采用花器噴霧法并基于Cre/lox系統(tǒng)定點整合擬南芥Rps2基因的技術體系研究

李定紅， 張艷梅， 周廣燦， 雷 照， 孫小芹， 杭悅宇

〔江蘇省中國科學院植物研究所(南京中山植物園)， 江蘇 南京 210014〕

采用花器噴霧法并基于Cre/lox系統(tǒng)定點整合擬南芥Rps2基因的技術體系研究

李定紅， 張艷梅， 周廣燦， 雷 照， 孫小芹①， 杭悅宇①

〔江蘇省中國科學院植物研究所(南京中山植物園)， 江蘇 南京 210014〕

定點整合是一種指導目的基因以精確單拷貝進入基因組預定位點的轉(zhuǎn)基因技術，用于解決常規(guī)轉(zhuǎn)基因技術帶來的系列問題[1-2]。在擬南芥〔Arabidopsisthaliana(Linn.) Heynh.〕中，已通過根外植體法轉(zhuǎn)化實施了基因的定點整合[3]，但這一過程存在雜菌污染、分化困難和生長周期長等問題，且定點整合效率極低[3]，無法進行推廣應用?；ㄆ鲊婌F法是一種不依賴于組織或細胞培養(yǎng)而直接在活體植株中進行轉(zhuǎn)基因的方法，在擬南芥中通過該法獲得的隨機整合效率達1.33%～2.41%[4]，是擬南芥最高效的轉(zhuǎn)基因方法。

Rps2基因是擬南芥的單拷貝抗病基因[5]，介導對攜有avrRpt2基因的細菌病原物的抗病性；擬南芥rps2-101C生態(tài)型是Col-0生態(tài)型經(jīng)EMS輻射篩選的突變體植株[5]，對avrRpt2基因無抗性。作者以rps2-101C生態(tài)型為轉(zhuǎn)基因背景材料，通過花器噴霧法實施Cre/lox系統(tǒng)介導的Rps2基因的定點整合，以期對擬南芥的定點整合技術體系進行改進，并為加快植物基因功能和定向育種的研究提供實驗基礎。

1 材料和方法

1.1 材料

質(zhì)粒pSDM3110[3]由荷蘭萊頓大學的Hooykaas博士提供，該質(zhì)粒包含1個lox位點和由35SCaMV啟動子調(diào)控的Cre編碼區(qū)形成的嵌合結構。農(nóng)桿菌株系GV3101、擬南芥rps2-101C生態(tài)型以及3種交換載體p1301-lox-nptⅡ、p1301-lox-nptⅡ-Rps2和p1301-lox-nptⅡ-rps2[6]由美國芝加哥大學Bergelson博士提供；p1301-lox-nptⅡ載體含有在2個lox位點間插入無啟動子的nptⅡ基因編碼區(qū)和終止子的結構，p1301-lox-nptⅡ-Rps2和p1301-lox-nptⅡ-rps2載體則是在p1301-lox-nptⅡ載體的nptⅡ基因終止子后分別插入Rps2抗病基因和rps2感病基因的全長序列。

1.2 方法

1.2.1 轉(zhuǎn)化和篩選 采用電穿孔法[7]將質(zhì)粒pSDM3110轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌中；將擬南芥rps2-101C生態(tài)型在溫室中栽培至開花，采用花器噴霧法[4]進行轉(zhuǎn)化；T0代種子萌發(fā)后經(jīng)Basta(德國AgroEvo公司)噴灑進行篩選；保留T1代抗性植株并培養(yǎng)至開花，自交后子代幼苗用Basta篩選，存活率約為75%的T1代植株即為單拷貝轉(zhuǎn)化植株。pSDM3110的T-DNA區(qū)域在基因組中的轉(zhuǎn)入位置用Vectorette Ⅱ試劑盒(美國Sigma-Aldrich公司)通過錨定PCR確定，基于T-DNA基因組定位信息通過3-引物PCR[8]鑒定轉(zhuǎn)基因植株的雜合狀態(tài)。

將篩選的轉(zhuǎn)基因雜合體植株用花器噴霧法[4]分別進行交換載體轉(zhuǎn)化，以p1301-lox-nptⅡ載體轉(zhuǎn)化rps2-101C生態(tài)型為空白對照。獲得的種子經(jīng)卡那霉素篩選，自交2代后其子代表現(xiàn)100%卡那霉素抗性的植株即為轉(zhuǎn)基因純合體植株。

1.2.2 等位基因系的表型與遺傳驗證 針對交換載體和側翼序列設計引物。由于定點整合后Bar和Cre間的nptⅡ表達框被活化，因此，針對2個發(fā)生精確整合的lox位點兩側序列設計引物A和B，分別擴增出1.0和1.1 kb的片段；若存在隨機整合的轉(zhuǎn)基因拷貝，引物C將擴增出0.6 kb的片段。

根據(jù)Jefferson等[9]的方法，通過組織化學染色法測定GUS(β-葡糖醛酸酶)在植株中的活性，從而檢測轉(zhuǎn)基因植株中是否存在隨機T-DNA整合。采用EXPRESS Two-Step SYBR?GreenERTM試劑盒(美國Invitrogen公司)進行qRT-PCR檢測；Rps2引物結合于基因末端(位于2 730個堿基中的第2119位至第2314位)，以EF1a為實驗內(nèi)參[10]。采用丁香假單胞菌DC3000：avrRpt2接種擬南芥植株進行過敏反應測試；并根據(jù)植株感病癥狀參照文獻[11]的標準進行過敏反應分級，抗病記為“2”、中度抗病記為“1”、感病記為“0”。

2 結果和分析

2.1 定點整合體系的構建

基于Cre/lox系統(tǒng)的擬南芥Rps2基因的定點整合基本流程見圖1。由圖1可見：攜帶lox靶序列的擬南芥轉(zhuǎn)基因植株被分別轉(zhuǎn)入交換載體(p1301-lox-nptⅡ、p1301-lox-nptⅡ-Rps2和p1301-lox-nptⅡ-rps2)中，在交換載體上位于2個lox位點間的序列在Cre重組酶作用下被環(huán)化，隨之被定點整合到基因組中預先轉(zhuǎn)入的lox表達框。定點整合阻斷了Cre編碼區(qū)轉(zhuǎn)錄使之終止表達，而交換載體中nptⅡ基因受35S啟動子調(diào)控恢復正常表達，用于定點整合植株的篩選。

： 分別表示引物A、B和C的結合位點 Representing binding sites of primer A， B and C， respectively； ： 表示lox位點，箭頭方向指示lox位點的方向 Representing lox site， the arrow’s direction indicating the direction of lox site； ： 分別表示T-DNA的左、右邊界Representing left and right borders of T-DNA， respectively； ： 分別表示基因編碼區(qū)及其啟動子和終止子 Representing gene coding region and its promoter and terminator， respectively.圖1 由Cre/lox介導的擬南芥Rps2基因的定點整合基本流程圖Fig. 1 Basic flow chart of site-specific integration of Rps2 gene mediated by Cre/lox in Arabidopsis thaliana (Linn.) Heynh.

2.2 轉(zhuǎn)基因雜合體植株的篩選

經(jīng)Basta篩選，共獲得3個轉(zhuǎn)lox靶序列的單拷貝植株系；T-DNA基因組定位顯示這3個轉(zhuǎn)基因株系的基因組轉(zhuǎn)入位點不同，分別為第Ⅲ號染色體的4 289 059位點、第Ⅱ號染色體的13 898 787位點和第Ⅴ號染色體的18 136 204位點，分別被命名為P、Y和G株系。

2.3 定點整合植株的篩選及驗證

經(jīng)卡那霉素篩選，共獲得1 495株定點整合候選植株，定點整合率約0.076%。在空白對照中，載體p1301-lox-nptⅡ轉(zhuǎn)化rps2-101C生態(tài)型未獲得卡那霉素抗性苗，說明確實是由交換載體中的lox結構與預先轉(zhuǎn)入基因組中的lox發(fā)生整合而產(chǎn)生了卡那霉素抗性苗。

PCR實驗結果表明：在1 495株定點整合候選植株中，86.04%的植株采用引物A和B分別擴增出1.0 和1.1 kb的片段，但用引物C無擴增產(chǎn)物，表明這些植株是經(jīng)精確的定點整合產(chǎn)生的。同時，經(jīng)組織化學染色，約63.34%的候選植株未呈現(xiàn)藍色，表明沒有發(fā)生額外的隨機整合。

qRT-PCR檢測結果表明：與轉(zhuǎn)化p1301-lox-nptⅡ載體的株系相比，轉(zhuǎn)化p1301-lox-nptⅡ-Rps2和p1301-lox-nptⅡ-rps2載體的株系轉(zhuǎn)錄水平更高(P<0.05)。此外，過敏反應實驗(表1)結果表明：轉(zhuǎn)化p1301-lox-nptⅡ-Rps2載體的株系過敏反應比其他2個株系更明顯(P<0.01)，從而證實定點轉(zhuǎn)入的Rps2基因可正常轉(zhuǎn)錄和表達。

載體Vector各株系的HR分級 HRgradeofdifferentlinesP株系PlineY株系YlineG株系Glinep1301-lox-nptⅡ0.67±0.070.37±0.050.25±0.02p1301-lox-nptⅡ-Rps21.91±0.091.87±0.052.01±0.05p1301-lox-nptⅡ-rps20.14±0.010.56±0.060.78±0.07

3 討論和結論

雖然植物定點整合技術可解決常規(guī)轉(zhuǎn)基因技術中轉(zhuǎn)入基因表達易變的問題，但基于細胞或組織培養(yǎng)體系的植物定點整合技術體系的轉(zhuǎn)化效率通常很低，如擬南芥根外植體法的定點整合率僅0.000 1%～0.001%[3]，水稻(OryzasativaLinn.)基因槍法僅獲得1株定點整合植株[12]，煙草(NicotianatabacumLinn.)PEG法的定點整合率僅0.000 12%[2]等。作者通過花器噴霧法并基于Cre/lox系統(tǒng)對擬南芥定點整合技術體系進行了改進，其定點整合率達0.076%，較Vergunst等[3]報道的定點整合率高2至3個數(shù)量級，極大地提高了定點整合的效率，且操作流程簡單易行，可改善定點整合技術效率低的現(xiàn)狀。

Vergunst等[3]在利用根外植體法進行擬南芥定點整合的過程中觀察到少量幼苗葉片發(fā)生脫綠現(xiàn)象，表現(xiàn)出卡那霉素敏感癥狀。本研究也觀察到極少量幼苗具有葉片脫綠現(xiàn)象，推測可能是在幼苗生長過程中，一些以雜合狀態(tài)存在的Cre基因編碼的重組酶又將nptⅡ基因切除下來，從而使部分細胞喪失卡那霉素抗性，因此，作者僅保留了子代具有完全卡那霉素抗性的候選植株用于進一步分析。

利用改進的Cre/lox定點整合體系，成功介導Rps2基因準確插入擬南芥基因組的預定位點，定點整合效率大幅提高，定點整合的Rps2基因正常轉(zhuǎn)錄和表達，因此，應用本體系可極大提高植物定點整合遺傳轉(zhuǎn)化體系的穩(wěn)定性和轉(zhuǎn)化效率。

[1] FUKUSHIGE S， SAUER B. Genomic targeting with a positive-selectionloxintegration vector allows highly reproducible gene expression in mammalian cells[J]. Proceedings of the National Academy of Sciences， 1992， 89： 7905-7909.

[2] DAY C D， LEE E， KOBAYASHI J， et al. Transgene integration into the same chromosome location can produce alleles that express at a predictable level， or alleles that are differentially silenced[J]. Genes and Development， 2000， 14： 2869-2880.

[3] VERGUNST A C， JANSEN L E T， HOOYKAAS P J J. Site-specific integration ofAgrobacteriumT-DNA inArabidopsisthalianamediated by Cre recombinase[J]. Nucleic Acids Research， 1998， 26： 2729-2734.

[4] CHUNG M H， CHEN M K， PAN S M. Floral spray transformation can efficiently generateArabidopsistransgenic plants[J]. Transgenic Research， 2000， 9： 471-476.

[5] MINDRINOS M， KATAGIRI F， YU G L， et al. TheA.thalianadisease resistance geneRps2 encodes a protein containing a nucleotide-binding site and leucine-rish repeats[J]. Cell， 1994， 78： 1089-1099.

[6] MACQUEEN A， SUN X Q， BERGELSON J. Genetic architecture and pleiotropy shape costs ofRps2-mediated resistance inArabidopsisthaliana[J]. Nature Plants， 2016， 2： 1-8.

[7] MATTANOVICH D， HIMMLER G， REGNER F， et al. Stopping the DNA polymerase activity at a specific site with a dideoxyoligo-nucleotide： selective labelling of single stranded circular DNA[J]. Nucleic Acids Research， 1989， 17： 8384.

[8] GHERBI H， GALLEGO M E， JALUT N， et al. Homologous recombinationinplantais stimulated in the absence of Rad50[J]. EMBO Reports， 2001， 2： 287-291.

[9] JEFFERSON R A， KAVANAGH T A， BEVAN M W. GUS fusions：β-glucuronidase as a sensitive and versatile gene fusion marker in higher plants[J]. The EMBO Journal， 1987， 6： 3901-3907.

[10] HEID C A， STEVENS J， LIVAK K J， et al. Real time quantitative PCR[J]. Genome Research， 1996， 6： 986-994.

[11] GAO L P， ROUX F， BERGELSON J. Quantitative fitness effects of infection in a gene-for-gene system[J]. New Phytologist， 2009， 184： 485-494.

[12] SRIVASTAVA V， OW D W. Biolistic mediated site-specific integration in rice[J]. Molecular Breeding， 2001， 8： 345-350.

(責任編輯： 郭嚴冬)

Technology system research on site-specific integration ofRps2 gene inArabidopsisthalianabased on Cre/loxsystem by floral spraying method

LI Dinghong， ZHANG Yanmei， ZHOU Guangcan， LEI Zhao， SUN Xiaoqin①， HANG Yueyu①

(Institute of Botany， Jiangsu Province and Chinese Academy of Sciences， Nanjing 210014， China)，

J.PlantResour. &Environ.， 2017， 26(1)： 104-106

To improve site-specific integration technology system， site-specific integration ofRps2 target gene inArabidopsisthaliana(Linn.) Heynh. was carried out based on Cre/loxsystem by floral spraying method. The results show that 1 495 site-specific integration candidate plants are obtained by this method with a site-specific integration efficiency of about 0.076%. After PCR and histochemical staining experiment verification， the positive plants of precise integration account for 86.04%， in which， 63.34% positive plants are single copy transformed plants. The results of quantitative real-time PCR (qRT-PCR) and hypersensitive reaction (HR) show that the site-specific integratedRps2 gene can be transcribed and expressed normally. It is suggested that this system can greatly improve the stability and efficiency of site-specific integration genetic transformation system in plants.

Cre/lox系統(tǒng)；Rps2基因； 定點整合； 擬南芥； 花器噴霧法

Cre/loxsystem；Rps2 gene； site-specific integration；Arabidopsisthaliana(Linn.) Heynh.； floral spraying method

2016-09-08

江蘇省科技計劃項目(省屬公益類科研院所能力提升)(BM2015019)； 江蘇省自然科學基金資助項目(BK2010476)； 江蘇省植物遷地保護重點實驗室開放基金項目(遷201202)； 江蘇省中國科學院植物研究所青年基金項目(SQ201404)

李定紅(1991—)，女，安徽滁州人，碩士研究生，主要從事植物分子遺傳與進化方面的研究。

①通信作者E-mail： xiaoqinsun@cnbg.net； hangyueyu@cnbg.net

Q785； Q949.748.3

A

1674-7895(2017)01-0104-03

10.3969/j.issn.1674-7895.2017.01.14