牦牛與黃牛肌肉差異蛋白質組及生物信息學分析

左惠心 韓 玲 余群力 ?？颂m 趙索南 孔祥穎

(1.甘肅農業(yè)大學食品科學與工程學院， 蘭州 730070； 2.海北州畜牧獸醫(yī)科學研究所， 海北 810200)

牦牛與黃牛肌肉差異蛋白質組及生物信息學分析

左惠心1韓 玲1余群力1牛克蘭1趙索南2孔祥穎2

(1.甘肅農業(yè)大學食品科學與工程學院， 蘭州 730070； 2.海北州畜牧獸醫(yī)科學研究所， 海北 810200)

為了建立和優(yōu)化牦牛肌肉組織蛋白質雙向電泳(2DE)體系，結合生物信息學方法進行牦牛、黃牛差異蛋白質通路分析。以牦牛背最長肌為實驗材料，對不同裂解液成分、等電聚焦程序、染色方法進行研究，在最優(yōu)2DE體系參數下，對比分析牦牛、黃牛差異倍數大于2倍且達到顯著水平(P<0.05)的19個蛋白質，通過基質輔助激光解吸/電離飛行時間(MALDI-TOF/TOF)質譜進行鑒定，并對鑒定結果進行了基因本體(GO)注釋、京都基因與基因組百科全書(KEGG)通路分析。結果表明，裂解液II、漸進式快速升壓程序、改良的考染法獲得的蛋白點匹配率高，牦牛、黃牛2DE圖譜蛋白點平均個數分別為479個和553個。通過比較牦牛和黃牛背最長肌中差異蛋白質可知，所得到的差異蛋白質按照功能可分為代謝酶、結構蛋白和應激蛋白3大類。通過KEGG分析可知，牦牛、黃牛差異蛋白質主要集中在細胞代謝過程、碳水化合物代謝通路、遺傳信息通路和能量代謝通路中，研究結果可為解釋牦牛和黃牛肌肉生物學特性和肉品質差異提供理論依據。

牦牛； 黃牛； 肌肉組織； 雙向電泳； 差異蛋白質組學； 生物信息學

引言

牦牛分布在平均海拔高度3 500 m以上的高山草原，該地區(qū)空氣含氧量僅為海平面的70%左右[1]。牦牛長期處于低氧環(huán)境，不僅仍然保持正常的生理活動，而且具有特有的肉質性狀。蛋白質作為牦牛肉質性狀的體現者，在宰前宰后的生理生化反應中具有重要的作用。

雙向凝膠電泳(Two dimensional electrophoresis，2DE)是目前蛋白質組學最常用的方法之一[2]。不同組織、不同細胞的結構和成分存在特異性差別，因此，對每個研究對象進行雙向電泳條件的摸索與技術優(yōu)化是非常必要的[3]。目前研究主要集中在牦牛肉成熟前后蛋白質組學變化[4]、生鮮和冷藏牦牛肉蛋白質組學變化[5]、不同品種黃牛的蛋白質組學差異[6]方面。通過分析牦牛和黃牛肉中差異蛋白質，尋找不同于普通黃牛的牦牛肉特有蛋白質亟待研究。同時，目前結合生物信息學技術中的基因本體(Gene ontology，GO)注釋[7]、京都基因與基因組百科全書(Kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG)通路[8]、蛋白質網絡等分析方法研究差異蛋白質組學的報道較少。

本文以牦牛背最長肌為研究對象，通過對不同的裂解緩沖液成分、等電聚焦程序、染色方法進行優(yōu)化，尋找適合牦牛、黃牛肌肉組織蛋白提取的參數，并結合差異蛋白質組學和生物信息學分析，對比研究牦牛和黃牛的特有蛋白質，以期確定影響牦牛和黃牛肉質性狀的蛋白質種類及代謝通路，為解釋牦牛和黃牛肌肉生物學特性提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

牦牛肉取自甘肅省武威市天祝藏族自治縣，為天祝白牦牛品種；黃牛為同一飼養(yǎng)環(huán)境下的本地黃牛，品種是西秦雜交肉牛(西門塔爾公牛與本地秦川牛雜交后代)。采用相同的屠宰條件，各采集6頭36～38月齡牛的背最長肌，共12個樣本。從屠宰場取得剛宰殺的樣品，立即用磷酸鹽緩沖液清洗表面血跡后轉到液氮中，帶回實驗室于-80℃條件下保存?zhèn)溆?。先進行肌肉雙向電泳體系的構建，然后進行比對分析。

固定化pH梯度(IPG)膠條(pH值3～10，線性，17 cm)，載體兩性電解質(Bio-lyte)(pH值3～10)，美國Bio-rad公司；3-[(3-膽酰胺丙基)二乙胺]-1-丙磺酸(CHAPS)，二硫蘇糖醇(DTT)，牛血清白蛋白(BSA)，聚乙二醇辛基苯基醚(Triton-X-100)，α-氰基- 4-羥基肉桂酸(CHCA)，乙腈(ACN)，三氟乙酸(TFA)，美國Sigma公司；三羥甲基氨基甲烷(Tris)等其他生化試劑均為國產分析純。

1.2 儀器與設備

Protean i12 IEF型雙向電泳儀，Protein II型垂直電泳儀，美國Bio-Rad公司；UV-250型紫外分光光度計，日本島津公司；TGL-24MC型臺式高速冷凍離心機，長沙英泰儀器有限公司；CP214型電子天平，奧豪斯儀器有限公司；DHG9070A型電熱鼓風干燥箱，上海越眾儀器設備有限公司；5800 MALDI-TOF/TOF型質譜儀，AB SCIEX公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 Bradford法蛋白質濃度測定

以磷酸鹽緩沖液為空白，1 mg/mL BSA為標準蛋白溶液，制作標準曲線。以蛋白質質量(mg)為橫坐標，吸光度為縱坐標，對不同樣本用Bradford法測定蛋白質濃度[9]。

1.3.2 肌肉組織2DE體系的構建

(1)不同裂解液成分

參照CHAZE等[10]的方法并進行改進，取適量樣本組織放入滅菌且預冷的研缽中，用液氮研磨成粉末狀，加入適量樣品裂解液溶解蛋白。

裂解液I成分：7 mol/L尿素；2 mol/L硫脲；2 g/(100 mL) CHAPS；60 mmol/L DTT；0.07% β-巰基乙醇；1.5% Bio-lyte兩性電解質(pH值3～10)。

裂解液Ⅱ成分：8 mol/L尿素；2 mol/L硫脲；2 g/(100 mL) CHAPS；60 mmol/L DTT；0.07% β-巰基乙醇；2% Bio-lyte兩性電解質(pH值3～10)；2% Triton-X-100。

裂解液Ⅲ成分：8 mol/L尿素；2 mol/L硫脲；2 g/(100 mL) CHAPS；60 mmol/L DTT；0.07% β-巰基乙醇；1.5% Bio-lyte兩性電解質(pH值3～10)；40 mmol/L Tris。

(2)不同等電聚焦程序

參照JIA等[11]的方法并進行改進，按以下程序進行等電聚焦：表面溫度為18℃；膠條最大電流50 mA。

直接快速升壓程序：50 V主動水化14 h，1 000 V快速升壓1 h，9 000 V線性升壓4 h，聚焦到80 000 V·h，500 V保持。

漸進式快速升壓程序：50 V主動水化14 h，500 V快速升壓1 h，1 000 V快速升壓1 h，2 000 V快速升壓，9 000 V線性升壓6 h，聚焦到80 000 V·h，500 V保持。

漸進式緩慢升壓程序：50 V主動水化14 h，500 V線性升壓0.5 h，1 000 V線性升壓0.5 h，2 000 V快速升壓1 h，9 000 V線性升壓10 h，聚焦到80 000 V·h，500 V保持。

(3)不同染色方法

聚焦結束后，進行膠條平衡以及十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)處理，最后凝膠染色。

考馬斯亮藍法(考染法)參照ZUO等[1]的方法：0.45 g/L考馬斯亮藍R-250溶于甲醇，加入相同體積超純水、1/3體積冰醋酸進行凝膠染色24 h。再用等體積甲醇與冰乙酸配成的脫色液進行凝膠脫色，直到背景清晰為止。

改良的考染法參照饒維橋等[12]的方法并改進：0.1 g/L考馬斯亮藍R-250，5%磷酸，0.05 g/mL硫酸銨，10%甲醇進行凝膠染色24 h，再進行凝膠脫色。

銀染法參照CHEVALLET等[13]的方法并改進：40%無水乙醇、10%冰乙酸、50%純水靜置12 h固定凝膠，5 g/L五水合硫代硫酸鈉(Na2S2O3·5H2O)、120 g/L三水合乙酸鈉(NaAc·3H2O)、30%無水乙醇致敏30 min，2.5 g/L硝酸銀(AgNO3)、0.1%的37%甲醛銀染20 min，25 g/L碳酸鈉(Na2CO3)、0.1%的37%甲醛顯色5 min，4 g/L甘氨酸終止顯色20 min，4.94 g/L鐵氰化鉀(K3Fe(CN)6)、12.4 g/L Na2S2O3·5H2O脫色直到背景清晰為止。

1.3.3 凝膠成像

將凝膠放于圖像掃描器上，選擇透射模式，以300 dpi分辨率掃描16位灰度圖像，以tif格式存儲。設置優(yōu)化靈敏度、算符和背景噪聲等參數，初步識別凝膠圖像中的點。創(chuàng)建參考膠，手工匹配部分蛋白點，由PDQuest 8.0.1軟件自動匹配后進行手工校正，所得結果進一步在參考膠中驗證。

1.3.4 質譜鑒定

(1)膠內酶解

將膠粒切碎后轉入離心管中，加入200～400 μL 100 mmol/L碳酸氫銨(NH4HCO3)以及30% ACN脫色液(30～50 μL, 30 mmol/L K3Fe(CN)6與100 mmol/L Na2S2O3體積比為1∶1)，清洗脫色至透明，吸棄上清，加入100 mmol NH4HCO3，室溫(20℃)孵育15 min。吸棄上清凍干，之后加入5 μL 2.5～10 ng/μL測序級胰蛋白酶溶液(酶與被分析蛋白質質量比一般為1∶100～1∶20)，37℃反應后靜置20 h左右；吸出酶解液，轉移至新離心管中，原管加入100 μL 60% ACN與0.1%TFA，超聲15 min，合并酶解液凍干[1]。

(2)質譜分析

凍干后的酶解樣品，取2 μL 20%ACN復溶。取1 μL溶解樣品，直接點于樣品靶上，讓溶劑自然干燥后，再取0.5 μL過飽和CHCA基質溶液(溶劑為50% ACN和0.1% TFA)點至對應靶位上并自然干燥。樣品靶經氮氣吹凈后放入儀器進靶槽并用AB SCIEX 5800型串聯(lián)飛行時間質譜儀進行測試分析，激光源為355 nm波長的(釔鋁石榴石晶體)Nd∶YAG激光器，加速電壓為2 kV，采用正離子模式和自動獲取數據的模式采集數據，一級質譜(MS)掃描范圍為800～4 000 Da，選擇信噪比大于50的母離子進行二級質譜分析，每個樣品點上選擇8個母離子，累計疊加2 500次，碰撞能量2 kV[14]。

1.3.5 生物信息學分析

生物信息學在蛋白質組學的數據處理和分析中起著重要作用，包括數據的獲取、輸入、儲存、加工以及數據庫之間的聯(lián)系[15]。

(1)GO分析

GO分析共有3個本體，分別描述基因的分子功能(molecular function)、所處的細胞組成(cellular component)、參與的生物過程(biological process)，利用在線數據庫(http:∥www.geneontology.org)進行GO富集分析[15]。

(2)KEGG分析

利用在線數據庫(http:∥www.genome.jp/kegg/)進行KEGG通路分析，在“牛屬”范圍內篩選差異蛋白質對應的注釋，根據KEGG注釋結果，對差異蛋白進行KEGG通路富集分析[1,16]。以所有鑒定到的蛋白質為背景，通過費舍爾精確檢驗，找出差異蛋白中顯著富集的KEGG通路，從而得知差異表達蛋白質在哪些通路中呈現富集狀態(tài)。

1.4 數據分析

實驗全部數據為重復4次的平均值，凝膠圖像的比對分析軟件為PDQuest 8.0.1(美國Bio-Rad公司)，蛋白點豐度差異倍數為2倍以上且P<0.05判定為差異顯著[17]。質譜測試文件用Mascot 2.2軟件檢索數據庫。利用blast2GO 2.8軟件(西班牙Biobam公司)進行GO富集分析，利用KEGG在線數據庫進行通路富集分析。

2 結果與分析

2.1 Bradford法標準曲線制作

本實驗采用Bradford方法，得出標準曲線y=0.005 8x+0.038 7(R2=0.987 7)。由標準曲線公式可知，標準曲線線性關系良好，可以用于實驗蛋白質含量的測定。

2.2 不同裂解液成分對2DE圖譜的影響

本實驗中裂解液Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ成分分別得到321、498、335個點。由圖1可知，裂解液Ⅱ所得圖譜背景最清晰，分辨率最高，拖尾最少，蛋白點最多，說明8 mol/L尿素與2 mol/L硫脲的配比更適用于牦牛背最長肌肌肉蛋白的提取。尿素和硫脲都是應用廣泛的離液劑[18]，聯(lián)合使用不僅對膜蛋白有極為明顯的增溶效果，而且對核蛋白等微溶性蛋白質以及對等電點附近蛋白質沉積都有改善。Triton-X-100是一種非離子型去污劑，研究表明兩性離子型去污劑比非離子型去污劑更為有效[19]。本實驗中裂解液Ⅱ既含有Triton-X-100，也有兩性離子型去污劑CHAPS，圖1b說明Triton-X-100和CHAPS聯(lián)合使用能更好地提取組織中的蛋白質，同時裂解液中的DTT起到了還原作用。兩性電解質Bio-lyte在一定程度上可以緩解鹽離子濃度低的問題，具有在聚焦過程中提供穩(wěn)定電導的能力，圖1b說明裂解液Ⅱ中2% Bio-lyte進一步增強了蛋白質的溶解性。

圖1 不同裂解液成分對2DE圖譜的影響Fig.1 Effects of different lysis buffer components on 2DE patterns

圖2 不同等電聚焦程序對2DE圖譜的影響Fig.2 Effects of different isoelectric focusing procedures on 2DE patterns

2.3 不同等電聚焦程序對2DE圖譜的影響

本實驗中，取Bradford法測定的200 μg蛋白樣品進行雙向電泳，采用3種不同的等電聚焦程序，分別得到電泳圖，如圖2所示。結果顯示，在2組程序都達到80 000 V·h時，直接快速升壓中，縱向、橫向拖尾均較為明顯，且蛋白點模糊，不宜進行分析；漸進式緩慢升壓由50 V起緩慢升壓，延長了等電聚焦時間，卻又不能快速到達高電壓，使蛋白點過少；只有漸進式快速升壓程序的圖像中橫紋明顯減少，且蛋白質點清晰，分辨率高。這是因為鹽離子在水化過程中容易滲入膠條，使凝膠內電流分布不均，導致2DE圖譜出現不均一背景和拖帶現象[20]。本實驗中漸進式快速升壓程序從500 V到9 000 V的升壓過程中，各電壓區(qū)間分段升壓，便于蛋白向膠條內轉移，可使鹽分清除較為完全。這是由于分段快速升壓有助于蛋白質等電聚焦，減少蛋白損失，同時低電壓條件能有效去除蛋白中的鹽分并且促使大分子蛋白質進入膠條[18]。因此，選擇漸進式快速升壓程序作為樣本的等電聚焦程序。

2.4 不同染色方法對2DE圖譜的影響

考馬斯亮藍染色法和銀染法是雙向電泳中最常見的染色方法，本實驗在相同的等點聚焦程序下，采用常規(guī)考染法、改良的考染法和銀染法3種染色方法進行比較，分別得到429、532、490個點。圖3顯示，常規(guī)考染法相對靈敏度低，檢測出的蛋白點少。銀染法的背景較深，高豐度蛋白點較為模糊，不夠清晰，給準確判斷帶來一定的困難。改良的考染法與常規(guī)考染法相比，出現的蛋白點較多；與銀染法相比，拖帶少，背景較清晰。因此選擇改良的考染法進行后續(xù)質譜鑒定。

圖3 不同染色方法對2DE圖譜的影響Fig.3 Effects of different staining methods on 2DE patterns

2.5 差異表達蛋白點的確定

根據點豐度分析，牦牛和黃牛背最長肌2DE圖譜蛋白點個數分別為479和553個。如圖4所示，在牦牛和黃牛背最長肌的2DE圖譜中確定了19個差異倍數大于2倍且達到顯著水平(P<0.05)的蛋白點。

2.6 差異蛋白點質譜鑒定

本研究通過MALDI-TOF/TOF型質譜儀鑒定，共成功鑒定出可信度大于95%的19種蛋白質，點編號、蛋白名稱、檢索號、數據庫來源、分子量、等電點、蛋白表達量和差異倍數如表1所示。其中11個點在牦牛背最長肌中表達量較高，有8個點在黃牛背最長肌中表達量較高。這些差異蛋白質的pI值(等電點)大多集中在5～8之間，分子量在30～100 kDa之間。根據質譜鑒定結果，差異蛋白質主要包括三大類：代謝酶、結構蛋白和應激蛋白。大部分的代謝酶在2DE凝膠中性或堿性區(qū)被發(fā)現，并且在多點鑒定出亞型。

圖4 牦牛、黃牛背最長肌2DE差異蛋白點標記Fig.4 Differentially expressed proteins marking of 2DE in yak and beef cattle Longissimus dorsi muscle

表1 牦牛、黃牛背最長肌差異蛋白質譜鑒定結果

注：a表示差異倍數為牦牛與黃牛蛋白表達量之比；b表示差異倍數為黃牛與牦牛蛋白表達量之比。

圖5 差異表達蛋白質的GO分析結果Fig.5 Analysis of differentially expressed proteins identified by GO functional classification

3類差異蛋白均與肉品食用品質及加工品質形成有關。代謝類蛋白在糖酵解、三羧酸循環(huán)等生化反應中發(fā)揮重要作用。3-磷酸甘油醛脫氫酶等代謝酶是參與糖酵解的關鍵酶，3-磷酸甘油醛脫氫酶通過催化3-磷酸甘油醛的氧化磷酸化，影響糖酵解代謝過程[1]。烯醇化酶是糖酵解系統(tǒng)和三羧酸循環(huán)的一種關鍵酶，不僅參與催化2-磷酸甘油酸失水生成磷酸烯醇丙酮酸的反應，也可在糖原合成過程中催化逆向反應，即作為磷酸丙酮酸水合酶[21]。糖酵解酶的活性是影響宰后肌肉pH值下降速率的主要因素，進而影響著宰后僵直的進程，對肉質具有決定性作用。結構蛋白與構成細胞和生物體有關，是宰后肌肉收縮、能量代謝的基礎[22]。肌球蛋白、肌動蛋白、肌鈣蛋白等都與肌肉收縮有關，結構蛋白直接影響宰后肉品質，如嫩度、保水性、肉色等。應激蛋白被認為是維持肌原纖維蛋白的穩(wěn)定、防止微絲等細胞骨架蛋白降解的重要調節(jié)蛋白，熱休克蛋白因其具有高度保守和可以作為分子伴侶的特性，也是影響肉質的重要蛋白質[23]。

2.7 生物信息學分析

蛋白質組學三大核心技術包括雙向電泳技術、生物質譜技術和生物信息學技術[24]。蛋白質組學與生物信息學的結合使在整體、動態(tài)、網絡的水平上研究蛋白質成為可能。同時，生物信息學作為一門生物學、數學和計算機相互交叉融合而產生的新興學科，近年來隨著基因組學和蛋白質組學的興起而迅速發(fā)展起來[8]。與生命科學其他學科相比，生物信息學的高速發(fā)展并不主要依賴于理論上的重大突破，生物實驗和衍生數據的大量儲存以及基于這些數據建立的生物信息數據庫在一定程度上是生物信息學發(fā)展的動力[8]。

2.7.1 GO分析結果

Gene ontology提供了一套動態(tài)更新的標準詞匯表來全面描述生物體中基因和基因產物的屬性[15]。利用GO數據庫和Uniprot數據庫對目的蛋白質進行GO功能分類和鑒定，并對鑒定到的條目進行GO條目注釋，基于參與的細胞組成對19種蛋白質進行功能分類和鑒定，共得到156個注釋，見圖5a(圖中括號內為注釋個數，下同)。基于參與的分子功能對差異蛋白質進行功能分類和鑒定，共鑒定到70個注釋，見圖5b?；趨⑴c的生物過程進行功能分類和鑒定，共鑒定到230個注釋，見圖5c。

GO分析結果與表1中鑒定所得差異蛋白質一致。GO分析顯示，代謝過程是造成牦牛、黃牛肉用品質差異的重要生物過程。牦牛肉與黃牛肉相比，糖酵解酶強度增加，可能是因為牦牛為適應高原環(huán)境而產生高原習服現象，通過增加糖酵解來支持和維持ATP的產生，這可能是牦牛、黃牛肉2個品種之間食用品質及加工品質差異的原因之一[25]。本實驗中牦牛、黃牛雖采自同一飼養(yǎng)環(huán)境，但牦牛長期生活在高海拔地區(qū)，已具有充分利用氧氣的能力，而本地黃牛與牦牛相比，糖酵解酶強度較低，表明其機體內仍存在缺氧狀況，繼續(xù)承受著高原環(huán)境的選擇[26]。GO分析顯示，組織過程也是造成牦牛、黃牛肉用品質差異的重要生物過程。肌球蛋白、肌動蛋白是構成肌動球蛋白復合體的蛋白，對肉的結構和抗拉強度產生重要影響。MARINO等[22]研究證實肌球蛋白輕鏈在波多利安牛中表現出更高的豐度，肌球蛋白輕鏈的增加表明在內源酶的作用下，肌動球蛋白橫橋發(fā)生斷裂，因此肌球蛋白輕鏈可作為預測肉嫩度指標的重要蛋白。GO分析顯示，應激過程也是影響牦牛與黃牛肉用品質差異的重要生物過程。熱休克蛋白可保護微絲等細胞骨架蛋白，防止結構破壞和由于肌肉細胞凋亡引起的蛋白的降解，維持肌原纖維蛋白的穩(wěn)定性。熱休克蛋白β6屬于小熱休克蛋白家族，據推測，HSPβ6豐度的改變可能導致肌動蛋白絲的穩(wěn)定性降低，這可能與嫩度增加相關[23]。由表1可知，熱休克蛋白在牦牛肌肉組織中豐度較高，表明牦牛為適應高原環(huán)境，產生更為強烈的應激反應。

2.7.2 KEGG通路分析結果

在生物體內，不同蛋白相互協(xié)調行使其生物學行為，基于通路的分析有助于更進一步了解其生物學功能。KEGG是有關代謝通路的公共數據庫，通過通路分析能確定蛋白質參與的最主要生化代謝途徑和信號轉導途徑[16]。利用KEGG數據庫信息和分類體系，分析牦牛、黃牛差異表達蛋白所處的相關代謝通路，共聚集得到7類代謝通路，結果如圖6所示。

結合表1和圖6的實驗結果，說明造成牦牛、黃牛不同物種間肌肉生物學特性差異的主要蛋白質包括代謝酶、結構蛋白和應激蛋白，這些蛋白質主要涉及到的代謝通路包括細胞代謝通路、碳水化合物代謝通路、遺傳信息通路、能量代謝通路、氨基酸代謝通路等，涉及這些代謝通路的生理生化反應最終造成了牦牛、黃牛肉用品質的差異。生物體中，蛋白質通過蛋白質相互作用、修飾和調節(jié)，構建復雜的網絡來實現生理生化功能[27]。由圖6可知，細胞代謝(38%)、碳水化合物代謝(31%)和能量代謝(8%)相關的蛋白質在代謝通路分類中約占77%，從而進一步確定蛋白質代謝過程在不同種類肉質形成過程中的重要性。蛋白質在遺傳信息系統(tǒng)(15%)中的參與表明蛋白質與基因表達狀態(tài)之間的相關性，為進一步遺傳分析提供了重要的目標基因，為通過遺傳育種和飼料改良提高肉品質提供理論參考。

圖6 差異表達蛋白質的KEGG通路富集分析圖Fig.6 Analysis of differentially expressed proteins identified by KEGG pathway enrichment

3 結束語

通過2DE體系的優(yōu)化，顯示裂解液Ⅱ、漸進式快速升壓程序、改良的考染法獲得的蛋白點匹配率高。通過差異蛋白質組學分析，鑒定出19個牦牛與黃牛背最長肌之間的差異蛋白，所得到的蛋白主要分為代謝酶類、結構蛋白和應激蛋白。通過生物信息學分析，表明差異蛋白質主要富集在細胞代謝通路、碳水化合物代謝通路、遺傳信息通路和能量代謝通路。通過對比研究黃牛和牦牛的蛋白質組差異，旨在解釋牦牛適應高原低氧環(huán)境的分子生物學基礎，為研究牦牛和黃牛肌肉生物學特性和肉品質差異提供理論依據。

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Proteomics and Bioinformatics Analyses of Differentially Expressed Proteins in Yak and Beef Cattle Muscle

ZUO Huixin1HAN Ling1YU Qunli1NIU Kelan1ZHAO Suonan2KONG Xiangying2

(1.CollegeofFoodScienceandEngineering,GansuAgriculturalUniversity,Lanzhou730070,China2.InstituteofAnimalandVeterinaryScienceofHaibeiTibetanAutonomousPrefecture,Haibei810200,China)

Yak (Bosgrunniens) lives at plateau area of more than 3 500 altitude meter, in this case, yak still maintains normal physiological activity. Besides, yak meat is rich in protein and low in fat, which does not contain anabolic steroids. Proteomics research with bioinformatics approach combined with the established two dimensional electrophoresis (2DE) platforms was studied by comparing yak with beef cattle muscle. Aiming to illustrate the causes and pathway of different meat qualities in yak and beef cattle, establish the optimal 2DE system and analyze protein bioinformatics pathways, different lysis buffer components, isoelectric focusing procedures and staining methods were studied by usinglongissimusdorsimuscle of yak. Proteomic profiling by 2DE and mass spectrometry identified 19 proteins that were differentially expressed inlongissimusdorsimuscle of yak and beef cattle. Then the identified proteins were analyzed by gene ontology (GO) annotations and Kyoto encyclopedia of genes and genomes (KEGG) pathway. Results showed that the optimal protein extraction methods were lysis buffer component II, progressive fast boosting program and improved coomassie blue staining method. And protein spots in yak and beef cattle were 553 and 479, respectively. Totally 19 protein spots exhibiting a teo fold or more intensity difference in the meantime associated with 5% statistical significance (P<0.05) were considered differentially abundant. The differentially abundant proteins between yak and beef cattle could be divided into three main functional categories: metabolism proteins, structure proteins and stress proteins. The method of GO annotation provided three detailed and structured terms that included cellular component, molecular function and biological process. The differentially expressed proteins in yak and beef cattle muscle were concentrated in cellular processes, carbohydrate metabolism, genetic information processing and energy metabolism pathways by KEGG pathway analysis. In conclusion, the research result demonstrated the functions of identified proteins and provided a more detailed molecular view of the processes behind meat quality in yak and beef cattle.

yak; beef cattle; muscle tissue; two dimensional electrophoresis; differential proteomics; bioinformatics

10.6041/j.issn.1000-1298.2017.04.041

2017-02-14

2017-03-06

國家自然科學基金項目(31460402)和國家現代農業(yè)產業(yè)(肉牛牦牛)技術體系項目(CARS-38)

左惠心(1988—)，女，博士生，主要從事畜產品加工研究，E-mail： likevvhappy@163.com

余群力(1962—)，男，教授，博士生導師，主要從事畜產品貯藏加工研究，E-mail： Yuqunli@gsau.edu.cn

TS207.3

A

1000-1298(2017)04-0313-08