黃葵莖腐病病原菌的分離與鑒定

房云彬, 劉常宏

(南京大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院, 南京 210093)

黃葵莖腐病病原菌的分離與鑒定

房云彬, 劉常宏*

(南京大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院, 南京 210093)

針對江蘇宜興黃葵主產(chǎn)區(qū)發(fā)生的黃葵莖腐病,通過分離黃葵植株不同部位(根、莖、葉)以及根際土壤、根圍土壤的微生物,經(jīng)形態(tài)學(xué)觀察,結(jié)合分子進(jìn)化分析構(gòu)建了黃葵不同生態(tài)位的微生物物種系統(tǒng)發(fā)育樹,對其種類和分布進(jìn)行了分析。結(jié)果表明,細(xì)菌優(yōu)勢類群為芽胞桿菌,而真菌無明顯優(yōu)勢類群。同時,根據(jù)柯赫氏法則測定了分離得到的微生物菌株的致病性,確定了菌株F28可引起黃葵莖腐病,經(jīng)ITS分子進(jìn)化分析及形態(tài)學(xué)觀察,將其鑒定為變紫青霉Penicilliumsanguineum。

黃葵; 莖腐病; 分離; 鑒定; 變紫青霉

黃葵AbelmoschusmanihotL. Medicus為錦葵科Malvaceae秋葵屬Abelmoschus一年生草本植物,又被稱為黃蜀葵花、蜀葵等,分布于我國中南、西南及河北、陜西、山東、浙江、江西、福建等地[1]。黃葵是我國傳統(tǒng)中藥材,其全草入藥具有清熱、涼血、解毒等功效,用黃葵治病療傷在我國歷代醫(yī)籍中均有記載,民間應(yīng)用十分普遍,其藥用歷史悠久,療效明確[2]。

隨著對其有效成分、藥效等研究的深入,黃葵的潛在價值已愈來愈為人們所認(rèn)識。黃葵集約化種植的發(fā)展,使得黃葵病害的防治問題日趨突出。然而,目前關(guān)于黃葵的研究多集中于對其種植方式、藥理、活性成分及新藥開發(fā)等,而鮮有關(guān)于黃葵病害的研究,對嚴(yán)重影響黃葵產(chǎn)量的莖腐病的研究尚無報道,其致病菌的分離與鑒定仍是空白。近年來,黃葵莖腐病頻繁暴發(fā),且病害一旦發(fā)生即迅速蔓延至整塊栽培地,難以控制,嚴(yán)重影響黃葵產(chǎn)業(yè)的發(fā)展。

本研究采用常規(guī)組織分離法,從經(jīng)表面消毒的莖腐病黃葵植株體內(nèi)和病田土壤中分離可能的致病微生物,并根據(jù)柯赫氏法則,通過致病性試驗(yàn)確定黃葵莖腐病致病菌株,并采用rDNA ITS分子進(jìn)化分析和形態(tài)學(xué)分析方法鑒定該病原菌株,為黃葵莖腐病的防治研究提供一定的參考。

1 材料與方法

1.1 黃葵莖腐病調(diào)查及樣品的采集

黃葵病害調(diào)查和樣品采集在江蘇省宜興市太華鎮(zhèn)茂花村進(jìn)行。分別于2013年7月22日和9月22日,在連作3年的大田中,選取3個區(qū)域,每個區(qū)域選取1個病株小區(qū)、1個健株小區(qū)(病情分級為0),每個小區(qū)選取3株黃葵,每株黃葵采集部位為根、莖、葉及株下土壤(病株采集部位為發(fā)病部位莖、莖葉交界處的葉、莖葉交界處的莖、根及株下土壤,健株采集部位為對應(yīng)部位)。每個小區(qū)面積為1 m2,每個大田區(qū)域內(nèi)小區(qū)間的距離為10 m。將采集到的樣品帶回實(shí)驗(yàn)室,對樣品進(jìn)行編號,詳細(xì)描述發(fā)病癥狀并統(tǒng)計(jì)病情分級情況,病情分級由低到高分為0、1、2、3、4級[3],保存樣本并記錄數(shù)據(jù)。

1.2 樣品微生物的分離與純化

對采集自18株黃葵的所有植株樣品采用常規(guī)組織分離法分離，土壤樣品采用稀釋涂布平板法進(jìn)行分離。具體如下。

植株樣品微生物的分離純化:每株黃葵按1.1所述選取根、莖、葉3個部位,先用無菌水沖洗,放入75%的乙醇中消毒1 min后,再用無菌水沖洗3次,然后用無菌濾紙吸去多余的水分,剪成0.5 cm×0.5 cm的組織塊,用無菌鑷子將組織塊放在培養(yǎng)基上培養(yǎng)。分離細(xì)菌使用LB瓊脂,37℃培養(yǎng)24 h后挑取單菌落轉(zhuǎn)接至新的培養(yǎng)皿獲得純培養(yǎng)物;分離真菌使用PDA(加入0.5 mg/mL硫酸鏈霉素抑制細(xì)菌生長),28℃,黑暗培養(yǎng)5 d后,從長出的菌落邊緣挑取菌絲轉(zhuǎn)接至新的培養(yǎng)皿,按此方法反復(fù)轉(zhuǎn)接純化,獲得純培養(yǎng)物。

土壤樣品微生物分離和純化:采用稀釋涂布平板法進(jìn)行細(xì)菌和真菌的分離。細(xì)菌采用LB平板進(jìn)行分離,通過畫線獲得單菌落之后,進(jìn)行液體LB的擴(kuò)大培養(yǎng),保種;分離真菌使用PDA(加入0.5 mg/mL硫酸鏈霉素抑制細(xì)菌生長),28℃,黑暗培養(yǎng)5 d后,從長出的菌落邊緣挑取菌絲轉(zhuǎn)接至新的培養(yǎng)皿,按此方法反復(fù)轉(zhuǎn)接純化,獲得純培養(yǎng)物。

真菌單孢株系的制備保存[4]:對分離到的易于產(chǎn)孢的真菌菌株,將其在PDA培養(yǎng)基上(25±1)℃黑暗條件下培養(yǎng)10 d,在無菌操作臺中將菌絲刮下并放入無菌水中用玻璃棒攪拌,用無菌紗布過濾,制備孢子懸浮液,取制備好的孢子懸浮液用血球計(jì)數(shù)板測濃度,并用濃度梯度稀釋法將孢子濃度稀釋為5×102個/mL,分別取10、20、40 μL涂布于7 cm的培養(yǎng)皿中,(25±1)℃黑暗條件下培養(yǎng),待剛長出菌落時將其轉(zhuǎn)接至新的培養(yǎng)皿,得到單孢菌株,于4℃保存菌種備用。

1.3 微生物致病性的測定

細(xì)菌:將分離得到的細(xì)菌菌株于LB平板37℃培養(yǎng)24 h后,制成3×108cfu/mL菌懸液。用滅菌毛細(xì)管在葉片或莖部輕壓組織造成傷口,將菌懸液用滅菌棉簽蘸取,涂布于傷口處,外套塑料袋在28℃恒溫條件下保濕培養(yǎng)。對照組為接種無菌水的葉片和莖,每處理3個重復(fù)。48 h后觀察發(fā)病情況,描述癥狀并記錄結(jié)果。

真菌:選取健康的黃葵植株,采用刺傷接種法。將單孢病原菌菌株活化后,挑少量菌絲轉(zhuǎn)接到PDA平板上,置于28℃恒溫箱黑暗培養(yǎng)5 d后,沿菌落邊緣用直徑為5 mm的打孔器制菌餅。將健康的黃葵用無菌水沖洗干凈之后,用滅菌毛細(xì)管在葉片或莖部輕壓組織造成傷口,將菌餅接在傷口處,外套塑料袋在30℃恒溫條件下保濕培養(yǎng)。對照為接種與菌餅相同大小純PDA培養(yǎng)基的葉片和莖,每處理3個重復(fù)。于不同時間持續(xù)觀察發(fā)病情況,描述癥狀并記錄結(jié)果。

選取接種后發(fā)病的組織,用前述相同方法再次對病原菌進(jìn)行分離。獲得再分離菌株后,觀察其與原接種菌株在形態(tài)上是否吻合。

1.4 黃葵莖腐病病原菌鑒定

1.4.1 真菌的形態(tài)特征觀察

真菌:形態(tài)學(xué)鑒定以菌株的菌落形態(tài)、產(chǎn)孢結(jié)構(gòu)、孢子類型為主要鑒定依據(jù)。將菌株接種在PDA平板并在28℃恒溫培養(yǎng)箱黑暗培養(yǎng)5 d。觀察菌落顏色、形態(tài)及分生孢子,隨機(jī)測量100個分生孢子長寬、縱橫分隔、喙等形態(tài)特征的數(shù)據(jù),記錄其形態(tài)特征,并與文獻(xiàn)描述的特征屬性進(jìn)行比對。

1.4.2 PCR擴(kuò)增與分子鑒定

細(xì)菌:對分離得到的細(xì)菌培養(yǎng)物,挑取單菌落,37℃,150 r/min過夜培養(yǎng),取3 mL菌液離心棄上清。采用BacteriaGen Kit提取細(xì)菌基因組DNA,用細(xì)菌16S rDNA通用引物(8f:5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′;1492r:5′-TACGGCTACCTTGTTACGACTT-3′)進(jìn)行PCR并測序。

真菌:無菌操作刮取平板培養(yǎng)真菌新鮮菌絲100 mg,采用Ezup柱式真菌基因組DNA抽提試劑盒[生工生物工程(上海)股份有限公司,Cat:SK8259)]提取真菌基因組DNA,用真菌ITS通用引物(ITS1:5′-TCCGTAGGTGAACCTGCGC-3′; ITS4:5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′)進(jìn)行PCR并測序。

分子鑒定:測序結(jié)果分別用http:∥blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi網(wǎng)站中的BLAST程序與GenBank中的核酸序列庫進(jìn)行同源性比較,并從GenBank數(shù)據(jù)庫中下載相關(guān)菌株的16S rDNA 或ITS序列,用軟件MEGA 6.0構(gòu)建基于16S rDNA 和ITS序列的系統(tǒng)進(jìn)化樹。

2 結(jié)果與分析

2.1 病害調(diào)查和病情描述

黃葵于2013年4月10日播種,7月16日第1次發(fā)病,發(fā)病率小于10%,調(diào)查完畢拔除病株。9月22日第2次調(diào)查發(fā)病情況,發(fā)病區(qū)域內(nèi),單塊病株區(qū)內(nèi)的植株發(fā)病率為100%。發(fā)病時天氣濕熱。發(fā)病部位一般在新梢上,先從新梢向陽面距地面較近處出現(xiàn)一條暗灰色的似燙傷狀的病斑,長約1.5～5.5 cm,寬0.6～1.2 cm。主要危害莖基部或地下主側(cè)根,病部開始為暗褐色,以后繞莖基部擴(kuò)展一周,使皮層腐爛,地上部葉片變黃、萎蔫,木質(zhì)部變褐壞死,后期整株枯死,病部表面常有白色菌絲覆蓋。

2.2 黃葵不同部位及病田土壤中微生物的分離

2.2.1 細(xì)菌的分離鑒定與分布

采用常規(guī)組織分離法及稀釋涂布平板法從感病黃葵葉部、根莖部及其病田土壤中共分離得到13株細(xì)菌,16S rDNA分子鑒定和形態(tài)學(xué)分析結(jié)果見表1。其中,所有13株細(xì)菌都能從莖部分離得到,11株能從根中分離得到,3株能從葉中分離得到,而6株能從土壤中分離得到(表1)。

表1 細(xì)菌鑒定結(jié)果及其生態(tài)位分布

根據(jù)黃葵不同生態(tài)位分離細(xì)菌的16S rDNA序列同源性,構(gòu)建細(xì)菌的系統(tǒng)發(fā)育樹?？蓪⒎蛛x到的13株細(xì)菌歸為6個屬:芽胞桿菌屬7株(Bacillussp.),葡萄球菌屬1株(Staphylococcussp.),泛菌屬2株 (Pantoeasp.),節(jié)桿菌屬1株 (Arthrobactersp.),庫特氏菌屬1株 (Kurthiasp.);腸桿菌屬1株 (Enterobactersp.),結(jié)果表明,細(xì)菌在黃葵不同生態(tài)位的分類相對比較集中,以芽胞桿菌屬為絕對優(yōu)勢種群(圖1)。

2.2.2 真菌的分離鑒定與分布

從黃葵植株體內(nèi)和病田土壤中共分離得到15株真菌,鑒定結(jié)果見表2。其中,莖中分離得到15株,根中分離得到10株,而土壤中分離得到9株。

基于ITS序列同源性構(gòu)建的分離得到真菌菌株的系統(tǒng)發(fā)育樹可以看出,真菌比細(xì)菌的分支更多更細(xì),相對沒有絕對優(yōu)勢的種屬,但也主要分為兩支,一支包括F21、F22、F23、F25、F26(97%),這一支主要是藻菌綱的霉菌,另一支則為半知菌類的霉菌和酵母(圖2)。

2.3 莖腐病病原菌的確定

致病性測試結(jié)果表明:13株細(xì)菌均不能使黃葵感染莖腐病,說明細(xì)菌不是黃葵莖腐病的致病菌。而測試真菌中只有編號為F28的分離物能引起典型的莖腐病癥狀(三組重復(fù)均發(fā)病),且與田間發(fā)病癥狀相似,說明F28菌株即為黃葵莖腐病的致病菌。具體表現(xiàn)為:采用刺傷接種法接種健康植株并保濕培養(yǎng)2 d后,觀察到菌塊長出白色菌絲覆蓋住傷口位置,5 d后出現(xiàn)黑褐色病斑,引起的癥狀與自然發(fā)病相同,對照組黃葵則未發(fā)病(圖3)。而通過剪取接種點(diǎn)上下部莖稈,并按照常規(guī)組織分離法分離,獲得分離物的純培養(yǎng)在菌落特征、分生孢子梗、分生孢子形態(tài)大小與原始分離物純培養(yǎng)一致,表明F28為黃葵莖腐病病原菌。

表2 真菌鑒定結(jié)果及其生態(tài)位分布

圖1 細(xì)菌菌株16S rDNA序列的最大似然法系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.1 Maximum likelihood-based phylogenetic tree based on 16S rDNA sequences of the bacterial isolates

圖2 真菌菌株ITS序列的最大似然法系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.2 Maximum likelihood-based phylogenetic tree based on ITS sequence of the fungal isolates

2.4 菌株F28的形態(tài)及分子鑒定

2.4.1 菌株F28的形態(tài)特征

在PDA培養(yǎng)基上,F28菌落呈絨狀,表面為黃色,產(chǎn)孢時變?yōu)樯罹G色,背面紅色或紫紅色。在光學(xué)顯微鏡下,F28的菌絲、孢子透明,菌絲有橫膈膜;掃描電鏡下,可見分生孢子梗短而光滑,(100～150)μm×(2.5～3.5)μm;分生孢子梗頂端生帚狀的間枝,分枝2次,間枝緊密,5～7個,(10～14)μm×(2.0～2.5)μm;以切離法生成分生孢子,分生孢子呈橢圓形至亞球形,表面極粗糙,大小(3.0～3.5)μm×(2.5～3.0)μm(圖4)。

2.4.2 菌株F28的分子鑒定

菌株F28的ITS片段全長為594 bp。用NCBI的BLAST程序進(jìn)行同源性比對發(fā)現(xiàn),該菌株的ITS序列與一株P(guān)enicilliumsanguineum(JX315663.1)同源性達(dá)100%。根據(jù)GenBank中相關(guān)菌的ITS序列,利用MEGA6軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(圖5)。結(jié)合菌株F28的形態(tài)特征(帚狀分枝孢子梗及分生孢子,而非Talaromyces屬的子囊孢子)、ITS序列同源性及系統(tǒng)發(fā)育樹的分析結(jié)果,根據(jù)真菌鑒定手冊[5],將該株菌鑒定為變紫青霉Penicilliumsanguineum。

圖3 黃葵莖腐病癥狀Fig.3 Stem rot of Abelmoschus manihot

圖4 菌株F28的形態(tài)Fig.4 Morphology of isolate F28

3 討論

通過對感病黃葵及根圍土壤中微生物的分離,共得到13株細(xì)菌和15株真菌,采用形態(tài)學(xué)結(jié)合分子進(jìn)化分析方法對其做了鑒定。在分離到的細(xì)菌和真菌當(dāng)中,有一些是已經(jīng)報道的植物致病菌,如細(xì)菌中的成團(tuán)泛菌P.agglomerans是玉米細(xì)菌莖腐病和稻谷變色的致病菌[6]。真菌中串珠狀赤霉G.moniliformis是導(dǎo)致玉米世界性病害的病原菌,深綠木霉T.aureoviride是某些食用菌的致病菌,葡萄座腔菌B.dothidea能導(dǎo)致樹木潰瘍病,也可引起藍(lán)莓枯萎[7]。而鐮刀菌Fusariumsp.可侵染糧食作物、經(jīng)濟(jì)作物、藥用植物及觀賞植物等100余種植物,引起植物的根腐、莖腐、莖基腐、花腐和穗腐等諸多病害[8-10]。此外,占分離到細(xì)菌總數(shù)60%以上的芽胞桿菌屬Bacillussp.則是一類常見的具有生防作用的細(xì)菌,能在植物根際及植物體定殖,促進(jìn)植物生長,引起植物系統(tǒng)誘導(dǎo)抗性,直接抑制植物病原菌生長等[11]。

圖5 基于菌株F28 ITS序列及相關(guān)菌株的最大似然法系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.5 Maximum likelihood-based phylogenetic tree based on ITS sequence of isolate F28 and related isolates

植物莖腐病病原菌種類較多,一般主要為鐮刀屬Fusariumsp.和腐霉屬Pythiumsp.等。本研究采用柯赫氏法則確定了黃葵莖腐病病原菌為變紫青霉P.sanguineum,而青霉屬引起的植物莖腐病還不多見。此外,植物莖腐病的發(fā)病原因復(fù)雜[12],可由單一病原菌侵染所致,也可由多種病原菌復(fù)合侵染造成植物根系或莖基部腐爛。楊國慧等[13]報道了樹莓莖腐病主要有兩種:一種是真菌Didymellaapplanata引起的刺馬釘狀莖腐病,另一種是真菌Leptosphaeriaconiotltyrium引起的莖腐病,且這兩種病害往往共同發(fā)生。然而,關(guān)于黃葵莖腐病病原菌分離鑒定的研究還未見報道。本研究結(jié)果顯示,變紫青霉是引起黃葵莖腐病的主要致病菌,為黃葵莖腐病的防治研究提供了一定基礎(chǔ)。

此外,胡江春等[14]通過對大豆莖腐病致病因子的研究表明,土壤紫青霉菌分泌的紫青霉菌毒素在大豆整個生育期內(nèi)均能導(dǎo)致對大豆生長的毒害作用,包括影響種子發(fā)芽率和導(dǎo)致大豆共生固氮率下降等。本研究證明,F28菌株會導(dǎo)致黃葵莖腐病的發(fā)生,其致病因子及具體發(fā)病機(jī)制還有待進(jìn)一步研究。

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(責(zé)任編輯：田 喆)

Isolation and identification of the pathogen ofAbelmoschusmanihotstem rot

Fang Yunbin, Liu Changhong

(School of Life Sciences, Nanjing University, Nanjing 210093, China)

Root rot is an important disease ofAbelmoschusmanihot. By phylogenetic and morphological analysis of the microorganisms isolated from roots, stems, leaves and soil, we investigated the species and distribution of the microorganisms in different parts ofA.manihotplant and rhizosphere soil from the mainA.manihot-producing area in Yixing, Jiangsu Province. Meanwhile, we tested the pathogenicity of all the microorganisms based on Koch’s postulates and determined that strain F28 could cause stem rot ofA.manihot. The strain F28 was identified asPenicilliumsanguineumaccording to its morphology and phylogenetic analysis of ITS.

Abelmoshcusmanihot; stem rot; isolation; pathogen identification;Penicilliumsanguineum

2016-06-08

2016-08-08

國家自然科學(xué)基金(31272081,31471810)

S 435.672

A

10.3969/j.issn.0529-1542.2017.03.017

* 通信作者 E-mail：chliu@nju.edu.cn