腎小管上皮細(xì)胞G2- M期阻滯在缺氧誘導(dǎo)的腎間質(zhì)纖維化中的作用

劉婷，黨楊杰，劉利敏，張磊，付愛萍，張玉明，吳笛,杜銳，孫世仁

(1.第四軍醫(yī)大學(xué)西京醫(yī)院 腎內(nèi)科，國家腫瘤重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 陜西 西安 710032； 2.軍事口腔醫(yī)學(xué)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,口腔疾病國家臨床醫(yī)學(xué)研究中心,陜西省口腔生物工程技術(shù)研究中心，第四軍醫(yī)大學(xué)口腔醫(yī)學(xué)院麻醉科陜西 西安 710032； 3.第四軍醫(yī)大學(xué)學(xué)員一旅；4.海軍總醫(yī)院腫瘤診療中心 北京 100048)

·論 著·

腎小管上皮細(xì)胞G2- M期阻滯在缺氧誘導(dǎo)的腎間質(zhì)纖維化中的作用

劉婷1，黨楊杰2，劉利敏1，張磊1，付愛萍1，張玉明1，吳笛3,杜銳4，孫世仁1

(1.第四軍醫(yī)大學(xué)西京醫(yī)院 腎內(nèi)科，國家腫瘤重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 陜西 西安 710032； 2.軍事口腔醫(yī)學(xué)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,口腔疾病國家臨床醫(yī)學(xué)研究中心,陜西省口腔生物工程技術(shù)研究中心，第四軍醫(yī)大學(xué)口腔醫(yī)學(xué)院麻醉科陜西 西安 710032； 3.第四軍醫(yī)大學(xué)學(xué)員一旅；4.海軍總醫(yī)院腫瘤診療中心 北京 100048)

目的：探討腎小管上皮細(xì)胞G2- M期阻滯在缺氧誘導(dǎo)的腎間質(zhì)纖維化中的作用。方法：體外實(shí)驗(yàn)，人腎小管上皮細(xì)胞(HK2)分別置于常氧21%和缺氧1%的孵箱里，培養(yǎng)24，48 hrs。采用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)缺氧48 hrs后上皮細(xì)胞的周期分布；采用Western blot法檢測(cè)Collagen4A1(COL4A1)及α- 平滑肌肌動(dòng)蛋白(α- SMA)的蛋白表達(dá)水平。單側(cè)輸尿管梗阻(UUO)14 d小鼠模型，HE及Masson染色觀察腎組織病理改變及纖維化程度，免疫組化染色觀察α- SMA的表達(dá)及部位；Western blot檢測(cè)低氧標(biāo)記分子HIF- 1α、細(xì)胞周期蛋白cyclinB1和cyclinD1的蛋白水平。結(jié)果：與常氧組比較，缺氧組腎小管上皮細(xì)胞G2/M期比例增高(P<0.05)，同時(shí)α- SMA和COL4A1的蛋白表達(dá)水平增高(P<0.05)；與假手術(shù)組比較，HE及Masson染色顯示模型組腎組織纖維化程度增高，α- SMA的表達(dá)增高且主要分布在間質(zhì)中；Western blot結(jié)果顯示：HIF- 1α及G2/M期標(biāo)記物cyclinB1/cyclinD1比值增加。結(jié)論：腎小管上皮細(xì)胞G2- M期阻滯參與缺氧誘導(dǎo)的腎間質(zhì)纖維化。

缺氧； G2- M阻滯； 腎小管上皮細(xì)胞； 腎間質(zhì)纖維化

腎間質(zhì)纖維化是各種慢進(jìn)腎臟病發(fā)展至終末期腎臟病的主要病理變化和共同通路[1]，以炎細(xì)胞浸潤，成纖維細(xì)胞的激活和增殖，細(xì)胞外基質(zhì)(extracellular matrix,ECM)大量沉積[2]，腎臟固有細(xì)胞消失以及微血管減少為特征。近來研究發(fā)現(xiàn)，缺氧損傷是影響腎間質(zhì)纖維化的關(guān)鍵因素和重要途徑[4]，大量研究發(fā)現(xiàn)缺氧有可能通過細(xì)胞表型發(fā)生間充質(zhì)轉(zhuǎn)變、啟動(dòng)炎癥反應(yīng)及免疫應(yīng)答，刺激成纖維細(xì)胞增殖和能量代謝障礙，導(dǎo)致纖維化相關(guān)因子大量釋放和細(xì)胞外基質(zhì)合成與降解失衡最終促進(jìn)腎間質(zhì)纖維化的發(fā)生[3- 5]，但我們研究發(fā)現(xiàn)缺氧能誘導(dǎo)腎小管上皮細(xì)胞發(fā)生G2/M期阻滯，提示除了以上途徑外，缺氧還可能通過其他機(jī)制參與腎間質(zhì)纖維化的過程。因此本研究旨在闡明缺氧能通過腎小管上皮細(xì)胞G2/M期阻滯參與腎間質(zhì)纖維化。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

HK2細(xì)胞購于上海細(xì)胞庫，流式細(xì)胞儀由第四軍醫(yī)大學(xué)生化教研室提供。HIF- 1α(北京博奧森生物技術(shù)有限公司)、羊抗兔α- SMA抗體(abcam公司)、羊抗兔Collagen4A1(COLA1)抗體(上海生工)和β- actin(北京博奧森生物技術(shù)有限公司)；羊抗兔IgG- HRP Santa Cruz公司；F12培養(yǎng)基(HyClone)；胎牛血清(浙江天杭生物),HE染色試劑盒(北京藍(lán)博斯特生物技術(shù)有限公司)及病理特殊染色液套組Masson三色染色液試劑盒(珠海貝索生物技術(shù)有限公司)。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) 細(xì)胞于含10%胎牛血清的F12培養(yǎng)基中培養(yǎng)，消化傳代如常。以1×105/瓶接種于25 cm2的大皿，生長至70%- 80%時(shí)，換成無血清F12培養(yǎng)基，培養(yǎng)24 hrs以達(dá)到同步化處理。細(xì)胞分為常氧組(氧濃度21%)和缺氧組(1% O2)，將缺氧組細(xì)胞置于1% O2、5% CO2、37 ℃的缺氧孵箱中培養(yǎng)24 hrs、48 hrs，常氧組細(xì)胞置于21% O2、5% CO2、37 ℃的常氧孵箱中培養(yǎng)24 hrs、48 hrs。

1.2.2 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞周期分布 常規(guī)消化分組處理人腎小管上皮細(xì)胞，48 hrs 后收集細(xì)胞并加入2 mL PBS吹懸后離心，重復(fù)加PBS洗一次，棄上清后加入2 mL無水乙醇和1 mL PBS吹勻細(xì)胞，置于4 ℃冰箱固定過夜，次日送檢。

1.2.3 Western blot法檢測(cè) HIF- 1α、α- SMA、COL4A1、cyclinB1、cyclinD1的蛋白表達(dá)：將常氧組及缺氧組細(xì)胞用4 ℃預(yù)冷的PBS洗一遍，置于冰上，然后分別加入200 μL的RIPA裂解液，將細(xì)胞用細(xì)胞刮刮下，加入1.5 mL離心管中，置于冰上裂解15 mins后用超聲槍吹打5- 7次，再裂解10 mins，隨后4 ℃下12 000 r·min-1離心20 mins，取上清。留取30 μL采用BCA法測(cè)定上清中蛋白量，其余上清中加入1/4體積的5×上樣緩沖液，混勻后置于上100 ℃ 5 mins，即為制備好的蛋白樣品，于- 20 ℃冰箱保存。取假手術(shù)組及模型組小鼠左側(cè)腎組織，加裂解液后勻漿，離心，取上清，測(cè)蛋白濃度，加各組蛋白上樣液進(jìn)行SDS- PAGE凝膠電泳，PVDF轉(zhuǎn)膜，室溫封閉液封閉1 h，分別加一抗，β- actin(1∶1 500,Bioss,China),HIF- 1α(1∶400,Bioss,China)，a-SMA(1∶1 000,Abcam),COL4A1(1∶300,SangonBiotech.Co.),cyclinB1(1∶200,SangonBiotech.Co.)，cyclinD1(1∶500,SangonBiotech.Co.)4 ℃孵育過夜，TBST洗膜3次，與HRP標(biāo)記的二抗孵育1h，TBST洗膜3次,最后ECL顯色。

1.2.4 動(dòng)物模型 雄性C57小鼠(由第四軍醫(yī)大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供)，6- 8周，體重20- 25g。實(shí)驗(yàn)前小鼠維持12hrs晝夜交替周期的標(biāo)準(zhǔn)條件下，適應(yīng)性飼養(yǎng)一周，環(huán)境溫度22～26 ℃，濕度40%～70%，自由進(jìn)食、飲水。實(shí)驗(yàn)期間動(dòng)物自由飲用自來水，進(jìn)食標(biāo)準(zhǔn)顆粒飼料，術(shù)前12hrs禁食，自由飲水。將小鼠隨機(jī)分為兩組：假手術(shù)組(6只)及模型組(6只)。選用單側(cè)輸尿管梗阻(UUO)致腎間質(zhì)纖維化模型，即:用1.5%的戊巴比妥鈉按50mg·kg-1腹腔麻醉動(dòng)物，固定，去毛消毒后打開左側(cè)腹腔并雙重結(jié)扎左側(cè)輸尿管，消毒后縫合傷口，關(guān)閉腹腔。假手術(shù)組麻醉后打開腹腔，分離左側(cè)輸尿管但不結(jié)扎，消毒后縫合傷口，關(guān)閉腹腔。于手術(shù)后14d麻醉灌注后處死兩組小鼠，取梗阻側(cè)腎臟，部分組織固定于4%多聚甲醛中待免疫組化染色，剩余組織保存于-80 ℃冰箱中蛋白分析。

1.2.5HE及Masson染色 用HE染色試劑盒(北京藍(lán)博斯特生物技術(shù)有限公司)及病理特殊染色液套組Masson三色染色液試劑盒(珠海貝索生物技術(shù)有限公司)說明書進(jìn)行染色。

1.2.6 免疫組織化學(xué)染色 石蠟切片常規(guī)脫蠟水化，用0.3%甲醇-H2O2液滅活內(nèi)源性過氧化物酶，用枸櫞酸緩沖液微波煮沸法進(jìn)行抗原修復(fù)，然后用血清封閉30mins，加入一抗anti-a-SMA(1∶650,Abcam)，于4 ℃冰箱過夜。次日加生物素標(biāo)記的二抗，室溫1h，滴加鏈霉親和素- 過氧化物酶封閉30mins,DAB顯色后，蘇木素襯染細(xì)胞核，自來水沖洗后，常規(guī)脫水，透明，封片。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié) 果

2.1 缺氧刺激HK2細(xì)胞G2/M期比例增加

通過流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)常氧組和缺氧組細(xì)胞培養(yǎng)48 hrs后周期比例的變化，結(jié)果顯示，缺氧組G2/M期細(xì)胞比例(11.96±0.07)高于常氧組G2/M期細(xì)胞比例(6.47±1.16)(圖1)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

2.2 缺氧刺激HK2細(xì)胞表達(dá)纖維化因子COL4A1及α- SMA

通過Western blot方法檢測(cè)常氧組和缺氧組細(xì)胞培養(yǎng)24 hrs及48 hrs后，纖維化因子COL4A1及α- SMA的蛋白表達(dá)水平。結(jié)果顯示與常氧組(0 h)相比，缺氧組細(xì)胞纖維化因子COL4A1及α- SMA在缺氧不同時(shí)間點(diǎn)蛋白表達(dá)增加(圖2A、B)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(aP<0.05)。

2.3 UUO模型腎臟間質(zhì)纖維化的程度

HE染色顯示模型組腎小管擴(kuò)張，小管上皮細(xì)胞變性或壞死，炎癥細(xì)胞浸潤(圖3A、B、)；Masson染色顯示UUO 14 d腎間質(zhì)發(fā)生明顯纖維化(圖3C、D)；α- SMA在模型組顯著高表達(dá)，并且主要定位于間質(zhì)中(圖3E、F)。

2.4 UUO模型HIF- 1α及細(xì)胞周期蛋白的表達(dá)

與假手術(shù)組比較，模型組HIF- 1α表達(dá)增加，細(xì)胞周期蛋白cyclinB1表達(dá)增加而cyclinD1的表達(dá)降低(圖4A、B)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(aP<0.05)。cyclinB1與cyclinD1的比值是G2/M期的標(biāo)記物，結(jié)果顯示，與假手術(shù)組比較，cyclinB1/cyclinD1在UUO 14 d后表達(dá)增加(圖4C)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(aP<0.05)，即G2/M期細(xì)胞比例增加。

圖1 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)常氧組和缺氧組細(xì)胞周期比例的變化

Fig 1 To detect the cell cycle distribution of HK2 cells by flow cytometry in normoxia and hypoxia group

A、B. Western blot方法檢測(cè)常氧組和缺氧組細(xì)胞纖維化因子COL4A1及α- SMA的蛋白表達(dá)水平

A、B. To examine the protein level of COL4A1and α- SMA in normoxia and hypoxia group by Western blot

圖2 缺氧刺激HK2細(xì)胞表達(dá)纖維化因子COL4A1及α- SMA

Fig 2 Hypoxia induced the expression of COL4A1and α- SMA in HK2 cells

A、B.HE染色觀察假手術(shù)組(sham組)及模型組(UUO 14 d)腎組織病理改變；C、D.Masson染色觀察假手術(shù)組及模型組腎臟纖維化程度；E、F.免疫組化染色觀察假手術(shù)組及模型組腎組織α- SMA表達(dá)及部位(n=6×400)。

A、B.Observed the pathological changes by HE in sham and UUO group. C、D.Observed renal tissue fibrosis degree by Masson staining in sham and UUO group.E、F.The expression and distribution of α- SMA was detected by immunohistochemical staining in sham and UUO group(n=6×400).

圖3 UUO模型腎臟纖維化程度的觀察

Fig 3 Observed renal tissue fibrosis degree in sham and UUO group

A．Western blot法檢測(cè)模型組HIF- 1α及細(xì)胞周期蛋白cyclinB1及cyclinD1的表達(dá)；B.定量分析UUO 14 d后HIF- 1α的表達(dá)；B.定量分析UUO 14 d后cyclinB1/cyclinD1的比值變化(n=6)。

A．To detect the expression of HIF- 1α、cyclinB1and cyclinD1by Western blot. B. Quantitatively analysis the expression of HIF- 1α at 14 days after UUO.B. Quantitatively analysis the rate of cyclinB1/cyclinD1(n=6).

圖4 UUO模型HIF- 1α及細(xì)胞周期蛋白的表達(dá)變化

Fig 4 To detect the expression of HIF- 1α、cyclinB1and cyclinD1 in UUO model

3 討 論

腎間質(zhì)纖維化以大量細(xì)胞外基質(zhì)過度沉積為特點(diǎn)[6]，研究表明，慢性缺氧是發(fā)展到終末期腎病的最終共同通路，并且，慢性缺氧可以通過調(diào)節(jié)促纖維化基因的表達(dá)、刺激成纖維細(xì)胞增殖、促進(jìn)上皮細(xì)胞發(fā)生上皮細(xì)胞轉(zhuǎn)分化、促進(jìn)能量代謝障礙，炎癥及免疫應(yīng)答加速腎臟纖維化的發(fā)生[7]。近年研究發(fā)現(xiàn)，細(xì)胞周期阻滯是腎臟纖維化發(fā)生的重要病因之一[8- 11]，也越來越引起研究者的關(guān)注，但是目前還很少有研究關(guān)注缺氧所致腎臟纖維化是否與細(xì)胞周期阻滯相關(guān)。參照文獻(xiàn)我們通過1%氧濃度的缺氧孵箱建立細(xì)胞缺氧模型，通過單側(cè)輸尿管結(jié)扎建立梗阻性腎損傷腎間質(zhì)纖維化模型，本研究HE、masson染色及Western blot檢測(cè)低氧標(biāo)記分子HIF- 1α，均提示缺氧性腎間質(zhì)纖維化模型制備成功。

我們通過Western blot檢測(cè)缺氧后COL4A1及α- SMA的表達(dá)。腎間質(zhì)中膠原含量被人們廣泛地用于評(píng)估纖維化嚴(yán)重程度，如CollagenⅠ、CollagenⅢ、CollagenⅣ及Collagen4A1等。肌成纖維細(xì)胞激活后可以產(chǎn)生大量膠原，是腎臟纖維化發(fā)生的重要機(jī)制之一，α- SMA是肌成纖維細(xì)胞的標(biāo)記物，作為評(píng)估腎纖維化的另一重要細(xì)胞因子[12]，因此，本實(shí)驗(yàn)選用COL4A1及α- SMA作為評(píng)估腎纖維化的重要細(xì)胞因子。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，與常氧組比較，缺氧組細(xì)胞COL4A1及α- SMA在缺氧后的腎臟高表達(dá)。與假手術(shù)組比較，模型組高表達(dá)α- SMA且主要分布于間質(zhì)中。

細(xì)胞周期是進(jìn)入增殖的細(xì)胞，通過一系列有序的事件最終實(shí)現(xiàn)細(xì)胞分裂，產(chǎn)生兩個(gè)子細(xì)胞的過程，可以分為分裂期和間期，間期又包括G1期、S期和G2期。細(xì)胞能否順利完成增殖過程與細(xì)胞能否順利的從上一個(gè)階段進(jìn)入下一個(gè)階段密切相關(guān)，這些過程受到嚴(yán)密的調(diào)控[13]。我們通過流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)HK2細(xì)胞缺氧48 hrs之后G2/M期細(xì)胞比例，研究發(fā)現(xiàn)，與常氧組比較，缺氧組細(xì)胞G2/M期細(xì)胞比例顯著增加，提示腎小管上皮細(xì)胞G2/M期阻滯可能參與缺氧誘導(dǎo)的腎間質(zhì)纖維化的發(fā)生。有研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)急性短暫缺氧時(shí)，誘發(fā)的腎損傷可以通過小管上皮細(xì)胞去分化、增生得到修復(fù)使腎功能恢復(fù)，然而，長期慢性缺氧通常使得小管發(fā)生異常修復(fù)過程，損傷的小管上皮細(xì)胞大量阻滯在G2/M期，未能順利進(jìn)入下一階段，阻滯的細(xì)胞刺激纖維化因子TGF- β，CTGF及膠原大量產(chǎn)生，最終導(dǎo)致腎間質(zhì)纖維化[14]。

細(xì)胞周期蛋白及細(xì)胞周期蛋白依賴性蛋白激酶在保證細(xì)胞周期有序進(jìn)展中發(fā)揮著至關(guān)重要的作用，細(xì)胞周期蛋白隨著細(xì)胞周期變化周而復(fù)始的出現(xiàn)和消失，使得蛋白激酶的活性發(fā)生周期性變化[15- 16]。其中，細(xì)胞周期蛋白cyclinB1主要在G2期合成，M晚期降解，cyclinD1主要在G1期合成，離開G1期時(shí)降解，cyclinB1與cyclinD1的比值是G2/M期的標(biāo)記物[11]，因此，本實(shí)驗(yàn)通過檢測(cè)梗阻性腎損傷腎間質(zhì)纖維化模型cyclinB1/cyclinD1的比值發(fā)現(xiàn)，與假手術(shù)組比較，模型組cyclinB1/cyclinD1的比值顯著升高，驗(yàn)證了腎小管上皮細(xì)胞G2/M期阻滯參與了缺氧誘導(dǎo)的腎間質(zhì)纖維化。

綜上所述，缺氧能通過腎小管上皮細(xì)胞G2/M期阻滯參與腎間質(zhì)纖維化。

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(編輯：孫茂民)

Effect of G2/M phase arrest in renal tubular epithelial cells on hypoxia- induced renal interstitial fibrosis

LIU Ting1，DANG Yang- jie2，LIU Li- min1，ZHANG Lei1，F(xiàn)U Ai- ping1，ZHANG Yu- ming1， WU Di3，DU Rui4，SUN Shi- ren1

(1.StateKeyLaboratoryofCancerBiology,DepartmentofNephrology,XijingHospital,FourthMilitaryMedicalUniversity,Xi’an710032,China;2.StateKeyLaboratoryofMilitaryStomatology&NationalClinicalResearchCenterforOralDiseases&ShaanxiEngineeringResearchCenterforDentalMaterialsandAdvancedManufacture,DepartmentofAnesthesiology,SchoolofStomatology,TheFourthMilitaryMedicalUniversity,Xi’an710032,China; 3.CadetBrigade,FourthMilitaryMedicalUniversity,Xi’an710032,China; 4.DepartmentofRadiationOncology,NavyGeneralHospital,Beijing,100048,China)

Objective: To investigate the effect of G2/M phase arrest in renal tubular epithelial cells on hypoxia- induced renal interstitial fibrosis．Methods:Invitro, HK2 cells were subjected to hypoxia(1%O2) or normoxia(21%O2) for 24 and 48 hrs. We examined the cell cycle distribution of HK2 cells by flow cytometry, the expression of COL4A1 and α- SMA was detected by Western blot 48 hrs after hypoxia;We observed the pathological changes and renal tissue fibrosis degree by HE and Masson staining. The expression of α- SMA was detected by immunohistochemical staining in UUO model. Then we tested the protein level of HIF- 1α, cyclinB1and cyclinD1 by Western blot in UUO model. Results: Compared with normoxia group, hypoxia group showed a significant increase in the percentage of G2/M stage in HK2 cells(P<0.05). Hypoxia induced a significant increase of α- SMA and COL4A1 in protein level(P<0.05); Compared with the sham group, HE and Masson staining revealed the increased degree of renal tissue fibrosis and increased expression of α- SMA that was mainly expressed in interstitial; HIF- 1α and G2/M phase marker cyclinB1/cyclinD1 was increased in UUO model by Western blot. Conclusion: Chronic hypoxia induced renal interstitial fibrosis is associated with G2/M arrest in renal tubular epithelial cells.

hypoxia; G2/M arrest; renal tubular epithelial cell；renal interstitial fibrosis

2016- 11- 08

2017- 02- 22

國家自然科學(xué)基金面上項(xiàng)目(NO.81370789)

劉婷(1990-)，女，漢族，陜西楊凌示范區(qū)人，在讀碩士研究生，腎臟內(nèi)科，研究方向：腎臟纖維化。E- mail：408634060@qq.com

孫世仁 E- Mail:sunshiren@medmail.com.cn

劉婷,黨楊杰，劉利敏，等.腎小管上皮細(xì)胞G2- M期阻滯在缺氧誘導(dǎo)的腎間質(zhì)纖維化中的作用[J].東南大學(xué)學(xué)報(bào)：醫(yī)學(xué)版，2017，36(2):240- 245.

R692.2

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1671- 6264(2017)02- 0240- 06

10.3969/j.issn.1671- 6264.2017.02.022