鋅脅迫對(duì)土壤中微生物群落變化的影響

鄭 涵,田昕竹,王學(xué)東,劉 彬,孟 楠,何 俊,陳世寶*

?

鋅脅迫對(duì)土壤中微生物群落變化的影響

鄭 涵1,田昕竹2,3,王學(xué)東2,劉 彬1,孟 楠1,何 俊2,陳世寶1*

(1.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)業(yè)資源與農(nóng)業(yè)區(qū)劃研究所,農(nóng)業(yè)部植物營養(yǎng)與肥料重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,北京 100081；2.首都師范大學(xué)資源環(huán)境與旅游學(xué)院,北京 100048；3.北京市環(huán)境影響評(píng)價(jià)評(píng)估中心,北京 100161)

采用多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)結(jié)合變性梯度凝膠電泳(PCR-DGGE)測(cè)試方法,對(duì)我國5種典型鋅(Zn)污染土壤中的微生物進(jìn)行了DGGE圖譜分析,并通過戴斯矩陣方法和B-C矩陣2種方法對(duì)不同處理土壤中微生物群落相似性進(jìn)行了測(cè)定, 結(jié)合Vegan排序軸分析方法對(duì)Zn脅迫土壤中微生物結(jié)構(gòu)及群落相似性與土壤性質(zhì)間關(guān)系進(jìn)行了研究.結(jié)果表明:Zn脅迫會(huì)引起土壤微生物數(shù)目和種類的降低,但并不是簡單的負(fù)相關(guān).土壤中微生物的多樣性指數(shù)最大值出現(xiàn)在低濃度(200mg/kg處理)污染程度土壤中,說明Zn 在低污染脅迫下,一定程度上會(huì)促進(jìn)微生物群落數(shù)量的增加,豐富了群落結(jié)構(gòu)多樣性;高濃度(>800mg/kg)Zn脅迫對(duì)微生物群落結(jié)構(gòu)有明顯抑制作用,不同處理土壤微生物Shannon指數(shù)下降范圍為5.14%(公主嶺黑土)~17.2%(杭州水稻土). 通過戴斯矩陣分析土壤中微生物群落相似性結(jié)果表明,隨著Zn濃度的增加,土壤中微生物群落相似性顯著下降,最大降低23.3%,說明土壤中Zn脅迫在一定程度上改變了土壤微生物的群落結(jié)構(gòu).對(duì)土壤中影響Zn脅迫與微生物群落結(jié)構(gòu)變化影響因子的相關(guān)性分析結(jié)果表明,影響微生物群落結(jié)構(gòu)的主要因子為pH值>OC>CEC.

鋅；PCR-DGGE；污染土壤；微生物群落結(jié)構(gòu)；微生物多樣性

近年來我國農(nóng)田土壤鋅(Zn)污染正以不同尺度的趨勢(shì)快速蔓延[1-5],資料顯示,我國Zn污染土壤超標(biāo)率達(dá)0.9%.雖然我國最新頒布的食品安全標(biāo)準(zhǔn)中刪除了Zn的限量標(biāo)準(zhǔn)值[6],但由Zn污染產(chǎn)生的生態(tài)環(huán)境風(fēng)險(xiǎn)已引起廣泛關(guān)注.在土壤重金屬污染防治的研究中,利用植物作為生態(tài)物種而進(jìn)行的毒性測(cè)定及其相關(guān)機(jī)理研究較多[7-12],而針對(duì)土壤微生物群落的研究相對(duì)較少.土壤微生物群落被認(rèn)為是土壤生態(tài)系統(tǒng)變化的預(yù)警及敏感指標(biāo),土壤中微生物對(duì)重金屬污染脅迫產(chǎn)生的效應(yīng)比同一環(huán)境中的植物和土壤動(dòng)物更加敏感.Zn等重金屬在土壤中難以降解,一方面導(dǎo)致微生物生物量降低,使得微生物群落結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性遭受破壞[13];另一方面降低微生物生物活性,甚至抑制微生物的生長和代謝[14].且土壤微生物多樣性會(huì)因其鋅含量超標(biāo)而大幅度降低[15].目前,土壤中微生物毒性測(cè)試被認(rèn)為是評(píng)價(jià)土壤環(huán)境質(zhì)量非常有潛力的生態(tài)毒理學(xué)指標(biāo)[16].隨著現(xiàn)代生物科技手段和分子技術(shù)水平的不斷發(fā)展,利用土壤環(huán)境中微生物的群落結(jié)構(gòu)和多樣性變化作為受污染土壤毒理學(xué)測(cè)試指標(biāo)已成為當(dāng)前土壤環(huán)境科學(xué)研究的前沿領(lǐng)域之一[16-19].相對(duì)于傳統(tǒng)的微生物分離培養(yǎng)方法,直接從土壤中提取微生物總DNA,從分子水平上研究土壤微生物的種類和種群結(jié)構(gòu)變化與環(huán)境質(zhì)量變化間的耦合關(guān)系, 可以很好地避免傳統(tǒng)毒性測(cè)試方法在富集、培養(yǎng)、分離、研究的過程中造成微生物多樣性的丟失,能夠更全面、系統(tǒng)地認(rèn)識(shí)土壤中微生物的多樣性與環(huán)境質(zhì)量變化的關(guān)系[20-21].多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)結(jié)合變性梯度凝膠電泳(PCR-DGGE)測(cè)試方法作為一種DNA指紋技術(shù),其原理是使用一對(duì)特異性引物PCR,達(dá)到擴(kuò)增微生物群體16S rDNA的目的,產(chǎn)生包含長度相同但序列有異的DNA片段混合物,再用DGGE技術(shù)分離產(chǎn)物混合物來進(jìn)行微生物種群和結(jié)構(gòu)變化的一種測(cè)試方法[19,21-23].目前,將PCR-DGGE技術(shù)應(yīng)用于測(cè)定污染土壤中Zn毒性對(duì)微生物種類及種群結(jié)構(gòu)變化的研究還鮮見報(bào)道.

本研究選取我國5種具有代表性質(zhì)的農(nóng)田表層土壤,添加不同濃度的Zn,經(jīng)過180d的培養(yǎng)老化后,利用基于16SrDNA的PCR-DGGE指紋圖譜分析技術(shù),對(duì)土壤中微生物群落結(jié)構(gòu)進(jìn)行測(cè)定,同時(shí)對(duì)Zn污染脅迫與土壤微生物結(jié)構(gòu)多樣性產(chǎn)生的影響、土壤微生物群落結(jié)構(gòu)多樣性和相似性的變化及其影響因子進(jìn)行研究,以期為不同性質(zhì)Zn污染土壤的毒理學(xué)評(píng)價(jià)提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù),同時(shí)為鋅污染土壤的生態(tài)風(fēng)險(xiǎn)評(píng)價(jià)和環(huán)境質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)修訂提供參考.

1 材料與方法

1.1 土壤采集及制備

依據(jù)我國土壤pH值及有機(jī)碳分布頻率的地帶性特征,采集了我國5個(gè)典型地點(diǎn)的耕作層土壤樣品,分別為公主嶺、廣州、杭州、石家莊和?？?所有土樣風(fēng)干后過2mm的尼龍篩進(jìn)行土壤基本理化性質(zhì)的測(cè)定[24],見表1.

表1 供試土壤的基本性質(zhì)

土壤采取外源添加Zn處理,添加方法如下:配置ZnCl2(分析純)溶液,添加6個(gè)不同濃度梯度的Zn(mg/kg烘干土).分別為0、200、400、800、1600、2400mg/kg,每個(gè)Zn濃度3次重復(fù),充分?jǐn)嚢杈鶆?保持每種土壤的70%最大田間持水量(MWHC)平衡180d后,風(fēng)干過2mm尼龍篩備用.PCR測(cè)試中樣品編號(hào)信息見表2.

表2 樣本編號(hào)

1.2 土壤中微生物的DGGE分析

1.2.1 土壤中DNA的提取[21]將不同處理的10-1~10-7土壤稀釋度懸液涂布于R2A培養(yǎng)基,25 ℃培養(yǎng)10d后,將這些經(jīng)過不同稀釋度處理的培養(yǎng)基上的菌落,使用無菌水洗脫,并混合均勻.取1.5mL混合菌懸液,采用CTAB法提取土壤中微生物基因組DNA,保存于-20℃?zhèn)溆?每個(gè)稀釋度3次重復(fù).

1.2.2 土壤樣品微生物的16SrDNA片段的PCR擴(kuò)增[25]以樣品基因組DNA為模板,采用細(xì)菌通用引物338F-GC(5’-CGCCCGCCGCGCGC- GGCGGGCGGGGCGGGGGCACGGGGGGCCTACGGGAGGCAGCAG-3’)和518R(5’-GTATT- ACCGCGGCTGCTGG-3’)擴(kuò)增樣品16SrDNA高變區(qū)序列.

PCR擴(kuò)增體系(50μL)為:10×PCR buffer5μL; dNTP(2.5mmol/L)3.2μL; rTaq(5U/μL)0.4μL; GC- 338F(20mmol/L)1μL; 518R(20mmol/L)1μL;模板DNA 50ng;補(bǔ)ddH2O至50μL.

PCR擴(kuò)增程序?yàn)?94℃預(yù)變性5min;94℃變性1min,55℃復(fù)性45s,72℃延伸1min,30個(gè)循環(huán);最終72℃延伸10min.PCR產(chǎn)物采用OMEGA公司DNA Gel Extraction Kit純化回收.

PCR儀為Biometra公司生產(chǎn)的T-gradient,凝膠成像儀為Bio-Rad公司的Gel-Doc2000凝膠成像系統(tǒng).

1.2.3 PCR產(chǎn)物的變性梯度凝膠電泳(DGGE)分析 取10μL PCR的產(chǎn)物進(jìn)行變形梯度凝膠電泳(DGGE)分析.采用變形梯度為35%~55%、濃度為8%的聚丙烯酰胺凝膠(化學(xué)變性劑為100%尿素7mol/L 和40%的丙烯酰胺)在1xTAE 緩沖液中150V 60℃下電泳5h.

變形梯度凝膠電泳(DGGE)完畢后、采用銀染法染色、步驟如下:a)固定液(乙醇50mL、冰醋酸2.5mL、定容500mL)固定15min;b) Milli-Q純水清洗、20s和2min各一次; c)銀染液(硝酸銀1g、37%甲醛0.75mL、定容500mL)染色15min;d) Milli-Q純水清洗、20s和2min各一次; e)顯色液(氫氧化鈉7.5g、37%甲醛2.5mL、定容500mL)顯色5~7min;最后用終止液(乙醇50mL、冰醋酸2.5mL、定容500mL)終止反應(yīng).

1.3 主要電泳條帶的回收與測(cè)序

用滅菌的手術(shù)刀切下待回收DGGE條帶,采用OMEGA公司Poly-Gel DNA ExtractionKit回收目的條帶.以2μL回收產(chǎn)物為模板,338F/518R 為引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增.

PCR 擴(kuò)增體系(50μL)為:10×PCR buffer 5μL; dNTP(2.5mmol/L)3.2μL; rTaq(5U/μL)0.4μL; 338F (20mmol/L) 1μL;518R(20mmol/L)1μL;模板DNA 1μL;補(bǔ)ddH2O至50μL.PCR擴(kuò)增程序?yàn)?94℃預(yù)變性4min;94℃變性30s,55℃復(fù)性30s,72℃延伸30s, 30個(gè)循環(huán);最后,72℃延伸10min.

將重新擴(kuò)增的DNA 片段切膠回收、純化后,連接到Pmd18-T載體上,并轉(zhuǎn)化至DH5α感受態(tài)細(xì)胞中,篩選陽性克隆,進(jìn)行序列測(cè)定.

1.4 數(shù)據(jù)處理

細(xì)菌多樣性指數(shù)是研究群落物種數(shù)和個(gè)體數(shù)以及均勻度的綜合指標(biāo).根據(jù)電泳圖譜中樣品條帶數(shù)目及每個(gè)條帶的強(qiáng)度(灰度),對(duì)各樣品中細(xì)菌多樣性指數(shù)()、均勻度()和豐富度()等指標(biāo)進(jìn)行分析.DGGE 圖譜采用Quantityone軟件對(duì)每個(gè)樣品的電泳條帶數(shù)目、條帶密度進(jìn)行數(shù)字化分析,香農(nóng)指數(shù)()、豐度()和均衡指數(shù)()等指標(biāo)被用來比較不同樣品的多樣性情況[25].其算法如下:

ln(1)

(2)

maxln(3)

式中:為樣品中單一條帶的強(qiáng)度在該樣品所有條帶總強(qiáng)度中所占的比率;為DGGE 圖譜單一泳道上所有條帶的豐度(%);為第條帶的豐度(%);是某樣品中所有條帶數(shù)目總和.

測(cè)序結(jié)果采用DNAstar和Cluster軟件進(jìn)行序列分析,下載最相似的菌株序列作為系統(tǒng)發(fā)育樹的參考序列.采用MEGA 軟件,Neighbor-joining法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹,自展數(shù)(bootstrap)為1000.

主成分分析(PCA)采用Canoco軟件,根據(jù)DGGE條帶配對(duì)圖,在條帶出現(xiàn)的地方定義1,未出現(xiàn)的地方定義為0,得到二次矩陣并進(jìn)行主成分分析.

Bray-Curtis矩陣計(jì)算由R語言Ecodist包完成.繪制熱圖(Heatmap)采用R語言pheatmap包完成.排序軸分析由R語言Vegan包完成.

2 結(jié)果與討論

2.1 土壤中Zn對(duì)微生物群落多樣性的影響

以GC-338F和518R為引物擴(kuò)增16S rDNA序列、得到約200bp的DNA片段用于DGGE分析.DGGE圖譜上的條帶數(shù)量和位置反映了土壤中菌群的多樣性.從土壤微生物16S rDNA PCR產(chǎn)物的變性梯度凝膠電泳(DGGE)分析圖譜(圖1)中可以看出,不同性質(zhì)土壤中的微生物多樣性有明顯的差別;同一種土壤隨著土壤中Zn濃度的增加,條帶強(qiáng)度呈現(xiàn)先增加后減弱的趨勢(shì),帶型也有區(qū)別,可見Zn污染脅迫對(duì)微生物群落結(jié)構(gòu)有比較顯著地影響.例如公主嶺土壤Sample-2相對(duì)于Sample-1而言,條帶數(shù)目減少,Sample-3相對(duì)于Sample-1、2出現(xiàn)了一些新的菌群,某些條帶的強(qiáng)度有所增加,顯示有一些微生物表現(xiàn)出了較高的耐性.據(jù)報(bào)道,土壤在受到Zn、Pb脅迫后,對(duì)某些菌類如固氮菌、木霉等菌類起抑制作用,但有些耐性較強(qiáng)的菌類如大豆根瘤菌反而會(huì)比無污染和污染較輕的土壤數(shù)量多.研究表明[17,20,26],在土壤微生物發(fā)生明顯變化以前,整個(gè)微生物區(qū)系已經(jīng)發(fā)生質(zhì)的變化,無法適應(yīng)的微生物種群數(shù)量下降,可以適應(yīng)的微生物數(shù)量增加.理論上會(huì)有2種或2種以上更具耐性的物種來填補(bǔ),從而豐富微生物系統(tǒng).

表3 不同土壤中微生物多樣性指數(shù)(H’)

注 :相同列的不同字母表示差異顯著(<0.05).Cd(200mg/kg)、Cd(400mg/kg)、Cd(800mg/kg)、Cd(1600mg/kg) Cd(2400mg/kg)分別為Zn的6個(gè)不同濃度梯度,分別為0,200,400,800,1600, 2400mg/kg.

通過對(duì)不同土壤中微生物多樣性指數(shù)(表3)分析發(fā)現(xiàn),隨著Zn濃度的逐漸增加,土壤中微生物多樣性指數(shù)總體呈下降趨勢(shì),如杭州土壤(Sample- 7~12)中微生物多樣性指數(shù)在最高Zn濃度時(shí)由對(duì)照的3.61下降到2.99,海口的土壤也由3.55下降到3.34,其他地區(qū)的土壤都呈現(xiàn)出相同的規(guī)律,表明Zn脅迫對(duì)土壤中微生物多樣性有較強(qiáng)抑制;而在低濃度的時(shí)候各地區(qū)土壤微生物多樣性指數(shù)均有升高的現(xiàn)象,比如廣州水稻土的微生物多樣性指數(shù)在Zn濃度為200mg/kg時(shí)(Sample-14),由對(duì)照(Sample-13)的3.55升到3.82.表明土壤中低濃度(200mg/kg)Zn會(huì)增加微生物群落多樣性. 研究資料表明,土壤中重金屬的脅迫會(huì)改變細(xì)胞代謝和微生物的功能,引起微生物生存力和競爭力的變化[27],從而導(dǎo)致種群大小的改變.因此,重金屬脅迫會(huì)對(duì)微生物種群結(jié)構(gòu)產(chǎn)生一定影響,但如果從微生物進(jìn)化的角度及Zn作為生命必需元素來看,適當(dāng)濃度的重金屬反而對(duì)增加物種多樣性,提高微生物的抗性有一定的積極作用.

表4 序列比對(duì)分析結(jié)果

對(duì)DGGE圖譜中的15個(gè)主要差異條帶進(jìn)行回收測(cè)序,測(cè)序結(jié)果與Gen Bank中的序列進(jìn)行比對(duì),得到條帶所代表的細(xì)菌類型.每個(gè)回收條帶取3個(gè)克隆進(jìn)行了序列測(cè)定,結(jié)果如表4,系統(tǒng)進(jìn)化樹見圖2.由測(cè)序結(jié)果可知,大部分菌群為Proteobacteria變形菌門.

同時(shí)對(duì)土壤樣品進(jìn)行主成分分析,得到結(jié)果如圖3.主成分分析可將不同土壤和對(duì)照分開,并且顯示出不同樣品之間的差異性.圖中除石家莊褐土的Sample-19~24土壤處理外,同一土壤的微生物均較好的分布在一起.PCA-1和PCA-2代表總變量的29.8%,顯示出不同樣品之間有著較大的變異,如PCA-1可將杭州、廣州及?？诘臉悠访黠@地區(qū)分開,說明土壤中的微生物由于不同地域土壤性質(zhì)的區(qū)別而有較大差異.

2.2 不同Zn處理土壤中微生物群落相似性分析

在計(jì)算不同Zn處理土壤的樣本菌落結(jié)果相似度聚類分析時(shí),通過間戴斯系數(shù),得到各樣本之間的相似性矩陣,利用UPGMA算法構(gòu)建聚類分析圖(圖4),比較樣本間的差異程度.

從樣本相似性計(jì)算結(jié)果來看,在聚類圖中,不同地區(qū)來源的樣本基本可以較好聚在一起,說明微生物群落分布具有地域性差別.同時(shí),在同一種土壤中,隨著Zn濃度的增加,樣本的相似性下降,根據(jù)聚類分析圖,例如在杭州水稻土,Sample-10與Sample-12的相似性為95%, Sample-10與Sample-11的相似性只有59%,說明土壤中Zn脅迫顯著改變了土壤中微生物的群落結(jié)構(gòu).

2.3 土壤理化性質(zhì)對(duì)土壤微生物群落結(jié)構(gòu)的影響

針對(duì)影響土壤中微生物群落結(jié)構(gòu)變化的土壤性質(zhì),本研究采用Vegan包做了排序軸分析.結(jié)果表明,最大坐標(biāo)長度為1.83<3~4(圖5),因此該排序軸使用線性模型(PCA)較為合適,從圖5看出,土壤pH、CEC、OC3種主要性質(zhì)在二維排序軸貢獻(xiàn)率約為60%.即可解釋影響微生物分布差的約60%變量因素,且樣本間距離分布符合樣本相似性的計(jì)算結(jié)果.從各因子貢獻(xiàn)率來看(表5),對(duì)樣本微生物多樣性影響最大的為pH值(CaCl2測(cè)定方法結(jié)果的影響略高于H2O測(cè)定方法),相關(guān)系數(shù)達(dá)到0.564,其次為OC(相關(guān)系數(shù)2= 0.503),再次為CEC(相關(guān)系數(shù)2=0.350),最后為Clay(相關(guān)系數(shù)2=0.214).可見不同地域土壤的理化因子對(duì)土壤中微生物群落結(jié)構(gòu)有顯著影響.

表5 土壤中微生物群落結(jié)構(gòu)與土壤性質(zhì)的相關(guān)分析

當(dāng)重金屬等污染物進(jìn)入土壤后使得土壤中對(duì)污染物有耐性響應(yīng)的物種變多,且微生物多樣性降低,群落結(jié)構(gòu)發(fā)生實(shí)質(zhì)性變化.盡管現(xiàn)代微生物群落分析技術(shù)各有其局限性及偏差,但在一定程度上依然存在對(duì)群落結(jié)構(gòu)因污染影響發(fā)生的變化進(jìn)行很好地測(cè)定[28].本文采用PCR-DGGE指紋圖譜分析方法,有效地對(duì)土壤中Zn污染脅迫與微生物種群結(jié)構(gòu)的相關(guān)性進(jìn)行了研究,因此利用PCR-DGGE指紋圖譜分析方法對(duì)不同土壤樣品中微生物多樣性組成及其變化預(yù)測(cè)土壤生態(tài)系統(tǒng)風(fēng)險(xiǎn)具有一定的理論意義.

3 結(jié)論

3.1 通過對(duì)不同性質(zhì)Zn污染土壤中的微生物PCR-DGGE圖譜分析,表明Zn污染脅迫會(huì)引起土壤中微生物的數(shù)目和多樣性的變化.總體來說,低濃度(<200mg/kg)Zn處理會(huì)一定程度促進(jìn)微生物群落數(shù)量的增加,豐富了群落結(jié)構(gòu)多樣性;隨著Zn濃度的升高,微生物多樣性呈下降趨勢(shì),群落結(jié)構(gòu)趨于簡單.

3.2 通過戴斯矩陣方法和B-C矩陣方法比較土壤中微生物群落相似性,結(jié)果均表明不同地區(qū)來源的微生物群落分布基本在一起,說明微生物分布具有地域性差別.土壤中Zn脅迫明顯改變了微生物的群落結(jié)構(gòu).

3.3 土壤中Zn脅迫對(duì)微生物群落結(jié)構(gòu)變化的相關(guān)性分析結(jié)果表明,影響土壤微生物群落結(jié)構(gòu)的主要因子為pH>OC>CEC.

[1] 李榮華,沈 鋒,李曉龍,等.陜西某鉛鋅冶煉廠區(qū)及周邊農(nóng)田重金屬污染土壤的穩(wěn)定化修復(fù)理論與實(shí)踐 [J]. 農(nóng)業(yè)環(huán)境科學(xué)學(xué)報(bào), 2015,34(7):1269-1276.

[2] 陳世寶,孫 聰,魏 威,等.根細(xì)胞壁及其組分差異對(duì)植物吸附、轉(zhuǎn)運(yùn)Zn的影響 [J]. 中國環(huán)境科學(xué), 2012,32(9):1670-1676.

[3] 宋 偉,陳百明,劉 琳.中國耕地土壤重金屬污染概況 [J]. 水土保持研究, 2013,4(15):922-930.

[4] 田昕竹,陳世寶,王學(xué)東,等.土壤溶液性質(zhì)對(duì)Zn的形態(tài)變化及其微生物毒性的影響 [J]. 中國環(huán)境科學(xué), 2014,34(10):2602-2609.

[5] 林 蕾,陳世寶,馬義兵.土壤中鋅的形態(tài)轉(zhuǎn)化影響因素及有效性研究進(jìn)展 [J]. 農(nóng)業(yè)環(huán)境科學(xué)學(xué)報(bào), 2012,31(2):221-229.

[6] GB2762-2012 中華人民共和國國家標(biāo)準(zhǔn) [S].

[7] 李 季,黃益宗,胡 瑩,等.基于植物重金屬毒性的陸地生物配體模型(t-BLM)研究進(jìn)展 [J]. 生態(tài)毒理學(xué)報(bào), 2015,10(6):43-53.

[8] 陳世寶,林 蕾,魏 威,等.基于不同測(cè)試終點(diǎn)的土壤鋅毒性閾值及預(yù)測(cè)模型 [J]. 中國環(huán)境科學(xué), 2013,33(5):922-930.

[9] 何 俊,王學(xué)東,陳世寶,等.典型污灌區(qū)土壤中Cd的形態(tài)、有效性及其影響因子 [J]. 中國環(huán)境科學(xué), 2016,36(10):3056-3063.

[10] Wang M, Chen L, Chen S B, et al. Alleviation of cadmium- induced root growth inhibition in crop seedlings by nanoparticles [J]. Ecotoxicology and Environmental Safety, 2012,79:48-54.

[11] 李 寧,陳世寶.基于大麥根伸長測(cè)定土壤Pb毒性閾值、淋洗因子及其預(yù)測(cè)模型 [J]. 應(yīng)用生態(tài)學(xué)報(bào), 2015,26(7):2177-2182.

[12] Montiel-Rozas M M, Madejón E, Madejón P. Effect of heavy metals and organic matter on root exudates of herbaceous species:An assessment in sand and soil conditions under different levels of contamination [J]. Environmental Pollution, 2016,216:273-281.

[13] 張 妍,崔驍勇,羅 維.重金屬污染對(duì)微生物生態(tài)功能的影響 [J]. 生態(tài)毒理學(xué)報(bào), 2010,5(3):305-313.

[14] 王 嘉,王仁卿,郭衛(wèi)華.重金屬對(duì)土壤微生物影響的研究進(jìn)展 [J]. 山東農(nóng)業(yè)科學(xué), 2006,1:101-104.

[15] Bruce F M. Zinc contamination decreases the bacterial diversity of agricultural soil [J]. Microbiology Ecology, 2003,43:13-19.

[16] Megharaj K V M, Sethunathan N, Naidu R. Bioavailability and toxicity of cadmium to microorganisms and their activities in soil: a review [J]. Advances in Environmental Research, 2003,(8):121-135.

[17] 邢 奕,司艷曉,洪 晨,等.鐵礦區(qū)重金屬污染對(duì)土壤微生物群落變化的影響 [J]. 環(huán)境科學(xué)研究, 2013,26(11):1201-1211.

[18] 羅 青,宋亞娜,鄭偉文.PCR-DGGE法研究福建省稻田土壤微生物地區(qū)多態(tài)性 [J]. 中國生態(tài)農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào), 2008,16(3):669-674.

[19] 阮菊俊.銅污染對(duì)土壤微生物活性的影響及其PCR-DGGE分析 [D]. 揚(yáng)州:揚(yáng)州大學(xué), 2008.

[20] Broos K, Mertens J, Smolders E. Toxicity of heavy metals in soil assessed with various soil microbial and plant growth assays: as comparative study [J]. Environmental Toxicology and Chemistry, 2005,24:634-640.

[21] 周?；?利用PCR-DGGE分析直流電場對(duì)土壤微生物群落的影響研究 [D]. 上海:東華大學(xué), 2008.

[22] 李 曄,孫麗娜,楊繼松,等.基于PCR-DGGE的重金屬污染土壤微生物種群指紋分析 [J]. 生態(tài)環(huán)境學(xué)報(bào), 2009,19(9):2204-2208.

[23] 郭飛宏,鄭 正,張繼彪.PCR-DGGE技術(shù)分析塔式蚯蚓生態(tài)濾池微生物群落結(jié)構(gòu) [J]. 中國環(huán)境科學(xué), 2011,31(4):597-602.

[24] 魯如坤.土壤農(nóng)業(yè)化學(xué)分析方法[M]. 北京:中國農(nóng)業(yè)科技出版社, 2000:12-19.

[25] Aydin S, Shahi A, Ozbayram E G, et al. Use of PCR-DGGE based molecular methods to assessment of microbial diversity during anaerobic treatment of antibiotic combinations [J]. Bioresource Technology, 2015,(192):735-740.

[26] 滕 應(yīng),駱永明,趙祥偉,等.重金屬復(fù)合污染農(nóng)田土壤DNA的快速提取及其PCR-DGGE分析 [J]. 土壤學(xué)報(bào), 2004,41(3):343-347.

[27] 段學(xué)軍,閔 航.鎘對(duì)稻田土壤典型微生物種的脅迫生理毒性 [J]. 生態(tài)環(huán)境, 2005,14(6):865-869.

[28] 陳承利,廖 敏,曾路生.污染土壤微生物群落結(jié)構(gòu)多樣性及功能多樣性測(cè)定方法[J]. 生態(tài)學(xué)報(bào), 2006,26(10):3404-3412.

Effects of Zn pollution on soil microbial community in field soils and its main influence factors.

ZHENG Han1, TIAN Xin-zhu2,3, WANG Xue-dong2, LIU Bin1, MENG Nan1, HE Jun2, CHEN Shi-bao1*

(1.Key Laboratory of Plant Nutrition and Fertilizer, Ministry of Agriculture, Institute of Agricultural Resources and Regional Planning, Chinese Academy of Agricultural Sciences, Beijing 100081, China；2.College of Resource Environment and Tourism, Capital Normal University, Beijing 100048, China；3.Beijing Environmental Impact Assessment Center, Beijing 100161, China).

The soil microbial structure and community of five different kinds of contaminated soil were determined using PCR-DGGE test method, the soil microbial community and microbial similarity was measured and compared using Des matrix analy sis and B-C matrix analysis and the relationship between Zn toxicity to soil microbial structure and soil properties was also analysed by using Vegan Sorting Axis analysis. Zn pollution could decrease the number and type of microbial in soil, while it was not a simply negative correlation. The maximum value of soil microorganisms diversity indices were observed at low Zn addition level (200mg/kg) in soils, which implied that application of low concentration Zn in soils would contribute to the increased number of soil microbial community and enrich the community structure diversity, however, with the increment of Zn in soils, the microbial community structure were restrained at high Zn concentrations, the Shannon index decreased 5.14% to 17.2% among the treatments, the minimum value (5.14%) was observed in black soil from Gongzhuling and the greatest reduction was found in the paddy soil from Hangzhou. The soil microbial similarity as determined by Des matrix and B-C matrix analysis decreased significantly with Zn addition in high concentration (>800mg/kg) in soils, with the maximum reduction of 23.3%, soil microbial community structure could be damaged after long time Zn stress in soils. Correlation analysis between the influencing factors of Zn stress and microbial community structure change in soils showed that the microbial community structure would be influenced by pH, followed by the OC, CEC in soils.

Zinc；PCR-DGGE；polluted soil；microbial community structure；soil microbial diversity

X171,X172

A

1000-6923(2017)04-1458-08

2016-08-26

國家支撐計(jì)劃課題(2015BAD05B03);國家重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃課題(2016YFD0800707);國家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(41271490, 21077131)

鄭 涵(1993-),女,山東濰坊人,中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院碩士研究生,主要從事農(nóng)田重金屬污染機(jī)制與修復(fù)研究.

* 責(zé)任作者, 研究員, chenshibao@caas.cn

, 2017,37(4)：1458~1465