqi, Yi Shumin, et al. Instrument, Study on the change of the quality of Nemipterus Virgatuse during storage[J]. Fishery Science, 2015, 34(1): 14－18.(in Chinese with English abstract)

[4] 汪少蕓，趙立娜，周焱富，等. 食源性明膠多肽的制備，分離及其抗凍活性[J]. 食品科學(xué)，2013，34(9)：135－139.

Wang Shaoyun, Zhao Lina, Zhou Yanfu, et al. Preparation, isolation and antifreeze activity of food borne gelatin polypeptide[J]. Food Science, 2013, 34 (9): 135－139. (in Chinese with English abstract)

[5] 金周筠，劉寶林. 抗凍蛋白及其應(yīng)用前景[J]. 食品研究與開發(fā)，2014，35(20)：142－146.

Jin Zhoujun, Liu Baolin. Antifreeze protein and its application prospect[J]. Food research and development, 2014, 35(20): 142－146. (in Chinese with English abstract)

[6] Crevel R W R, Fedyk J K, Spurgeon M J. Antifreeze proteins: characteristics, occurrence and human exposure[J]. Food and Chemical Toxicology, 2002, 40(7): 899－903.

[7] Cao H, Zhao Y, Zhu Y B, et al. Antifreeze and cryoprotective activities of ice-binding collagen peptides from pig skin[J]. Food Chemistry, 2016, 194: 1245－1253.

[8] Graether S P, Sykes B D. Cold survival in freeze-intolerant insects[J]. European Journal of Biochemistry, 2004, 271(16): 3285－3296.

[9] 汪少蕓，趙珺，吳金鴻，等. 抗凍蛋白的研究進(jìn)展及其在食品工業(yè)中的應(yīng)用[J]. 北京工商大學(xué)學(xué)報(自然科學(xué)版)，2011，29(4)：50－57.

Wang Shaoyun, Zhao Jun, Wu Jinhong, et al. Research progress of antifreeze protein and its application in food industry[J]. Journal of Beijing Technology and Business University (Nature Science Edition), 2011, 29(4): 50－57. (in Chinese with English abstract)

[10] Jia Z, Davies P L. Antifreeze proteins: an unusual receptor–ligand interaction[J]. Trends in Biochemical Sciences, 2002, 27(2): 101－106.

[11] Fletcher G L, Hew C L, Davies P L. Antifreeze proteins of teleost fishes[J]. Annual Review of Physiology, 2001, 63(1): 359－390.

[12] 洪晶，汪少蕓，吳金鴻，等. 食品源抗凍多肽的制備及冰晶抑制作用研究[J]. 中國食品學(xué)報，2013(1)：11－18.

Hong Jing, Wang Shaoyun, Wu Jinhong, et al. Study on the preparation of antifreeze polypeptides from food source and the inhibition of ice crystals[J]. Journal of Chinese Institute of Food Science and Technology, 2013(1):11－18. (in Chinese with English abstract)

[13] Wang S Y, Damodaran S. Ice-structuring peptides derived from bovine collagen[J]. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 2009, 57(12): 5501－5509.

[14] Zhang C, Zhao X Y, Ma Y, et al. Determination of thermal hysteresis activity of antifreeze protein by differential scanning calorimetry[J]. Acta Biochimica et Biophysica Sinica, 2008, 24(6): 465－473.

[15] Lu M, Wang B, Li Z, et al. Differential scanning calorimetric and circular dichroistic studies on plant antifreeze proteins[J]. Journal of Thermal Analysis and Calorimetry, 2002, 67(3): 689－698.

[16] Guerrero P, De la Caba K. Thermal and mechanical propertiesofsoy protein films processed at different pH by compression[J]. Journal of Food Engineering, 2010, 100(2): 261－269.

[17] 田童童，鞏子路，張建. DSC法檢測抗凍蛋白的熱滯活性的研究[J]. 中國釀造，2014，33(1)：127－132.

Tian Tongtong, Gong Zilu, Zhang Jian. Study on the thermal hysteresis activity of antifreeze protein with DSC method[J]. China Brewing, 2014, 33(1): 127－132. (in Chinese with English abstract)

[18] Davies P L, Hew C L. Biochemistry of fish antifreeze proteins[J]. The FASEB Journal, 1990, 4(8): 2460－2468.

[19] Robles V, Barbosa V, Herráez M P, et al. The antifreeze protein type I (AFP I) increases seabream (Sparus aurata) embryos tolerance to low temperatures[J]. Theriogenology, 2007, 68(2): 284－289.

[20] Hon W C, Griffith M, Chong P, et al. Extraction and isolation of antifreeze proteins from winter rye (Secale cereale L.) leaves[J]. Plant Physiology, 1994, 104(3): 971－980.

[21] Davies P L, Baardsnes J, Kuiper M J, et al. Structure and function of antifreeze proteins[J]. Philosophical Transactions of the Royal Society of London B: Biological Sciences, 2002, 357(1423): 927－935.

[22] Amornwittawat N, Wang S, Duman J G, et al. Polycarboxylates enhance beetle antifreeze protein activity[J]. Biochimica et Biophysica Acta (BBA)-Proteins and Proteomics, 2008, 1784(12): 1942－1948.

[23] Kristiansen E, Raml?v H, Hagen L, et al. Isolation and characterization of hemolymph antifreeze proteins from larvae of the longhorn beetle Rhagium inquisitor (L.)[J]. Comparative Biochemistry and Physiology Part B: Biochemistry and Molecular Biology, 2005, 142(1): 90－97.

[24] 崔寧寧，宋希明，鄒元平，等. 應(yīng)用差示掃描量熱法檢測昆蟲總蛋白的熱滯活性[J]. 昆蟲學(xué)報，2013，56(2)：131－135.

Cui Ningning, Song Ximing, Zhou Yuanping, et al. Application of differential scanning calorimetry to detect the thermal hysteresis activity of insect total protein[J]. Acta Entomologica Sinica, 2013, 56(2): 131－135. (in Chinese with English abstract)

[25] Pentelute B L, Gates Z P, Tereshko V, et al. X-ray structure of snow flea antifreeze protein determined by racemic crystallization of synthetic protein enantiomers[J]. Journal of the American Chemical Society, 2008, 130(30): 9695－9701.

[26] Modig K, Qvist J, Marshall C B, et al. High water mobility on the ice-binding surface of a hyperactive antifreeze protein[J]. Physical Chemistry Chemical Physics, 2010, 12(35): 10189－10197.

[27] 阮功成，曹慧，徐斐，等. 不同來源膠原蛋白抗凍活性的研究[J]. 食品科學(xué)，2014, (17)：22－26.

Ruan Gongcheng, Cao Hui, Xu Fei, et al. Study on antifreeze activity of collagen from different sources[J]. Food Science, 2014, (17): 22－26. (in Chinese with English abstract)

[28] 李曉坤，洪燕婷，王文龍，等. 豬皮明膠抗凍多肽的制備及其低溫保護(hù)活性研究[J]. 福州大學(xué)學(xué)報(自然科學(xué)版)，2013, (6)：1131－1136.

Li Xiaokun, Hong Yanting, Wang Wenlong, et al. Preparation of antifreeze peptides from pig skin gelatin and research of its cryoprotective activity[J]. Journal of Fuzhou University (Nature Science Edition), 2013, (6): 1131－1136. (in Chinese with English abstract)

[29] 朱玉兵，曹慧，徐斐，等. 應(yīng)用差示掃描量熱法測定膠原蛋白熱滯活性[J]. 食品與發(fā)酵工業(yè)，2013，39(10)：63－68.

Zhu Yubing, Cao Hui, Xu Fei, et al. Application of differential scanning calorimetry for determination of thermal hysteresis activity of collagen[J]. Food and Fermentation Industry, 2013, 39(10):63－68. (in Chinese with English abstract)

[30] Hall D G, Lips A. Phenomenology and mechanism of antifreeze peptide activity[J]. Langmuir, 1999, 15(6): 1905－1912.

[31] 鞏子路. 新疆冷水魚中抗凍蛋白的分離純化與結(jié)構(gòu)鑒定[D]. 石河子：石河子大學(xué)，2015.

Gong Zilu. Separation, Purification and Primary structure Analysis of Antifreeze Protein of Xinjiang Cold Water Fish[D]. Shihezi: Shihezi University, 2015. (in Chinese with English abstract)

Optimization of preparation of antifreeze proteins of fish skin from Nemipterus virgatus by using protease

Zhang Yi, Wu Shan, Fu Weiqing, Huang Cancan, Zeng Hongliang, Zheng Baodong
(College of Food Science, Fujian Agriculture And Forestry University, Fuzhou 350002, China)

The purpose of this paper was to investigate the efficient preparation technology of antifreeze protein (AFP) of fish skin from Nemipterus virgatus by protease. At first, the effects of the protein types and the molecular weight of the hydrolysate on the thermal hysteresis activity of the AFP were studied. The yield of the AFP was selected as the evaluation index for the further study. Moreover, the ratio of substrate to enzyme, enzymolysis time, enzymolysis temperature and pH value were evaluated according to the yield of AFP. Then the optimum preparation technology of AFP of fish skin from Nemipterus virgatus by protease was investigated by the response surface methodology. Finally, the thermal hysteresis activity of AFP was confirmed and determined by differential scanning calorimeter. The results showed that the thermal hysteresis activity of AFP obtained by alkaline protease was the highest among alcalase protease, neutrase protease, papain protease and compound protease under the optimal proteolysis conditions. Therefore, the alkaline protease was selected as the best protease for AFP preparation. The proteins in the molecular weight range of ≥5-10 kDa displayed the highest thermal hysteresis activity up to (1.20±0.07) ℃, and the yield of the proteins was selected as the evaluation index. The optimum preparation technology of AFP of fish skin from Nemipterus virgatus by protease was as follows: The ratio of substrate to enzyme was 32:1, enzymolysis time was 147 min, enzymolysis temperature was 50 ℃ and pH value was 9. The yield of AFP was up to 49.25%±1.34% under the optimum conditions. The great linear relationship between the predicted value and actual value indicated that the predicted value of the model could reflect the actual yield of AFP accurately. The result by differential scanning calorimeter indicated the AFP of fish skin from Nemipterus virgatus reduced the temperature of the initial crystallization of the solution compared to bovine serum albumin (BSA). Under the optimal retention temperature condition, the thermal hysteresis activity of AFP of fish skin from Nemipterus virgatus was 1.2 ℃. The enzymolysis method by alkaline protease was a rapid and effective method to prepare AFP of fish skin and the AFP exhibited the high thermal hysteresis activity. These results will provide a certain theoretical basis for the comprehensive development and utilization of fish skin from Nemipterus virgatus.

proteins; enzymes; optimization; fish skin; Nemipterus virgatus; thermal hysteresis activity

10.11975/j.issn.1002-6819.2017.05.043

TS254.9

A

1002-6819(2017)-05-0301-07

張 怡，吳 珊，傅維擎，黃燦燦，曾紅亮，鄭寶東. 金線魚魚皮抗凍蛋白酶法制備工藝優(yōu)化[J]. 農(nóng)業(yè)工程學(xué)報，2017，33(5)：301－307.

10.11975/j.issn.1002-6819.2017.05.043 http://www.tcsae.org

Zhang Yi, Wu Shan, Fu Weiqing, Huang Cancan, Zeng Hongliang, Zheng Baodong. Optimization of preparation of antifreeze proteins of fish skin from Nemipterus virgatus by using protease[J]. Transactions of the Chinese Society of Agricultural Engineering (Transactions of the CSAE), 2017, 33(5): 301－307. (in Chinese with English abstract)

doi：10.11975/j.issn.1002-6819.2017.05.043 http://www.tcsae.org

2016-09-01

2017-01-24

福建省發(fā)改委產(chǎn)業(yè)技術(shù)聯(lián)合創(chuàng)新專項項目（閩財指[2015]779號）；福建農(nóng)林大學(xué)高水平大學(xué)建設(shè)項目（612014042）。

張 怡，女，教授，博士。研究方向：農(nóng)產(chǎn)品加工及貯藏工程。Email：zyifst@163.com。