姬松茸多糖ABP-AW1對免疫功能低下小鼠的免疫增強(qiáng)作用

蔣麗艷，于智浦，姚淑娟，劉伯陽，劉吉成

（齊齊哈爾醫(yī)學(xué)院1.醫(yī)學(xué)技術(shù)學(xué)院，2.附屬第二醫(yī)院，黑龍江齊齊哈爾 161000）

·論 著·

姬松茸多糖ABP-AW1對免疫功能低下小鼠的免疫增強(qiáng)作用

蔣麗艷1，于智浦2，姚淑娟1，劉伯陽1，劉吉成1

（齊齊哈爾醫(yī)學(xué)院1.醫(yī)學(xué)技術(shù)學(xué)院，2.附屬第二醫(yī)院，黑龍江齊齊哈爾 161000）

目的探討低分子質(zhì)量姬松茸多糖ABP-AW1對免疫功能低下小鼠的免疫增強(qiáng)作用。方法ICR小鼠ip給予環(huán)磷酰胺80 mg·kg-1，連續(xù)3 d，制備免疫功能低下小鼠模型；隨后分別ig給予ABP-AW1 125，250和500 mg·kg-1，每天1次，連續(xù)7 d。治療結(jié)束后處死小鼠，檢測小鼠胸腺指數(shù)和脾指數(shù)，碳廓清實驗檢測小鼠巨噬細(xì)胞吞噬功能，MTT法檢測小鼠脾淋巴細(xì)胞增殖反應(yīng)，ELISA法檢測小鼠脾淋巴細(xì)胞分泌白細(xì)胞介素2（IL-2）和干擾素γ（IFN-γ）水平，流式細(xì)胞術(shù)檢測小鼠脾T淋巴細(xì)胞亞群CD4+/CD8+比值。結(jié)果與正常對照組比較，免疫低下模型小鼠胸腺指數(shù)和脾指數(shù)以及巨噬細(xì)胞吞噬指數(shù)均降低（P＜0.05）；ABPAW1 250和500 mg·kg-1可顯著提高免疫低下模型小鼠胸腺指數(shù)和脾指數(shù)（P＜0.05），升高巨噬細(xì)胞吞噬指數(shù)（P＜0.05）。與正常對照組比較，模型小鼠伴刀豆凝集素A（Con A）和脂多糖（LPS）分別誘導(dǎo)的T淋巴細(xì)胞增殖反應(yīng)和B淋巴細(xì)胞增殖反應(yīng)降低，脾細(xì)胞分泌IL-2和IFN-γ水平降低，脾細(xì)胞CD4+/CD8+比值下降（P＜0.05）；與模型組比較，ABP-AW1 250和500 mg·kg-1可促進(jìn)免疫低下模型小鼠Con A和LPS分別誘導(dǎo)的T淋巴細(xì)胞增殖反應(yīng)和B淋巴細(xì)胞增殖反應(yīng)（P＜0.05），顯著增加脾細(xì)胞IL-2和IFN-γ水平（P＜0.05），明顯逆轉(zhuǎn)免疫低下小鼠脾細(xì)胞CD4+/CD8+比值的下降（P＜0.05）。結(jié)論ABP-AW1對免疫功能低下小鼠具有一定的免疫增強(qiáng)作用。

姬松茸；多糖；ABP-AW1；環(huán)磷酰胺；免疫抑制

姬松茸（Agaricus blazeiMurill，ABM）又名巴西蘑菇，原產(chǎn)于巴西，是一種兼具藥用及食用價值的名貴真菌［1］。研究表明，藥用ABM具有免疫調(diào)節(jié)、抗炎和抗腫瘤等多種藥理學(xué)作用［2］。多糖是ABM的主要成分之一，因其具有天然、低毒等優(yōu)勢而受到廣大學(xué)者的關(guān)注。大量實驗資料表明，ABM多糖有抗炎和抗腫瘤等功效［3-5］。本實驗室從ABM子實體中分離純化出一種結(jié)構(gòu)新穎的水溶性多糖，代號為ABP-AW1，并經(jīng)氣相色譜和高效凝膠排阻色譜等方法確定其為組分均一的低分子質(zhì)量（50 ku）多糖［6］。前期研究結(jié)果表明，ABP-AW1可以增強(qiáng)卵白蛋白致敏小鼠的體液免疫和細(xì)胞免疫功能［7］。本研究觀察ABP-AW1對免疫功能低下模型小鼠的免疫增強(qiáng)作用，為其開發(fā)應(yīng)用提供實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 藥物、主要試劑和儀器

ABP-AW1由齊齊哈爾醫(yī)學(xué)院醫(yī)藥研究所分離純化［6］，純度＞95%，用生理鹽水配置。注射用環(huán)磷酰胺（cyclophosphamide，Cy）購自上海華聯(lián)制藥有限公司，用生理鹽水配置；RPMI 1640培養(yǎng)基和胎牛血清（fetal bovine serum，F(xiàn)BS）購自美國HyClone公司；小鼠脾淋巴細(xì)胞分離液、白細(xì)胞介素2（interleukin 2，IL-2）和干擾素γ（interferon-γ，IFN-γ）檢測用ELISA試劑盒購自北京達(dá)科為生物技術(shù)有限公司；大鼠抗小鼠CD4-FITC抗體、大鼠抗小鼠CD8a-PE抗體、MTT和二甲亞砜（DMSO）均購自美國Sigma公司；伴刀豆凝集素A（concanavalin A，ConA）和脂多糖（lipopolysaccharides，LPS）購自美國Sigma公司。酶標(biāo)儀（奧地利TECAN公司）；FACS Calibur流式細(xì)胞儀（美國BD公司）。

1.2 動物

健康雌性ICR小鼠，體質(zhì)量18～22 g，由吉林大學(xué)白求恩醫(yī)學(xué)院實驗動物中心提供，實驗動物合格證號SCXK（吉）-2015-003。小鼠常規(guī)飼養(yǎng)于齊齊哈爾醫(yī)學(xué)院實驗動物中心，許可證SYXK（黑）2016-001，室溫20～24℃，濕度55%～70%，12/12 h光照/黑暗，自由飲水?dāng)z食。

1.3 動物分組和給藥

將小鼠隨機(jī)分為5組：正常對照組、模型對照組及ABP-AW1 125，250和500 mg·kg-1組，每組10只。除正常對照組外，各組小鼠ip給予Cy 80 mg·kg-1，每天1次，連續(xù)3 d，制備免疫低下模型小鼠；正常對照組小鼠給予等量生理鹽水。隨后ABP-AW1組小鼠每天分別ig給予ABP-AW1 125，250和500 mg·kg-1，每天1次，連續(xù)7 d；正常對照組和模型對照組予以等量生理鹽水。

1.4 小鼠巨噬細(xì)胞吞噬功能的測定

末次給藥后1 h，測體質(zhì)量，各鼠尾靜脈注射印度墨汁（10 mL·kg-1），注射后2 min（T1）和10 min（T2）從小鼠眼眶靜脈叢取血20 μL，溶于0.1% Na2CO3溶液2.0 mL，搖勻后放置20 min，于680 nm波長處測定T1和T2時間點(diǎn)樣品的吸光度（A1和A2）值。根據(jù)公式計算廓清指數(shù)（K），K=（lgA1-lgA2）/（T2-T1）［8］。將小鼠處死，取肝和脾稱重，計算吞噬指數(shù)（α），α=K1/3×體質(zhì)量/（肝質(zhì)量+脾質(zhì)量）［8］

1.5 小鼠臟器指數(shù)的測定

分離小鼠脾和胸腺，稱重，依據(jù)公式計算脾指數(shù)和胸腺指數(shù)。胸腺指數(shù)=胸腺質(zhì)量（mg）/體質(zhì)量（g）；脾指數(shù)=脾質(zhì)量（mg）/體質(zhì)量（g）。

1.6 小鼠脾淋巴細(xì)胞增殖實驗

參照小鼠脾淋巴細(xì)胞分離液說明書，分離各組小鼠脾淋巴細(xì)胞，制備脾淋巴細(xì)胞懸液。按每孔100 μL含5×105細(xì)胞將細(xì)胞接種至96孔培養(yǎng)板［9］。設(shè)細(xì)胞對照組、Con A組和LPS組，每組設(shè)3復(fù)孔。細(xì)胞對照組細(xì)胞用完全培養(yǎng)基常規(guī)培養(yǎng)，Con A和LPS組細(xì)胞在接種當(dāng)天分別給予含Con A 5 mg·L-1或LPS 1 mg·L-1的培養(yǎng)基培養(yǎng)。將細(xì)胞置于37℃、含5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)60 h后，各孔加入MTT 5 g·L-1溶液20 μL，繼續(xù)培養(yǎng)4 h。隨后棄上清液，每孔加入150 μL DMSO，振蕩溶解結(jié)晶，酶標(biāo)儀測定570 nm波長處的吸光度（A570nm）值。

1.7 小鼠脾淋巴細(xì)胞IL-2和IFN-γ水平的測定

參照IL-2和IFN-γ的ELISA試劑盒說明書，檢測1.6項制備的脾淋巴細(xì)胞培養(yǎng)上清液中IL-2及IFN-γ的含量。

1.8 流式細(xì)胞術(shù)檢測小鼠脾T淋巴細(xì)胞亞群CD4+/ CD8+比值

取各組小鼠脾淋巴細(xì)胞懸液50 μL置于流式管中，加入大鼠抗小鼠CD4-FITC抗體和大鼠抗小鼠CD8a-PE抗體，混勻后在室溫下避光孵育30 min。加入PBS 2 mL，250×g離心5 min，用PBS洗滌細(xì)胞2次。棄去上清，加入PBS 0.5 mL溶液將細(xì)胞重懸，用BD FACS Calibur流式細(xì)胞儀檢測CD4+和CD8+T淋巴細(xì)胞，計算CD4+/CD8+比值。

1.9 統(tǒng)計學(xué)分析

實驗結(jié)果數(shù)據(jù)以x±s表示，應(yīng)用統(tǒng)計軟件SPSS17.0進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析，組間比較采用單因素方差（ANOVA）分析和t檢驗，P＜0.05為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 ABP-AW1對免疫低下小鼠巨噬細(xì)胞吞噬功能的影響

圖1結(jié)果可見，與正常對照組相比，Cy誘導(dǎo)的免疫抑制小鼠巨噬細(xì)胞吞噬功能減退，吞噬指數(shù)顯著減?。≒＜0.05）。與模型組相比，ABP-AW1 250和500 mg·kg-1治療7 d，可顯著提高Cy所致免疫低下模型小鼠巨噬細(xì)胞吞噬指數(shù)（P＜0.05）。

Fig.1 Effect of ABP-AW1,low-molecular-mass poly?saccharides isolated from Agaricus blazei Murill，on phagocytic index of cyclophosphamide（Cy）-induced immunosuppression mice.Mice were ip given Cy 80 mg·kg-1once daily for three days，and then were administrated ig with ABP-AW1 for 7 d.，n=10.＊P＜0.05，compared with normal control group；#P＜0.05，compared with Cy group.

2.2 ABP-AW1對免疫低下小鼠臟器指數(shù)的影響

圖2結(jié)果可見，與正常對照組比較，模型組小鼠胸腺指數(shù)和脾指數(shù)顯著降低（P＜0.05）。與模型組相比，ABP-AW1 250和500 mg·kg-1治療7 d顯著提高免疫低下小鼠的胸腺指數(shù)和脾指數(shù)（P＜0.05），但尚未達(dá)到正常對照組水平。

2.3 ABP-AW1對免疫低下小鼠脾淋巴細(xì)胞增殖反應(yīng)的影響

Fig.2 Effect of ABP-AW1 on organ index of Cy-induced immunosuppression mice.See Fig.1 for the mouse treat?ment.Thymus index=thymus mass（mg）/body mass（g）.Spleen index=spleen mass（mg）/body mass（g）.n=10.＊P＜0.05，compared with corresponding normal control group；#P＜0.05，compared with corresponding Cy group.

圖3結(jié)果表明，采用Con A和LPS分別刺激脾淋巴細(xì)胞，模型小鼠脾淋巴細(xì)胞增殖反應(yīng)均受到明顯抑制（P＜0.05）；與模型組相比，ABP-AW1 250和500 mg·kg-1治療7 d可促進(jìn)Con A誘導(dǎo)的T淋巴細(xì)胞增殖反應(yīng)（P＜0.05）和LPS誘導(dǎo)的B淋巴細(xì)胞增殖反應(yīng)（P＜0.05），只有500 mg·kg-1組可以達(dá)到正常對照組水平，其余組與正常對照組相比仍有顯著差異（P＜0.05）。

Fig.3 Effect of ABP-AW1 on spleen lymphocyte prolifer?ation induced by concanavalin A（Con A）or lipopoly?sacchride（LPS）in Cy-induced immunosuppression mice detected by MTT method.See Fig.1 for the mouse treatment.n=10.＊P＜0.05，compared with corresponding normal control group；#P＜0.05，compared with corresponding Cy group.

2.4 ABP-AW1對免疫低下小鼠脾細(xì)胞細(xì)胞因子生成的影響

圖4結(jié)果可見，模型組小鼠脾細(xì)胞IL-2和IFN-γ水平較正常對照組顯著降低（P＜0.05）。給予ABPAW1 250和500 mg·kg-1治療7 d，能顯著增加免疫低下小鼠脾細(xì)胞IL-2和IFN-γ的生成（P＜0.05），但均未恢復(fù)至正常對照組水平（P＜0.05）。

Fig.4 Effect of ABP-AW1 on levels of interleukin-2（IL-2）and interferon-γ（IFN-γ）in spleen lymphocytes of Cyinduced immunosuppression mice.See Fig.1 for the mouse treatment.，n=10.＊P＜0.05，compared with corre?sponding normal control group；#P＜0.05，compared with corre?sponding Cy group.

2.5 ABP-AW1對免疫低下小鼠T淋巴細(xì)胞亞群CD4+/CD8+的影響

Fig.5 Effect of ABP-AW1 on T lymphocyte CD4+/CD8+ratio in spleen of Cy-induced immunosuppression mice.See Fig.1 for the mouse treatment.A：representative data of flow cytometric analysis；B：the quantification of A.n=10.＊P＜0.05，compared with normal control group；#P＜0.05，com?pared with Cy group.

圖5結(jié)果表明，與正常對照組相比，免疫低下模型小鼠脾T淋巴細(xì)胞亞群CD4+/CD8+比值顯著降低（P＜0.05）。與模型組相比，ABP-AW1 250和500 mg·kg-1治療7 d可逆轉(zhuǎn)免疫低下模型小鼠脾細(xì)胞CD4+/CD8+比值的下降（P＜0.05），但尚未達(dá)到正常對照組水平。

3 討論

Cy是一種烷化類免疫抑制劑，可殺傷淋巴細(xì)胞，抑制細(xì)胞免疫和體液免疫，因而常用于制備免疫功能低下動物模型［10-12］。本研究選用單次ip給予Cy 80 mg·kg-1抑制小鼠免疫功能。結(jié)果顯示，模型組小鼠免疫功能與正常對照組比較明顯降低，表明成功制備免疫功能低下小鼠模型。

本課題組前期研究結(jié)果顯示，低分子量ABM多糖具有抗腫瘤功效，能顯著抑制體外培養(yǎng)肝癌細(xì)胞的遷移能力［4］。這種抗腫瘤效應(yīng)可能與其增強(qiáng)NK細(xì)胞活性有關(guān)［13］，提示低分子質(zhì)量ABM多糖可能具有免疫增強(qiáng)作用。本研究進(jìn)一步研究了低分子質(zhì)量ABM多糖ABP-AW1對免疫功能低下小鼠的免疫增強(qiáng)作用。結(jié)果顯示，小鼠ig給予ABP-AW1 250和500 mg·kg-1治療7 d，可改善免疫低下小鼠胸腺和脾萎縮，使胸腺指數(shù)和脾指數(shù)升高。

單核巨噬細(xì)胞的吞噬能力是衡量機(jī)體非特異性免疫功能的指標(biāo)之一［14］。本研究結(jié)果表明，ABPAW1 250和500 mg·kg-1組小鼠巨噬細(xì)胞吞噬指數(shù)較模型組明顯提高，提示ABP-AW1對免疫低下小鼠的非特異性免疫功能有一定的增強(qiáng)作用。淋巴細(xì)胞增殖反應(yīng)能夠直接反映機(jī)體免疫功能狀態(tài)。淋巴細(xì)胞按其功能不同可分為B淋巴細(xì)胞、T淋巴細(xì)胞和NK細(xì)胞。一般以LPS刺激B淋巴細(xì)胞增殖，Con A誘導(dǎo)T淋巴細(xì)胞增殖，用于檢測檢測B和T細(xì)胞的免疫反應(yīng)［15-16］。本研究結(jié)果表明，ABPAW1治療7 d能顯著促進(jìn)免疫低下小鼠脾T淋巴細(xì)胞和B淋巴細(xì)胞增殖反應(yīng)，提示ABP-AW1可能通過促進(jìn)機(jī)體淋巴細(xì)胞的增殖活性，提高機(jī)體免疫功能。IL-2和IFN-γ是在機(jī)體免疫調(diào)節(jié)中起重要作用的細(xì)胞因子，主要由活化的Th1細(xì)胞或CD4+T細(xì)胞產(chǎn)生。本研究結(jié)果表明，模型組小鼠脾淋巴細(xì)胞中IL-2和IFN-γ水平較低，而ABP-AW1 250和500 mg·kg-1治療能促進(jìn)免疫低下小鼠脾淋巴細(xì)胞生成IL-2和IFN-γ，這可能是ABP-AW1調(diào)節(jié)機(jī)體免疫功能的機(jī)制之一。T淋巴細(xì)胞亞群在病毒感染和惡性腫瘤等多種疾病中都會發(fā)生異常改變。一般認(rèn)為，CD4+/ CD8+細(xì)胞比值在一定程度上可以反映機(jī)體的免疫功能狀態(tài)，CD4+/CD8+細(xì)胞比值下降，表明機(jī)體免疫功能低下；CD4+/CD8+比值升高，表明免疫功能增強(qiáng)［17-18］。本研究結(jié)果顯示，模型組小鼠脾CD4+/ CD8+細(xì)胞比值明顯低于正常對照組，ABP-AW1 250和500 mg·kg-1可使CD4+/CD8+細(xì)胞比值明顯升高，提示ABP-AW1可改善免疫低下小鼠的免疫功能狀態(tài)。

綜上所述，ig給予ABP-AW1 250和500 mg·kg-1連續(xù)7 d，對免疫功能低下小鼠具有免疫增強(qiáng)作用。降低ABP-AW1劑量并延長給藥時間，或者提高ABP-AW1劑量能否進(jìn)一步增強(qiáng)療效有待進(jìn)一步研究。

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Immunity-enhancing effect of polysaccharide ABP-AW1 isolated from Agaricus blazei Murill on immunosuppressive mice

JIANG Li-yan1,YU Zhi-pu2,YAO Shu-juan1,LIU Bai-yang1,LIU Ji-cheng1

(1.College of Medical Technology,2.The Second Affiliated Hospital,Qiqihar Medical University, Qiqihar 161000,China)

OBJECTIVETo explore the immunity-enhancing effect of ABP-AW1,a low-molecularmass polysaccharides isolated fromAgaricus blazeiMurill,on immunosuppressive mice.METHODSICR mice were ip injected cyclophosphamide 80 mg·kg-1,once daily for 3 d,to establish an immuno?suppressive mouse model.Then,ABP-AW1 125,250 and 500 mg·kg-1were ig given to the immuno?suppressive mice,respectively,once daily for 7 d.The mouse thymus index and spleen index were calcu?lated,and the phagocytic function of phagocytes was determined using carbon clearance test.Splenic lym?phocyte proliferation was measured by MTT method.The interleukin 2(IL-2)and interferon γ(IFN-γ) production from splenic lymphocytes was examined by ELISA.The splenic lymphocyte CD4+/CD8+ratio was determined by flow cytometric analysis.RESULTSCompared with normal control group,the thymus index,spleen index and phagocytic index of phagocytes in the immunosuppressive model mice declined(P＜0.05).ABP-AW1 250 and 500 mg·kg-1treatment significantly increased the thymus index,spleen index and phagocytic index in immunosuppressive mice(P＜0.05).Compared with normal control group,concanavalin A(Con A)and lipopolysaccharide(LPS)induced T and B lymphocyte proliferation, respectively,and IL-2 and IFN-γ production from splenic lymphocytes in the immunosuppressive model mice was lower(P＜0.05).Compared with model group,ABP-AW1 250 and 500 mg·kg-1promoted Con A and LPS induced T and B lymphocyte proliferation(P＜0.05),and elevated IL-2 and IFN-γ production from splenic lymphocytes(P＜0.05).In addition,ABP-AW1 250 and 500 mg·kg-1reversed the decreased splenocyte CD4+/CD8+ratio in immunosuppressive model mice(P＜0.05).CONCLUSIONABP-AW1 has immuneity-enhancing effect on cyclophosphamide-induced immunosuppressive mice.

Agaricus blazeiMurill;polysaccharides;ABP-AW1;cyclophosphamide;immunosup?pression

The project supported by National Natural Science Foundation of China(81173609)

LIU Ji-cheng,Tel:13304621328,E-mail:qyybliu@126.com

R285.1

：A

：1000-3002-（2017）05-0393-06

10.3867/j.issn.1000-3002.2017.05.003

2016-11-22 接受日期：2017-05-12）

（本文編輯：齊春會）

國家自然科學(xué)基金（81173609）

蔣麗艷，碩士研究生，主要從事藥理學(xué)研究；劉吉成，博士，教授，主要從事分子藥理學(xué)和腫瘤藥理學(xué)研究。

劉吉成，Tel：13304621328，E-mail：qyybliu@ 126.com