蘋(píng)果酒專(zhuān)用釀酒酵母Y2菌劑研究

吳榮榮，趙娟娟，程書(shū)梅

(1.衡水學(xué)院生命科學(xué)系，河北衡水053000； 2.河北農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科技學(xué)院，河北保定071000)

蘋(píng)果酒專(zhuān)用釀酒酵母Y2菌劑研究

吳榮榮1，趙娟娟1，程書(shū)梅2

(1.衡水學(xué)院生命科學(xué)系，河北衡水053000； 2.河北農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科技學(xué)院，河北保定071000)

對(duì)實(shí)驗(yàn)室保藏蘋(píng)果酒專(zhuān)用釀酒酵母Y2的發(fā)酵條件和保護(hù)劑進(jìn)行優(yōu)化。結(jié)果表明，Y2培養(yǎng)基的最適組成為葡萄糖1.5%，KNO32%，MgSO40.15%；Y2最適培養(yǎng)條件分別為，溫度25℃，接種量1.5%，培養(yǎng)時(shí)間為14 h，pH4.0，培養(yǎng)液中菌體OD值可達(dá)1.30。保護(hù)劑的最佳組合分別為脫脂奶粉14%，甘油3%，谷氨酸鈉3%，吐溫80為0.5%。冷凍干燥后菌劑的活菌數(shù)為8.45×1011cfu/g。

釀酒酵母； 培養(yǎng)基； 培養(yǎng)條件； 冷凍保護(hù)劑

蘋(píng)果酒是近年來(lái)在我國(guó)流行的一種果汁飲料，產(chǎn)量和知名度在國(guó)際上略低于葡萄酒，酒精度含量低，是第二大果酒[1]。它既有美酒的芬芳又有果汁的風(fēng)味，含有多種人體所需氨基酸、豐富的維生素、有機(jī)酸等[2]，口感清醇，營(yíng)養(yǎng)豐富。

酵母菌種的發(fā)酵性能是否良好直接影響蘋(píng)果酒品質(zhì)的好壞。用發(fā)酵能力和繁殖能力較高、抗二氧化硫能力較強(qiáng)的酵母啟動(dòng)發(fā)酵，可提高發(fā)酵速率，釀造出的蘋(píng)果酒具有較好的品質(zhì)。缺少專(zhuān)用蘋(píng)果酒發(fā)酵酵母是制約我國(guó)蘋(píng)果酒發(fā)展的一個(gè)重要原因[3]。制備高品質(zhì)的蘋(píng)果酒釀酒酵母，應(yīng)保證其具有起酵迅速、降糖能力好、沉降性能好、方便分離、產(chǎn)酒量大、酒香協(xié)調(diào)等優(yōu)良特征[4-5]。

本研究擬對(duì)實(shí)驗(yàn)室保藏的蘋(píng)果酒專(zhuān)用釀酒酵母Y2的制備技術(shù)進(jìn)行研究，主要從菌株生長(zhǎng)培養(yǎng)基最適碳源、氮源、無(wú)機(jī)鹽，以及培養(yǎng)過(guò)程中的最適生長(zhǎng)溫度、最適生長(zhǎng)pH值、最適接種量、最適培養(yǎng)時(shí)間幾個(gè)方面進(jìn)行研究。通過(guò)對(duì)釀酒酵母的生長(zhǎng)情況的測(cè)定，以期對(duì)工業(yè)化生產(chǎn)用的蘋(píng)果酒專(zhuān)用酵母培養(yǎng)基及培養(yǎng)條件進(jìn)行優(yōu)化[6-10]，獲得高數(shù)量和高活性的釀酒酵母菌劑。

1 材料與方法

1.1 材料及儀器

菌株：實(shí)驗(yàn)室保藏的酵母菌Y2。

培養(yǎng)基：YPD基礎(chǔ)培養(yǎng)基。

儀器：超凈工作臺(tái)，Swut SE型電子天平，LRH系列生化培養(yǎng)箱，722S可見(jiàn)分光光度計(jì)，SK-1型快速混勻器，PHB-4便攜式pH計(jì)，BXM-30R立式壓力蒸汽滅菌鍋，移液槍。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 蘋(píng)果酒專(zhuān)用酵母菌培養(yǎng)基的優(yōu)化

（1）單因素實(shí)驗(yàn)

考察不同碳源、氮源、無(wú)機(jī)鹽對(duì)酵母菌生長(zhǎng)的影響。每500 mL三角瓶裝100 mL培養(yǎng)基，121℃滅菌20 min。分別接入3種菌株以28℃、120 r/min振蕩培養(yǎng)24 h后，在560 nm處測(cè)定吸光度。

（2）正交實(shí)驗(yàn)

采用4因素3水平的L9(34)正交實(shí)驗(yàn)，以碳源、氮源、無(wú)機(jī)鹽為考察因素，確定培養(yǎng)基的最佳組成，因素水平見(jiàn)表1。

表1 正交實(shí)驗(yàn)因素水平

1.2.2 蘋(píng)果酒專(zhuān)用酵母培養(yǎng)條件的優(yōu)化

（1）單因素實(shí)驗(yàn)

考察不同的培養(yǎng)溫度（10℃、15℃、20℃和25℃），pH值（4.0、4.5、5.0、5.5），接種量（1%、1.5%、2%、2.5%），培養(yǎng)時(shí)間（14 h、18 h、22 h、24 h）對(duì)酵母生長(zhǎng)的影響。

（2）正交實(shí)驗(yàn)

采用4因素3水平的L9(34)正交實(shí)驗(yàn)，以溫度、pH值、培養(yǎng)時(shí)間、接種量為考察因素，確定培養(yǎng)基的最佳組成。因素水平見(jiàn)表2。

表2 正交實(shí)驗(yàn)因素水平

1.2.3 冷凍保護(hù)劑

采用4因素3水平的L9(34)正交實(shí)驗(yàn)，以脫脂奶粉、甘油、谷氨酸鈉和吐溫80為考察因素，確定對(duì)酵母菌生物量的影響，因素水平見(jiàn)表3。

表3 正交實(shí)驗(yàn)因素水平

2 結(jié)果與分析

2.1 蘋(píng)果酒專(zhuān)用酵母菌培養(yǎng)基的優(yōu)化

2.1.1 單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果

（1）碳源對(duì)酵母菌生長(zhǎng)的影響

將YPD培養(yǎng)基中的葡萄糖分別以等量的蔗糖、淀粉、玉米粉替換，測(cè)得560 nm處的OD值見(jiàn)圖1。

圖1 碳源對(duì)酵母菌生長(zhǎng)的影響

由圖1可以看出，菌株Y2在碳源為葡萄糖的培養(yǎng)基中生長(zhǎng)得最好，OD值為0.86，其次為蔗糖、淀粉，在玉米粉中生長(zhǎng)得最少。表明蘋(píng)果酒釀酒酵母在單糖的環(huán)境中生長(zhǎng)得最好。

（2）氮源對(duì)酵母菌生長(zhǎng)的影響

將YPD培養(yǎng)基中的蛋白胨分別以尿素、硫酸銨和硝酸鉀代替，測(cè)得560 nm處的OD值見(jiàn)圖2。

由圖2可以看出，Y2在氮源為硝酸鉀或硫酸銨的培養(yǎng)基中的生長(zhǎng)量相當(dāng)，OD值分別為0.726和0.603，菌株的生長(zhǎng)量大。其次為蛋白胨，在尿素中生長(zhǎng)量最少。

（3）無(wú)機(jī)鹽對(duì)酵母菌生長(zhǎng)的影響

將YPD培養(yǎng)基中的MgSO4·7H2O分別用硫酸錳、硫酸亞鐵、硫酸鋅代替，測(cè)得560 nm處的OD值見(jiàn)圖3。

圖2 氮源對(duì)酵母菌生長(zhǎng)的影響

圖3 無(wú)機(jī)鹽對(duì)酵母菌生長(zhǎng)的影響

由圖3可以看出，菌株在無(wú)機(jī)鹽為MgSO4的培養(yǎng)基中生長(zhǎng)得最好，OD值為0.973，其次為硫酸亞鐵和硫酸錳，在硫酸鋅中生長(zhǎng)情況最差。

2.1.2 培養(yǎng)基正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果

對(duì)培養(yǎng)基的碳源、氮源、無(wú)機(jī)鹽3個(gè)因素進(jìn)行3因素3水平的正交實(shí)驗(yàn)，確定蘋(píng)果酒釀酒酵母培養(yǎng)基的最佳組合。實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表4、表5。

表4 釀酒酵母Y2發(fā)酵實(shí)驗(yàn)結(jié)果

由表4、表5可知，對(duì)于Y2，碳源影響最為顯著，其次為無(wú)機(jī)鹽，氮源的影響最小。方差分析結(jié)果顯示，在95%的置信區(qū)間內(nèi)，3個(gè)因素的F比都小于F臨界值，對(duì)OD值的影響不顯著。其最佳發(fā)酵參數(shù)為組合8。因此培養(yǎng)基成分的最佳組合為碳源1.5%、氮源2%、無(wú)機(jī)鹽0.15%。

表5 釀酒酵母Y2正交實(shí)驗(yàn)方差分析

2.2 蘋(píng)果酒專(zhuān)用酵母菌培養(yǎng)條件的優(yōu)化

2.2.1 單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果

（1）生長(zhǎng)溫度對(duì)酵母的影響

不同溫度10℃、15℃、20℃和25℃下，120 r/min振蕩培養(yǎng)16 h，560 nm下測(cè)定OD值，實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)圖4。

圖4 生長(zhǎng)溫度對(duì)釀酒酵母Y2菌株的影響

由圖4可以看出，釀酒酵母Y2菌株隨著培養(yǎng)溫度的升高，生長(zhǎng)量逐漸增加，在25℃時(shí)，生長(zhǎng)最好，OD值最大為0.806。

（2）生長(zhǎng)pH值對(duì)Y2酵母菌株的影響

不同pH值4.0、4.5、5.0和5.5的YPD液體培養(yǎng)基接種量3%，28℃下，120 r/min振蕩培養(yǎng)16 h，于560 nm下測(cè)定OD值，實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)圖5。

由圖5可以看出，Y2菌株對(duì)不同的pH值適應(yīng)性不同。Y2最適pH值為4.5，OD值為0.953，隨著pH值的升高其生長(zhǎng)量減少。

（3）接種量對(duì)Y2酵母菌的影響

將Y2按1%、1.5%、2%、2.5%接種量接種到Y(jié)PD液體培養(yǎng)基中，在28℃、120 r/min振蕩培養(yǎng)16 h后，于560 nm下測(cè)吸光度值，結(jié)果見(jiàn)圖6。

圖5 生長(zhǎng)pH值實(shí)驗(yàn)結(jié)果對(duì)釀酒酵母Y2的影響

圖6 接種量實(shí)驗(yàn)結(jié)果對(duì)釀酒酵母Y2的影響

由圖6可以看出，Y2的最適接種量為1.5%，OD值為0.828，后隨著接種量的增加，菌株生長(zhǎng)量減少，OD值下降。

（4）培養(yǎng)時(shí)間對(duì)酵母的影響

按3%接種量接種到Y(jié)PD液體培養(yǎng)基中，在28℃、120 r/min振蕩培養(yǎng)14 h、18 h、22 h和24 h后，于560 nm下測(cè)吸光度值，實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)圖7。

圖7 培養(yǎng)時(shí)間對(duì)釀酒酵母Y2的影響

由圖7可以看出，酵母菌Y2的最適培養(yǎng)時(shí)間為14 h，OD值為0.918，后隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，菌株生長(zhǎng)量減少，OD值下降。

2.2.2 培養(yǎng)條件的正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果

對(duì)培養(yǎng)條件溫度、接種量、培養(yǎng)時(shí)間和pH值4個(gè)因素進(jìn)行4因素3水平的正交實(shí)驗(yàn)，確定蘋(píng)果酒釀酒酵母培養(yǎng)條件的最佳組合。釀酒酵母Y2發(fā)酵實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表6、表7。

表6 釀酒酵母Y2發(fā)酵實(shí)驗(yàn)結(jié)果

表7 釀酒酵母Y2正交實(shí)驗(yàn)方差分析

由表6、表7可看出，培養(yǎng)溫度影響最大，其次為培養(yǎng)時(shí)間和pH值，接種量的影響最小。在95%的置信區(qū)間內(nèi)，4個(gè)因素對(duì)OD值的影響都不顯著。最佳發(fā)酵參數(shù)為組合5，其OD值達(dá)到1.30。按理論最優(yōu)條件進(jìn)行驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，結(jié)果OD值小于5號(hào)組合，因此培養(yǎng)條件的最佳組合為5號(hào)，溫度25℃、接種量1.5%、培養(yǎng)時(shí)間14 h、pH4.0。

2.3 冷凍保護(hù)劑的研究

以脫脂奶粉、甘油、谷氨酸鈉和吐溫80為考察因素，采用4因素3水平的L9(34)正交實(shí)驗(yàn)，確定對(duì)酵母菌Y2菌株生物量的影響，實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表8、表9。

由表8、表9可看出，谷氨酸鈉對(duì)活菌數(shù)影響最大，其次是脫脂奶粉和甘油，吐溫80的影響最小。方差分析結(jié)果顯示，在95%的置信區(qū)間內(nèi)，脫脂奶粉和谷氨酸鈉對(duì)OD值的影響顯著。最佳參數(shù)為組合5，其活菌數(shù)為84.5×1010cfu/g。按理論最優(yōu)條件進(jìn)行驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，結(jié)果顯示活菌數(shù)低于組合5，因此保護(hù)劑的最佳組合為5號(hào)組合，脫脂奶粉14%、甘油3%、谷氨酸鈉3%和吐溫80為0.5%。

表8 釀酒酵母Y2保護(hù)劑實(shí)驗(yàn)結(jié)果

表9 釀酒酵母Y2正交實(shí)驗(yàn)方差分析

3 結(jié)論

通過(guò)單因素及正交實(shí)驗(yàn)，根據(jù)測(cè)定釀酒酵母Y2在發(fā)酵過(guò)程中560 nm處的OD值，確定了Y2在發(fā)酵過(guò)程中最適宜的碳源、氮源、無(wú)機(jī)鹽分別為葡萄糖、KNO3和MgSO4，培養(yǎng)基成分的最佳組合為碳源1.5%、氮源2%、無(wú)機(jī)鹽0.15%；最適培養(yǎng)條件為溫度25℃、接種量1.5%、培養(yǎng)時(shí)間14 h、pH4.0；保護(hù)劑的最佳組合為脫脂奶粉14%、甘油3%、谷氨酸鈉3%和吐溫80為0.5%。最終獲得了適宜蘋(píng)果酒釀造的高數(shù)量和高活性的酵母菌，冷凍干燥后菌劑的活菌數(shù)為8.45×1011cfu/g。

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Y2：an S.cerevisiae Strain Exclusively Used for Cider Production

WU Rongrong1，ZHAO Juanjuan1and CHENG Shumei2
(1.College of Life Science,Hengshui University,Hengshui,Hebei 053000;2.College of Food Science and Technology,HebeiAgricultural University,Baoding,Hebei 071000,China)

In this study,the fermenting conditions and the cryoprotectant formulation of S.cerevisiae strain Y2 exclusively used for cider were explored.The results showed that,its best culture medium was composed of 1.5%glucose,2%KNO3and 0.15%MgSO4; its best culture conditions included temperature at 25℃,1.5%inoculation quantity,14 h fermenting time,and pH value 4.0(OD value of the broth reached up to 1.30);its best cryoprotectant formulation was 14%skim milk powder,3%glycerin,3%monosodium glutamate and 0.5%Tween 80,respectively(the viable count of S.cerevisiae strain reached up to 8.45×1011cfu/g).

S.cerevisiae;culture medium;culture conditions;cryoprotectant

TS262.4；TS261.4

A

1001-9286（2017）05-0047-05

10.13746/j.njkj.2016307

項(xiàng)目名稱(chēng)“蘋(píng)果酒專(zhuān)用釀酒酵母Y2菌劑研究”，河北省科技支撐項(xiàng)目(13213002)。

2016-10-14

吳榮榮（1976-），女，河北衡水人，博士，研究方向：食品科學(xué)，E-mail：rpkxw@126.com。