用于逆轉(zhuǎn)卵巢癌耐藥的HMSN復(fù)合載藥系統(tǒng)的研究

郭欣，蔡云朗，任慕蘭

(1.東南大學(xué) 醫(yī)學(xué)院，江蘇 南京 210009； 2.東南大學(xué)附屬中大醫(yī)院 婦產(chǎn)科，江蘇 南京 210009)

·論 著·

用于逆轉(zhuǎn)卵巢癌耐藥的HMSN復(fù)合載藥系統(tǒng)的研究

郭欣1，蔡云朗2，任慕蘭2

(1.東南大學(xué) 醫(yī)學(xué)院，江蘇 南京 210009； 2.東南大學(xué)附屬中大醫(yī)院 婦產(chǎn)科，江蘇 南京 210009)

目的：構(gòu)建介孔二氧化硅(HMSN)復(fù)合載藥系統(tǒng)，探究該系統(tǒng)對卵巢癌耐藥細(xì)胞株SKOV- 3/ADR耐藥的逆轉(zhuǎn)作用。方法：在HMSN表面修飾羧基，通過機械攪拌和靜電吸引的作用包載ADR和熒光NVP；采用Zeta電位、透射電鏡等方法對此系統(tǒng)進(jìn)行表征，并測定此系統(tǒng)的包封率和載藥量以及在不同pH值環(huán)境中的藥物釋放率；再將實驗分為兩組，即HMSN- COOH@ADR熒光NVP組和游離ADR熒光NVP組，采用熒光共聚焦觀察不同時間點HMSN復(fù)合載藥系統(tǒng)在胞內(nèi)的蓄積情況；利用MTT法檢測細(xì)胞在兩組作用24 h后的抑制率，同時通過流式細(xì)胞分析儀檢測兩組的凋亡率。結(jié)果：Zeta電位表明HMSN在修飾羧基之前其所帶電荷約為-20 mV，在修飾羧基后HMSN所帶電荷增加至約-40 mV；通過透射電鏡表明此載藥系統(tǒng)在包載藥物前后的形態(tài)和粒徑均未發(fā)生明顯改變；測定HMSN復(fù)合載藥系統(tǒng)中ADR的包封率為45%，載藥量為7.5%，熒光NVP的包封率為30%，載藥量為1.4%。HMSN復(fù)合載藥系統(tǒng)的藥物釋放率隨著環(huán)境pH值的降低而逐漸升高，具有顯著的pH敏感性，實現(xiàn)了以HMSN所處環(huán)境的pH值為“開關(guān)”調(diào)控藥物的釋放，有效地減少了復(fù)合載藥系統(tǒng)在胞外的非特異性釋放；通過熒光共聚焦觀察發(fā)現(xiàn)HMSN復(fù)合載藥系統(tǒng)作用細(xì)胞1 h后，其在胞內(nèi)的蓄積量即可明顯增加，隨著作用時間的延長胞內(nèi)的熒光強度也在逐漸增強；藥物作用相同的時間，HMSN- COOH@ADR熒光NVP組較游離ADR熒光NVP組的MTT細(xì)胞抑制率和細(xì)胞凋亡率均明顯提高(P<0.05)，對細(xì)胞的毒性作用明顯增強。結(jié)論：構(gòu)建的HMSN- COOH@ADR熒光NVP的復(fù)合載藥系統(tǒng)可以有效逆轉(zhuǎn)卵巢癌耐藥細(xì)胞株SKOV- 3/ADR的耐藥性，其逆轉(zhuǎn)耐藥的機制是通過非特異性的內(nèi)吞途徑攜帶復(fù)合載藥系統(tǒng)進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)，逃避了P- gp等ABC運載蛋白超家族的識別和外排作用。

卵巢癌； 多藥耐藥； 介孔二氧化硅； NVP- AEW541

近10年來世界各國腫瘤的發(fā)病率提高了近1倍，惡性腫瘤的死亡人數(shù)增長了約45%，其中卵巢癌作為女性生殖系統(tǒng)常見的惡性腫瘤一直是腫瘤防治的研究熱點?，F(xiàn)臨床應(yīng)用于卵巢癌的化療藥物較多，最常采用的是紫杉醇配伍鉑類藥物。隨著科研技術(shù)的發(fā)展，新型的化療藥物也在不斷研發(fā)，但卵巢癌患者的5年生存率仍然僅有35%左右，預(yù)后極差[1]。研究發(fā)現(xiàn)，卵巢癌患者化療失敗和死亡的一個重要原因是腫瘤多藥耐藥[2]，多藥耐藥的發(fā)生機制多是因為患者長期接觸某一種類的化療藥物，對此種藥物產(chǎn)生耐受，并對其他結(jié)構(gòu)和功能不同的化療藥物也產(chǎn)生耐藥性?，F(xiàn)發(fā)現(xiàn)的腫瘤細(xì)胞產(chǎn)生多藥耐藥的原因較多，如激素受體的減少或缺失、DNA損傷修復(fù)能力的增強、細(xì)胞膜水平上的藥物轉(zhuǎn)運和攝取障礙及藥物的分布改變等。其中，ABC(ATP- binding cassette)運輸?shù)鞍壮易宓母弑磉_(dá)是產(chǎn)生腫瘤多藥耐藥的主要原因，作為ATP依賴性的藥物泵，可利用ATP水解產(chǎn)生的能量將進(jìn)入腫瘤細(xì)胞內(nèi)的藥物泵出，使蓄積在細(xì)胞內(nèi)的化療藥物減少，從而產(chǎn)生耐藥[3]。P- gp是屬于ABC運輸?shù)鞍壮易宓氖紫仍谀[瘤細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)的單鏈跨膜糖蛋白，不同起源的耐藥細(xì)胞均可表達(dá)P- gp，表達(dá)量與腫瘤細(xì)胞的耐藥程度相關(guān)[4]。

為逆轉(zhuǎn)腫瘤細(xì)胞的多藥耐藥，現(xiàn)已提出的措施有免疫治療、基因治療、細(xì)胞因子和多藥耐藥逆轉(zhuǎn)劑等。但相對于腫瘤多藥耐藥機制的復(fù)雜性與多重性，這些措施的單一性使臨床效果一直欠佳，所以目前對逆轉(zhuǎn)腫瘤細(xì)胞的多藥耐藥依然是腫瘤治療的難點。

隨著人們對微觀世界研究的深入，納米醫(yī)學(xué)逐漸走入人們的視野，將納米技術(shù)應(yīng)用于腫瘤的防治已成為目前腫瘤研究的熱點。將化療藥物負(fù)載于納米材料中構(gòu)建納米載藥系統(tǒng)作用于腫瘤細(xì)胞，同時可聯(lián)合逆轉(zhuǎn)劑或單克隆抗體等不同作用機制的藥物，在微觀上達(dá)到協(xié)同增敏、逆轉(zhuǎn)多藥耐藥的效果[5]。納米微載體可利用腫瘤組織的增強滲透和保留效應(yīng)，即EPR效應(yīng)，發(fā)揮被動靶向作用[6]，在EPR效應(yīng)的基礎(chǔ)上將葉酸、轉(zhuǎn)鐵蛋白或受體的特異性抗體修飾在納米微載體表面，使微載體可以主動靶向腫瘤組織，更好地實現(xiàn)化療藥物在腫瘤組織的富集[7]。在達(dá)到定向富集效果的同時為微載體設(shè)計開關(guān)，如利用其所處環(huán)境的pH值、溫度等理化性質(zhì)的改變調(diào)控藥物釋放、提高藥物療效、降低藥物的毒副作用。

本次實驗我們欲探究利用介孔二氧化硅(hollow mesoporous silica nanoparticles， HMSN，50 nm)為微載體的負(fù)載阿霉素(ADR)和NVP- AEW541的復(fù)合載藥系統(tǒng)，逆轉(zhuǎn)人卵巢癌細(xì)胞株SKOV- 3/ADR的耐藥性的可行性及其相關(guān)機制。NVP- AEW541是一種吡咯并嘧啶的衍生物，為胰島素樣生長因子1受體(insulin- like growth factor receptor, IGF- 1R)特異性的抑制劑，IGF- 1R是IGF信號軸的重要組成部分。IGF信號軸的激活可活化多條信號通路，主要是高度保守的PI3K/AKT信號通路[8]。PI3K/AKT過度激活時抗凋亡蛋白Bcl- xl表達(dá)量增加，Bax促凋亡蛋白表達(dá)降低，抑制化療藥物誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，使細(xì)胞對p- gp相關(guān)和不相關(guān)的藥物敏感性降低，NVP可抑制PI3K/AKT信號通路的激活，阻斷胞內(nèi)信號傳導(dǎo)，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡，增強腫瘤細(xì)胞對化療藥物的敏感性。同時SKOV- 3/ADR高表達(dá)IGF- 1R，負(fù)載NVP的HMSN可以主動親和此細(xì)胞株[9]，起到主動靶向作用。血液循環(huán)系統(tǒng)為中性環(huán)境，腫瘤組織局部的pH值為6.5～6，腫瘤細(xì)胞內(nèi)的pH值降至4.5～4，因此HMSN復(fù)合載藥系統(tǒng)在富集的過程中其所處環(huán)境的pH值也在逐漸減低。本次我們設(shè)計pH敏感性開關(guān)，在HMSN表面修飾羧基使其所帶的負(fù)電荷升高，但隨著pH值的降低，羧基發(fā)生電荷反轉(zhuǎn)質(zhì)子化而帶正電，實現(xiàn)MNSN復(fù)合載藥系統(tǒng)負(fù)載藥物的定向釋放。

1 材料與方法

1.1 主要試劑與材料

HMSN購自安徽鑫磊粉體科技有限公司，ADR、熒光NVP及人卵巢癌細(xì)胞SKOV- 3/ADR購自南京凱基生物公司。

1.2 構(gòu)建HMSN復(fù)合載藥系統(tǒng)

1.2.1 在HMSN表面修飾羧基 將10 mg HMSN分散在無水乙醇中，超聲振蕩10 min，加熱至80 ℃，加入N- (三甲氧基硅丙基)乙二胺三乙酸鈉鹽100 μl在充分冷凝回流下磁力攪拌24 h，待體系冷卻至室溫離心分離，分別用乙醇和去離子水反復(fù)離心洗滌3遍即得到表面被- COOH修飾的HMSN。

1.2.2 Zeta電位檢測 PBS懸浮混勻獲得HMSN- COOH，將混合溶液加入樣品池中，操作條件為11.4 V·cm-1、13.0 mA、25 ℃。

1.2.3 HMSN- COOH包載ADR和熒光NVP 稱取2 mg的ADR溶解于PBS中，調(diào)定PBS的pH值為7.40，將獲得的HMSN- COOH均勻分散在此PBS中并定容到10 ml。磁力攪拌過夜后離心，收取上清液并分離HMSN- COOH@ADR，PBS沖洗獲得的HMSN- COOH@ADR。精確稱取0.5 mg熒光NVP分散于pH值為8的PBS中并以此重懸HMSN- COOH@ADR，同時定容至10 ml，磁力攪拌24 h后離心收取HMSN- COOH@ADR熒光NVP并保留上清液，將HMSN- COOH@ADR熒光NVP分散在PBS中并定容至10 ml，4 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.4 ADR和熒光NVP包封率和載藥量的測定 采用pH值為7.40的PBS配置500 μg·ml-1的ADR母液，稀釋為400、300、200、100、50 μg·ml-1的工作液，480 nm波長檢測上述工作液的吸光度，PBS為空白對照，以吸光度(Y)對鹽酸阿霉素濃度(X)進(jìn)行線性回歸并得到回歸方程。檢測1.2.3包載ADR后上清液的OD值，根據(jù)回歸方程計算ADR的包封率和載藥量。DMSO配置濃度為500 μg·ml-1的熒光NVP母液，稀釋的工作液濃度為100、80、60、40、20、10 μg·ml-1。DMSO為空白對照，以吸光度(Y)對熒光NVP(X)進(jìn)行線性回歸并得到回歸方程。將1.2.3中包載熒光NVP后上清液真空烘干后溶于DMSO，測其OD值，代入回歸方程計算熒光NVP的包封率和載藥量。包封率=包入HMSN中的藥量/投藥總量；載藥量=包入HMSN中的藥量/總質(zhì)量(載體+包裹藥物)。

1.2.5 不同pH值條件下ADR和熒光NVP的釋放率 分別配置pH值為7.4、6.5、5.5、4.5的PBS，并分別將1 mg的 HMSN- COOH@ADR均勻地分散在其中，每間隔10 h檢測各組上清液的OD值,檢測至120 h。同樣，分別將1 mg的HMSN- COOH@熒光NVP分散在上述不同pH值的PBS中，每間隔10 h取各組上清液，真空烘干后溶于DMSO中再檢測各組的OD值，檢測至50 h。實驗重復(fù)3次取均值，計算ADR和熒光NVP的釋放率。

1.2.6 透射電鏡表征 利用透射電鏡對HMSN和HMSN- COOH@ADR熒光NVP進(jìn)行表征，觀察HMSN在負(fù)載藥物后其形態(tài)和粒徑是否發(fā)生變化。

1.3 體外細(xì)胞實驗

1.3.1 細(xì)胞培養(yǎng) 本實驗室常規(guī)培養(yǎng)人卵巢癌細(xì)胞株SKOV- 3/ADR， 4～5 d傳代1次。

1.3.2 共聚焦觀察在細(xì)胞內(nèi)的聚集 調(diào)整細(xì)胞濃度為5×105個·ml-1，接種于小皿中培養(yǎng)過夜，加入100 μl的HMSN- COOH@ADR熒光NVP分別在作用1、2 h后棄去培養(yǎng)基，PBS沖洗2遍，上機觀察此復(fù)合載藥系統(tǒng)在胞內(nèi)的聚集情況。

1.3.3 MTT檢測細(xì)胞抑制率 消化細(xì)胞并調(diào)整細(xì)胞濃度為5×104個·ml-1，96孔板上接種細(xì)胞，每孔100 μl。培養(yǎng)箱中培養(yǎng)過夜，加入100 μl的HMSN- COOH@ADR熒光NVP，即HMSN- COOH@ADR熒光NVP組，對照組加入與HMSN- COOH@ADR熒光NVP組包載相同ADR和熒光NVP的游離ADR和熒光NVP，即游離ADR熒光NVP組，同時設(shè)置空白對照組。再置入培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后進(jìn)行MTT染色，λ=490 nm，測定OD值。

1.3.4 檢查兩組細(xì)胞的凋亡率 將細(xì)胞接種于6孔板中，待細(xì)胞貼壁后按1.3.3中的方法分組，置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12 h。胰酶消化收集5×105個細(xì)胞，Binding Buffer懸浮細(xì)胞，加入5 μl Annexin Ⅴ- FITC混勻后加入5 μl Propidium Iodide，混勻。室溫、避光反應(yīng)5～15 min，流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡情況。

2 結(jié) 果

2.1 Zeta電位檢測

分別檢測HMSN和HMSN- COOH的Zeta電位，在HMSN表面修飾羧基后其所帶電荷由原來的-22.3 mV增長至-44.9 mV(圖1)。HMSN- COOH所帶負(fù)電荷的升高增強了其與帶正電荷的ADR和熒光NVP間的靜電吸引力，有利于藥物的包載。

A.HMSN修飾羧基前；B.HMSN修飾羧基后

圖1 HMSN修飾羧基前后的Zeta電位

2.2 ADR和熒光NVP的包封率和載藥量

根據(jù)不同濃度ADR工作液對應(yīng)的OD值，得到ADR和OD值間的回歸方程Y=0.033X(μg·ml-1)+0.015R2=0.997，由此得到ADR的包封率為45%，載藥量為7.5%；同理，得到熒光NVP和OD值間的回歸方程Y=0.058X(μg·ml-1)+0.012R2=0.995，熒光NVP的包封率約為30%，載藥量為1.4%。

2.3 不同pH值環(huán)境中HMSN復(fù)合載藥系統(tǒng)中ADR和熒光NVP的釋放率

ADR和NVP兩者在酸性環(huán)境中比在堿性環(huán)境和中性環(huán)境有較高的釋放率，在堿性和中性環(huán)境中ADR和熒光NVP基本無法從HMSN中釋放出來，但隨著pH值的降低，兩者的釋放率明顯提高(P<0.05)，具有顯著的pH敏感性(圖2)。

A.ADR的釋放率；B.熒光NVP的釋放率

圖2 不同的pH值環(huán)境中HMSN復(fù)合載藥系統(tǒng)中ADR和熒光NVP的釋放率

2.4 透射電鏡表征

HMSN在負(fù)載藥物前后透射電鏡下顯示其形態(tài)仍保持為球形，粒徑仍約為50 nm(圖3)。

A.HMSN負(fù)載藥物前 ×15萬；B.HMSN負(fù)載藥物后 ×20萬

圖3 HMSN在包載ADR和熒光NVP前后的粒徑和形態(tài)均未發(fā)生改變

2.5 熒光共聚焦觀察HMSN復(fù)合載藥系統(tǒng)在胞內(nèi)的聚集情況

通過熒光共聚焦可以看出，隨著時間的延長HMSN復(fù)合載藥系統(tǒng)在胞內(nèi)的聚集量逐漸增加，并可滲透進(jìn)入胞核(圖4)。

2.6 MTT檢測細(xì)胞抑制率

在作用相同的時間后，HMSN- COOH@ADR熒光NVP組較游離ADR熒光NVP組表現(xiàn)出較高的抑制率(P<0.05)(表1)。HMSN- COOH@ADR熒光NVP可逆轉(zhuǎn)耐藥，提高ADR對SKOV- 3/ADR的殺傷率。

2.7 流式檢測兩組細(xì)胞的凋亡率

藥物作用相同的時間，HMSN- COOH@ADR熒光NVP組較游離ADR熒光NVP組表現(xiàn)出更高的凋亡率，P<0.05(圖5)。

3 討 論

本次實驗通過構(gòu)建HMSN復(fù)合載藥系統(tǒng)作用于SKOV- 3/ADR細(xì)胞株，并采用MTT檢測細(xì)胞抑制率及流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡率等方法初步證實了構(gòu)建的HMSN- COOH@ADR熒光NVP較游離的ADR熒光NVP可明顯提高對細(xì)胞的毒性作用，逆轉(zhuǎn)多藥耐藥。游離ADR主要通過被動擴散的方式進(jìn)入細(xì)胞，并可較快地進(jìn)入胞核，但如同SKOV- 3/ADR的耐藥細(xì)胞的細(xì)胞膜上存在的ABC運輸?shù)鞍卓梢詫麅?nèi)的ADR泵出胞外，明顯減弱了化療效果，易產(chǎn)生細(xì)胞的多藥耐藥性。粒徑為50 nm的HMSN復(fù)合載藥系統(tǒng)，不同于游離ADR可以有效地避免ABC轉(zhuǎn)運蛋白的外排作用，使得藥物可以較長時間地蓄積在胞內(nèi)，逆轉(zhuǎn)腫瘤細(xì)胞耐藥。

A.1 h ×500；B.2 h ×500

圖4 HMSN復(fù)合載藥系統(tǒng)不同時間點在SKOV- 3/ADR細(xì)胞內(nèi)的聚集情況

表1 兩組細(xì)胞的MTT抑制率

組 別OD±SD抑制率/%HMSN?COOH@ADR熒光NVP組0．203±0．01480．19±1．18a游離ADR熒光NVP組0．392±0．01051．50±2．04

a與游離ADR熒光NVP組相比，P<0.05

粒徑小于200 nm的HMSN復(fù)合載藥系統(tǒng)主要通過網(wǎng)格蛋白調(diào)節(jié)的非特異性的內(nèi)吞途徑進(jìn)入細(xì)胞，然后依次進(jìn)入包涵體和溶酶體等[10]，在此過程中HMSN復(fù)合載藥系統(tǒng)所處環(huán)境的pH值也在逐漸降低，在HMSN表面修飾的羧基在此過程中會發(fā)生電荷反轉(zhuǎn)，質(zhì)子化而帶正電，與ADR和熒光NVP間的靜電吸引轉(zhuǎn)為靜電排斥，促使HMSN包載的藥物可以較為完全且快速地釋放在胞內(nèi)[11]。通過熒光共聚焦觀察發(fā)現(xiàn)，HMSN復(fù)合載藥系統(tǒng)在胞內(nèi)蓄積1 h后其本身及釋放的ADR可進(jìn)入細(xì)胞核殺傷腫瘤細(xì)胞。本次設(shè)計的藥物釋放開關(guān)盡量減少了藥物在胞外的釋放，這種“特洛伊木馬”式的藥物釋放途徑極力避免了納米粒被攝取前的非特異性藥物泄露，在逆轉(zhuǎn)腫瘤細(xì)胞耐藥的同時還會有效減少化療藥物的毒副作用[12]。

A.HMSN- COOH@ADR熒光NVP組；B.游離ADR熒光NVP組

圖5 HMSN復(fù)合載藥系統(tǒng)組和游離ADR熒光NVP組在作用SKOV- 3/ADR 12 h后流式細(xì)胞儀檢查兩組細(xì)胞的凋亡率

本次實驗在HMSN中包載的NVP可阻斷IGF信號軸，抑制PI3K/AKT通路活化，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡，將腫瘤細(xì)胞阻滯在G2/M期并增強阿霉素的化療效果。NVP的水溶性較差，明顯影響其作用的發(fā)揮，將NVP負(fù)載至HMSN帶入細(xì)胞，即相當(dāng)于提高了NVP的溶解性，同時卵巢癌細(xì)胞高表達(dá)IGF- 1R，使得HMSN復(fù)合載藥系統(tǒng)可以主動地親和腫瘤細(xì)胞，更為有效地逆轉(zhuǎn)耐藥[13]，為之后的動物實驗在EPR效應(yīng)的被動靶向的基礎(chǔ)上提供主動靶向的方法。

綜上所述，本次構(gòu)建的HMSN- COOH@ADR熒光NVP可有效地避免被耐藥細(xì)胞膜上的ABC轉(zhuǎn)運蛋白泵出胞外，逆轉(zhuǎn)耐藥，同時HMSN復(fù)合載藥系統(tǒng)的藥物釋放“開關(guān)”可減少化療藥物的副作用。本次實驗只是HMSN復(fù)合載藥系統(tǒng)逆轉(zhuǎn)耐藥的體外部分，體內(nèi)環(huán)境復(fù)雜，影響因素較多，體外實驗不能代替在體實驗效果，因此，我們尚需進(jìn)行HMSN復(fù)合載藥系統(tǒng)逆轉(zhuǎn)多藥耐藥的體內(nèi)實驗，以證實此納米載藥系統(tǒng)的作用。

[1] CRAVEIRO V,YANG- HARTWICH Y,HOLMBERG J C,et al.Phenotypic modifications in ovarian cancer stem cells following Paclitaxel treatment[J].Cancer Med,2013,2(6):751- 762.

[2] TOMONO T,KAJITA M,YANO K,et al.,Adenovirus vector infection of non- small- cell lung cancer cells is a trigger for multi- drug resistance mediated by P- glycoprotein[J].Biochem Biophys Res Commun,2016,476(4):183- 187.

[3] WU Q,YANG Z,NIE Y,et al.,Multi- drug resistance in cancer chemotherapeutics:mechanisms and lab approaches[J].

Cancer Lett,2014,347(2):159- 166.

[4] LI W,ZHANG H,ASSARAF Y G,et al.Overcoming ABC transporter- mediated multidrug resistance:molecular mechanisms and novel therapeutic drug strategies[J].Drug Resistance Updates,2016,27:14- 29.

[5] JUN Y W,LEE J HCHEON J,Chemical design of nanoparticle probes for high- performance magnetic resonance imaging[J].Angew Chem Int Ed Engl,2008,47(28):5122- 5135.

[6] TANG C,RUSSELL P J,MARTINIELLO- WILKS R,et al.,Concise review:Nanoparticles and cellular carriers- allies in cancer imaging and cellular gene therapy?[J].Stem Cells,2010,28(9):1686- 1702.

[7] 蔡陽,朱傳東,鄭勤.金納米在腫瘤治療中的應(yīng)用[J].現(xiàn)代醫(yī)學(xué),2016,44(6):893- 896.

[8] DOUGLAS J B,SILVERMAN D T,POLLAK M N,et al.Serum IGF- I,IGF- II,IGFBP- 3,and IGF- I/IGFBP- 3 molar ratio and risk of pancreatic cancer in the prostate,lung,colorectal,and ovarian cancer screening trial[J].Cancer Epidemiol Biomarkers Prev,2010,19(9):2298- 2306.

[9] JIN M,BUCK EMULVIHILL M J.Modulation of insulin- like growth factor- 1 receptor and its signaling network for the treatment of cancer:current status and future perspectives[J].Oncol Rev,2013,7(1):e3.

[10] PANYAM J,LABHASETWAR V.Biodegradable nanoparticles for drug and gene delivery to cells and tissue[J].Advanced Drug Delivery Reviews,2012,64:61- 71.

[11] LEE E S,GAO ZBAE Y H.Recent progress in tumor pH targeting nanotechnology[J].J Control Release,2008,132(3):164- 170.

[12] HUANG Y,JIANG Y,WANG H,et al.Curb challenges of the “Trojan Horse” approach:smart strategies in achieving effective yet safe cell- penetrating peptide- based drug delivery[J].Adv Drug Deliv Rev,2013,65(10):1299- 1315.

[13] VANAMALA J,REDDIVARI L,RADHAKRISHNAN S,et al.Resveratrol suppresses IGF- 1 induced human colon cancer cell proliferation and elevates apoptosis via suppression of IGF- 1R/Wnt and activation of p53 signaling pathways[J].BMC Cancer,2010,10:238.

(本文編輯：周蘭波)

The study of HMSN compound drug delivery system for reversing ovarian cancer drug resistance

GUO Xin1,CAI Yun- lang2,REN Mu- lan2

(1.TheMedicalSchool,SoutheastUniversity,Nanjing210009,China; 2.DepartmentofGynaecologyandObstetrics,ZhongdaHospital,SoutheastUniversity,Nanjing210009,China)

Objective:To develop a co- delivery system based on hollow mesoporous silica nanoparticles(HMSN), and explore the effect of this system in reversing multiple drug resistance in ovarian cancer cell SKOV- 3/ADR. Methods: HMSN was selected as the nanocarriers, with- COOH modified on the surface and ADR, NVP- AEW541 loaded inside. Then this system was characterized by Zeta potential, TEM and other methods, and the entrapment efficiency, drug loading rate, drug release rate in different pH environment were detected; Experiment was carried out in two groups, HMSN- COOH@ADR fluorescent NVP and free ADR fluorescent NVP group, gathering of the co- delivery system in cells and nucleus was observed by LSCM at different time points; Cells apoptosis and MTT cell inhibition rate were also detected after 24 hours in each group. Results: Zeta potential showed that the charge of HMSN was about -20 mV before modified carboxyl, and rised to -40 mV after modified carboxyl; The size and shape of HMSN were not changed after loading drugs by TEM; The entrapment efficiency was 45% of ADR and 30% of fluorescent NVP, drug loading rate was 7.5% of ADR and 1.4% of fluorescent NVP; The drugs release rate could be significantly improved as the pH value decreased, so the pH value was used as a “switch” which could effectively reduce extracellular nonspecific drug release. The intracellular quantity of HMSN drug delivery system was increased after one hour, and enhanced gradually with time extension. After the same time, the cell apoptosis rate and MTT inhibition rate of HMSN- COOH@ADR fluorescence NVP group were both higher than that of free ADR fluorescent group (P<0.05), indicated the increased cytotoxicity on cells. Conclusion: This HMSN drug delivery system can enter into cells mainly through nonspecific endocytosis, effectively reverse multidrug resistance of ovarian cancer cell SKOV- 3/ADR,thus avoide the identification and efflux effect of P- gp.

ovarian cancer; multidrug resistance; hollow mesoporous silica nanoparticles; NVP- AEW541

2016- 08- 15

2016- 12- 08

郭欣(1991-)，女，山東聊城人，在讀碩士研究生。E- mail:15905172950@163.com

蔡云朗 E- mail:ylseu63@sohu.com

郭欣,蔡云朗,任慕蘭.用于逆轉(zhuǎn)卵巢癌耐藥的HMSN復(fù)合載藥系統(tǒng)的研究[J].東南大學(xué)學(xué)報:醫(yī)學(xué)版,2017,36(2):148- 154.

R737.31

A

1671- 6264(2017)02- 0148- 07

10.3969/j.issn.1671- 6264.2017.02.004